Name: Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 58 s
Description: 学ぶTol2トランスポゾン系を用いた人工miRNAトランスジェニック発現によるニワトリ胚網膜での遺伝子機能喪失アプローチ。安定した標的遺伝子抑制により網膜発生の研究が可能となる。

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pT2K-CAGGSおよびpCAGGS-T2TPベクターは、それぞれ高橋佳子(京都大学、京都)および川上浩一(国立遺伝学研究所、三島)から提供された。原稿を批判的に読んでくれたマイケル・ベルベログルに感謝します。この研究は、王立協会およびバイオテクノロジーおよび生物科学研究評議会(BBSRC)(英国)からM.N.への助成金によってサポートされました。

1. miRNA発現ベクターの構築
注:miRNA発現ベクターを構築するための手順(ステップ1.1-1.3、1.5-1.6)は、前述のように、miRNA発現キットであるEmGFPを用いたBlock-iT Pol II miR RNA発現キット用に最適化されています15,16。このキットには、miRNA発現を可能にするように設計された発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA)、コントロールベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性コントロールプラスミド)、アクセサリー試薬、およびmiRNA発現ベクターを作製するための説明書(材料表参照)が含まれています17。
<ol><li>標的遺伝子に対するpre-miRNAをコードする一本鎖DNAオリゴの設計:オンラインツールRNAi Designer(材料表参照)を使用して、一本鎖DNAオリゴ(「トップストランド」オリゴ(ターゲットプレmiRNA)および「ボトムストランド」オリゴ(トップストランドオリゴの相補体))を設計します。一本鎖オリゴの必要な特徴(図2A)とターゲット配列の例(図2B)については、図2を参照してください。 注:特定の標的遺伝子に対して5〜10個のpre-miRNA配列を生成し、 in vitro でノックダウン活性をスクリーニングすることをお勧めします(ステップ1.4)。</li>
	<li>トップストランドとボトムストランドのオリゴをアニーリングして二本鎖オリゴを生成する<ol><li>以下のアニーリング反応(表1)を滅菌0.5 mLマイクロ遠心チューブにセットします。</li>
		<li>反応混合物を95°Cで4分間インキュベートします。トップストランドとボトムストランドのオリゴをアニールし、反応混合物を室温(RT)に5〜10分間冷却することにより、二本鎖オリゴを生成します。サンプルを短時間(~5秒)遠心分離します。 注:アニールされたオリゴは、-20°Cで少なくとも1年間は分解することなく保存できます。</li>
	</ol></li>
	<li>二本鎖オリゴをmiRNA発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA(miRNA発現キットに付属))にクローニングする:メーカーのマニュアル17に従って、個々の二本鎖オリゴを直鎖化miRNA発現ベクターにクローニングします。</li>
	<li>ノックダウン効果の評価 注:個々のmiRNA配列は、ovoに適用する前に、in vitroで遺伝子抑制効率をテストすることをお勧めします。ノックダウン効率は、miRNA発現プラスミドを標的遺伝子を発現する細胞株にトランスフェクトすることによって試験することができる。あるいは、個々のmiRNA発現プラスミドを、標的遺伝子の発現コンストラクトを有する細胞株に同時トランスフェクトすることができる。天然状態で膜固定されていないタンパク質をコードする標的遺伝子(例えば、可溶性タンパク質)については、アルカリホスファターゼ(AP)融合タンパク質を使用して、標的タンパク質の発現をモニタリングすることができる。標的タンパク質をコードするcDNA配列を、APタグベクター(APtag-1-APtag-5;材料表参照)中のヒト胎盤アルカリホスファターゼにインフレームで融合させ、細胞18に導入することができる。培養細胞(HEK293T細胞など)で発現させると、APタグ付き標的タンパク質が培養培地中に高レベルで分泌されるため、miRNA導入細胞の培地中のAP活性の低下を測定することでmiRNA配列のノックダウン効果を評価できます(サブステップ1.4.1-1.4.4)。<ol><li>細胞HEK293T 24ウェルプレート(8 x 104 細胞/ウェル)で一晩培養します。個々のmiRNA発現コンストラクトで細胞をAPタグ付き標的タンパク質の発現プラスミドで一過性にトランスフェクトします。pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA陰性コントロールプラスミド(miRNA発現キットに付属)をコントロールとして使用します。(APタグ付き標的タンパク質を安定に発現する細胞株を使用する場合は、個々のmiRNA発現コンストラクトのみで細胞をトランスフェクトします。 注:トランスフェクションには、従来のリポフェクション試薬( 材料表を参照)が使用されます。</li>
		<li>トランスフェクションの48〜72時間後に馴化培地を回収し、65°Cの水浴中で5分間、内因性AP活性を熱不活性化します。デスクトップマイクロ遠心分離機で破片を最高速度で5分間スピンアウトします。</li>
		<li>上清を10 mM HEPES、pH 7.0で緩衝し、0.45 μmフィルターに通します。</li>
		<li>100 μL(プレートリーダーでの測定用)または500 μL(分光光度計用)の上清を取り、等量の2x AP基質バッファーを追加します(表2)。プレートリーダーまたは分光光度計でOD405 を測定して、AP活性を確認します。 注:馴化培地のAP活性が高すぎて正確な測定ができない場合は、HBAHバッファー(ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、0.5 mg / mLウシ血清アルブミン、20 mM HEPES(pH 7.0))またはキャリアタンパク質を含む別のバッファーで希釈してください。リン酸含有バッファー(PBSなど)は、無機リン酸がAPの競合阻害剤として作用するため、使用しないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>miRNA配列の連鎖 注:ノックダウン効果は、同じ標的遺伝子に対して異なるmiRNAを連鎖させるか、同じmiRNAを繰り返すことによって増強することができる。miRNA発現ベクターは、複数のpre-miRNA配列の連鎖およびそれらのコシストロン発現を支持する17。<ol><li>製造業者の説明書17に従って、in vitroアッセイ(ステップ1.4)において最も高いノックダウン活性を示す2つの異なるpre-miRNA配列を(同じ標的遺伝子に対して)鎖状にする。</li>
		<li>ステップ1.4に記載される インビトロ アッセイを用いて鎖状構築物の遺伝子抑制効率を評価する。3つ以上のpre-miRNA配列が同様に高いノックダウン活性を示す場合は、2つの配列の異なる組み合わせをテストし、最も高いノックダウン活性を示す組み合わせを使用します( 代表的な結果を参照)。</li>
	</ol></li>
	<li>EmGFP-pre-miRNA発現カセットのTol2トランスポゾンベクターへの転写 注:EmGFP cDNAおよび2つのpre-miRNA配列を含む発現カセットは、Tol2トランスポゾンベクター(pT2K-CAGGSベクター、 材料表を参照)に転写されます。この目的のために、発現カセット(CMVプロモーターの3'末端からmiRNA発現ベクターのmiRNAリバースシーケンシングプライマー部位までを包含する)を人工制限酵素部位を有するプライマーを用いてPCR増幅し、PCR産物をTol2トランスポゾンベクターにクローニングする。Tol2トランスポゾンベクターには、挿入された発現カセットの発現を駆動するユビキタスCAGGSプロモーターが含まれています。CAGGSプロモーターと発現カセットは、Tol2配列によって隣接しています(図1)。<ol><li>EmGFP-pre-miRNA発現カセットのPCR増幅: 表3に記載の反応セットアップおよび熱サイクリング条件に従う。</li>
		<li>ゲル精製PCR産物(約1.3 kb)を制限酵素消化Tol2トランスポゾンベクターにリゲートします。プラスミドをコンピテント大腸菌細胞にエレクトロポレートし( 材料表を参照)、組換え体(pT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNAコンストラクト)を選択します。</li>
		<li>従来のmaxiprepキットを用いてプラスミドを調製します( 材料表参照)。プラスミドの構造と配列は、それぞれ制限マッピングとPCRに使用したプライマーを使用して確認します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.卵の貯蔵と孵化
<ol><li>地元の農場や商業業者から受精したホワイトレグホン(Gallus gallus)の卵を購入します。 注:卵は、孵卵中の生存率の大幅な損失や発育の遅延なしに、孵卵前に最大1週間、12〜16°Cまたは4°Cで保持できます。</li>
	<li>卵に孵卵の開始日をラベル付けし、卵の上側(胚が配置される場所)に印を付けます。受精卵を38°Cで水平位置でインキュベートし、胚がハンバーガーおよびハミルトン(HH)ステージ10(33-38時間)-11(40-45時間)19に達するまでインキュベートします。</li>
</ol>3. インオボ エレクトロポレーション
<ol><li>in ovo エレクトロポレーションの調製<ol><li>0.25%ファストグリーン溶液の調製:25 mgのファストグリーンFCFを10 mLのPBSに溶解します。0.2 μmシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。溶液はRTに保存できます。</li>
		<li>DNAカクテル:個々のpT2K-CAGGS-EmGFP-2x miRNAプラスミド(サブステップ1.6.3)とTol2トランスポザーゼ発現プラスミド(pCAGGS-T2TPベクター; 材料表参照)(各5 μg/μL)を2:1の比率で混合して注射液を調製します。注入された領域を視覚化するために、0.25%高速グリーン溶液の1/10ボリュームを追加します。 注:最適なDNA濃度は、コンストラクトによって異なる場合があります。</li>
		<li>マイクロインジェクション装置のセットアップ(図3A、B):マイクロインジェクション装置は、ハミルトンシリンジ、18 Gニードル(針の長さ= 2インチ)、PVC(ポリ塩化ビニル)チューブ(長さ2 cm)、マイクロピペットニードル(マイクロピペットプラーでオメガドットファイバー(外径1 mm X 内径0.75 mm)のキャピラリーチューブを引っ張ることによって作成できます)。<ol><li>ハミルトンシリンジに重質鉱油を入れます。18 Gの針をシリンジに取り付け、シリンジプランジャーを押し下げて針の内部空間をオイルで満たします。</li>
			<li>長さ2cmのPVCチューブを針の端に取り付け、チューブにオイルを充填します。</li>
			<li>引っ張ったマイクロピペット針をチューブに取り付けます。マイクロピペット針の先端を細い鉗子で直径10〜20μmに折って小さな開口部を作ります。針全体をオイルで満たします。 注意: 気泡はDNA溶液の流れを阻害するため、システム内に気泡を閉じ込めないように注意する必要があります。</li>
		</ol></li>
		<li>5 μLの着色DNAカクテル(サブステップ3.1.2)を滅菌ペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡下で、マイクロピペット針の先端を滅菌ペトリ皿上のDNA溶液に入れ、溶液をゆっくりと針に引き込みます。</li>
		<li>針の内側と外側の圧力が平衡するまで待ち(空気が針に入るのを防ぐため)、針の先端をDNA溶液から取り出します。注射まで、針の先端を小さなビーカー内の滅菌PBSに沈めたままにします。</li>
		<li>エレクトロポレーション装置のセットアップ(図3A、C):<ol><li>マイクロマニピュレーターに電極ホルダー付きの一対の白金電極をセットします。電極の先端間の間隔を2 mmに調整します(図3C、E)。</li>
			<li>電極をケーブルで方形波パルス発生器に接続します( 材料表を参照)。</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>DNA溶液のマイクロインジェクション(図3D)<ol><li>インキュベーターから鶏の卵を取り出し、70%エタノールに浸したティッシュペーパーで卵の表面を拭きます。</li>
		<li>18 Gの針を10 mLのシリンジに取り付けます。卵黄を傷つけないように、下向き(45°)の角度で卵の鈍い端に針を挿入します。</li>
		<li>卵から2〜3 mLのアルブミンを引き出します。スコッチテープで穴を塞ぎます。卵子を光で「キャンドリング」することによって、胚と硝子膜が殻から剥がれていることを確認します。</li>
		<li>はさみと鉗子を使用して卵の上から卵殻(直径2〜3 cmの円)を取り除き、胚を露出させます。エレクトロポレーション中の胚の乾燥を防ぐために、一度に5個を超える卵を窓に入れないでください。 注意: 卵を割らずに窓を開けるのが難しい場合は、卵殻を取り除く前に、卵の上部全体をセロテープまたはスコッチテープで覆うことができます。</li>
		<li>針の先端を近位側から視小胞に45°の角度で挿入し、青色の溶液が内腔を満たすまでプランジャーをゆっくりと押し下げる(または軽くたたく)ことによってDNAカクテルを注入します(図3D)。 注:あるいは、圧力マイクロインジェクションシステム( 材料表を参照)を使用してDNA溶液を注入することもできます。</li>
		<li>針を引き出し、その先端をPBSに戻します。</li>
	</ol></li>
	<li>エレクトロポレーション(図3E)<ol><li>エレクトロポレーターのパルスパラメータを次のように設定します:電圧:15 V、パルス長:50 ms、パルス間隔:950 ms、パルス数:5</li>
		<li>胚の上の硝子膜に数滴のHBSSを加えます。マイクロマニピュレーターを使用して、胚の前後軸に垂直に電極をHBSSに下げます。 注:あるいは、アルブミンは効率的なエレクトロポレーションを可能にする優れた導電体であるため、この手順はHBSSを追加せずに行うことができます。</li>
		<li>視小胞の両側(前(鼻)側と後側(側頭))に電極を配置します(図3E)。電極が胚や血管に触れないようにしてください。パルス電界を適用します。</li>
		<li>電極を取り外し、アルブミンの蓄積を避けるために、水に浸した滅菌綿棒で電極をそっと洗浄します。</li>
		<li>スコッチテープで窓を密封し、目的の発達段階まで胚を再インキュベートします。</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

このプロトコルは、 in ovo エレクトロポレーションと Tol2 トランスポゾンシステムを用いた人工 miRNA のトランスジェニック発現による、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの詳細なガイドを提供します。
この手法を正常に実行するには、次の要素が非常に重要です。まず、堅牢なノックダウン効果を発揮することが確認されているmiRNA配列を使用することが重要です。 それらをin ovo エレクトロポレーションに適用する前に、 in vitro アッセイで個々のpre-miRNA配列の遺伝子抑制効率をテストし(ステップ1.4)、最も高いノックダウン活性を示す2つのpre-miRNA配列を鎖鎖します(ステップ1.5)。第二に、DNA溶液を注入するためのマイクロピペット針を挿入するときに、視神経小胞および周囲の神経組織を損傷しないことが重要です。胚への過度の損傷は、胚の奇形や死につながる可能性があります。組織の損傷を避けるために、マイクロピペットを正しい向きで視神経小胞に導入します。マイクロピペット針の先端が小さく鋭利...

脊椎動物の網膜は、神経発生を研究するための重要なモデルシステムです。その末梢位置にもかかわらず、網膜は解剖学的および発達的に中枢神経系の延長であり、網膜神経節細胞の軸索からなる視神経は中枢神経系内の管を表す。ひよこ網膜は、神経発達の分子メカニズムを研究するためのモデルシステムとして重要な利点があります:それは大きく、急速に発達します。それは人間の網膜と構造的および機能的類似性を持っています。視覚化や実験的な操作に非常にアクセスしやすいです。神経発生中の細胞増殖・分化、形態形成、軸索誘導の分子機構は、ニワトリ網膜を用いて広く研究されている。
卵子では、エレクトロポレーションは、発生中のニワトリ胚の細胞に異所性遺伝子を導入するために過去20年間にわたって首尾よく使用されてきました。この技術により、発生中の細胞の標識、細胞運命の追跡、細胞移動および軸索路のトレース、および遺伝子機能のin vivo分析のための異所性遺伝子発現が可能になります。ニワトリ胚における効率的な異所性遺伝子発現のためのin ovoエレクトロポレーションの条件は十分に確立されている1,2,3。
これらの利点にもかかわらず、遺伝子機能の研究のための安定した機能喪失技術の欠如は、ニワトリ胚の主要な技術的限界であった。低分子干渉RNA(siRNA)4やショートヘアピンRNA(shRNA)5の発現ベクターでエレクトロポレーションしたニワトリ胚は標的遺伝子のノックダウンを示しますが、これらのアプローチでは、導入されたRNAまたはDNAを失うと細胞が効果が消失するため、遺伝子抑制は一過性です。より安定した遺伝子抑制は、RCAS(RエプリケーションCompetent Avian slicoma-leukosisウイルス(ASLV)ロングターミナルリピート(LTR)とSプライスアクセプター)レトロウイルスシステム6によってニワトリ胚にsiRNAを送達することによって達成され得る。ウイルスベクターは宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子が安定に発現します。ただし、レトロウイルスは、細胞周期の有糸分裂(M)期にのみ分裂細胞のゲノムに組み込まれるため、この機能喪失アプローチを適用できる発生段階および/または細胞型に制限が課される可能性があります。さらに、RCASによる導入遺伝子の発現は、in ovoエレクトロポレーションによって誘導されるものよりも遅く、頑健ではないようです7。
トランスポゾンは、ゲノム上のある場所から別の場所に移動する遺伝的要素です。Tol2エレメントは、hAT転移エレメントファミリーのメンバーであり、Tol2エレメント8のトランスポゾン反応を触媒するトランスポザーゼをコードする内部遺伝子を含む。Tol2エレメントの左端と右端の配列(それぞれ200 bpと150 bp)に挟まれた遺伝子発現カセットを担持したプラスミドベクターをTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトで脊椎動物細胞に導入すると、プラスミドから発現カセットが切り出され、宿主ゲノムに組み込まれ、異所性遺伝子の安定発現をサポートします(図1).Tol2転移因子は、ゼブラフィッシュ9,10、カエル11、ヒナ12、マウス13を含む異なる脊椎動物種において非常に効率的に遺伝子転位を誘導できることが示されており、したがって、遺伝子導入および挿入突然変異誘発の有用な方法である。Tol2トランスポゾン系は、長鎖二本鎖RNAからプロセシングされたsiRNAのゲノム組み込みによる標的遺伝子の条件付きノックダウンに使用されています14。
このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムによる人工マイクロRNA(miRNA)の導入を含むニワトリ胚における機能喪失アプローチを説明しています15,16。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーと標的遺伝子に対する人工miRNAの発現カセットをTol2トランスポゾンベクターにクローニングします。次いで、Tol2トランスポゾン構築物を、in ovoエレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現構築物と共に胚性ニワトリ網膜に導入する。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、主に神経系に発現する細胞外糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜でノックダウンすることに成功しました(代表的な結果を参照)。我々の結果は、この手法により、ovoにおいて安定的かつ効率的な遺伝子抑制を達成できることを示しています。

<table><tbody><tr><td>18 G ニードル、2"</td><td>VWR</td><td>89219-320</td><td></td></tr><tr><td>AP-TAG キット A および AP-TAG キット B</td><td>GenHunter Corp</td><td>Q201 および Q202</td><td>AP 融合タンパク質 (https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-a.html, https://www.genhunter.com/products/ap-tag-kit-b.html)</td></tr> <tr><td>Block-iT RNAi Designer</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>ターゲット配列を選択し、pre-miRNA配列を設計するためのオンラインツール(https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/)</td></tr><tr><td>BSA 10 mg</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>C115CBケーブル</td><td>Sonidel</td><td>C115CB</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;254</td></tr><tr><td>C117ケーブル</td><td>Sonidel</td><td>C117</td><td></td></tr><tr><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;252 オメガドットファイバー付きキャピラリーチューブ(マイクロピペット針)</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>1 mm O.D. 0.75 mm I.D</td></tr><tr><td>CUY21 方形波エレクトロポレーター</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY21</td><td></td></tr><tr><td>ジエタノールアミン (pH 9.8)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8885</td><td></td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>卵インキュベーター</td><td>Kurl</td><td>B-Lab-600-110</td><td></td></tr><tr><td>https://www.flemingoutdoors.com/kuhl%2D%2D-600-egglaboratory-incubator%2D%2D-b-lab-600-110.html 電極ホルダー</td><td>Sonidel</td><td>CUY580</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;85</td></tr><tr><td>Electrodes</td><td>Nepa Gene</td><td>CUY611P3-1</td><td>https://www.sonidel.com/product_info.php?products_id&frac14;94</td></tr><tr><td>Electromax DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>18290-015</td><td>Electrocompetent E. coli細胞</td></tr><tr><td>Fast green FCF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7258</td><td></td></tr><tr><td>受精鶏卵(Gallus gallus)</td><td>商業業者(Charles Riverなど)または地元の農家</td><td></td><td></td>から入手</tr><tr><td>Gooseneck繊維光源</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FuGene 6トランスフェクション試薬</td><td>Promega</td><td>E2691</td><td></td></tr><tr><td>ハミルトンシリンジ(50 &mu;L)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20715</td><td>Hamilton Cat No&nbsp; 80901</td></tr><tr><td>ハンクス平衡塩溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>重鉱物油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>330760</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>GIBCO</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>L-ホモアルギニン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H10007</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13112</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重 (日本)</td><td>MM3</td><td>http://products.narishige-group.com/group1/MM-3/electro/english.html</td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>シャッター装置</td><td>P97</td><td></td></tr><tr><td>p-ニトロフェニルホスフェート</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>20-106</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS-T2TP ベクトル</td><td></td><td></td><td>Tol2トランスポゼース発現プラスミド。川上浩一さん(国立遺伝学研究所)からの寛大なご褒美です。Addgeneからもお買い求めいただけます。</td></tr><tr><td>Pfu</td><td>ThermoFisher</td><td>F566S</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer (オプション)</td><td>Parker</td><td></td><td>Pressure microinjection system</td></tr><tr><td>Plasmid maxi kit</td><td>Qiagen</td><td>12163</td><td>Plasmid maxiprep kit</td></tr><tr><td>pT2K-CAGGS vector</td><td></td><td></td><td>Tol2 transposon vector.提供:高橋 佳子 (京都大学)</td></tr><tr><td>PVC tubing</td><td>VWR (UK)</td><td>228-3830</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9007-5</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligase</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>The BLOCK-iT Pol II miR RNA expression kit with EmGFP</td><td>Invitrogen</td><td>K493600</td><td>miRNA発現ベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA)、コントロールベクター(pcDNA6.2-GW/EmGFP-miRNA-negativeコントロールプラスミド)、付属試薬、説明書(https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/K493600?SID.srch-hj-K4936-00)</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー</td><td></td><td></td><td></td></tr>が含まれています</tbody></table>

tol2トランスポゾンを介した人工マイクロrnaのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ

Loss-of-Function Approach in the Embryonic Chick Retina by Using Tol2 Transposon-Mediated Transgenic Expression of Artificial microRNAs

ニワトリ網膜は、その大きなサイズ、迅速な発達、視覚化や実験操作のためのアクセシビリティなどの利点を備えた、発生神経生物学における重要なモデルシステムです。しかし、その主な技術的限界は、遺伝子機能解析のための堅牢な機能喪失アプローチの欠如でした。このプロトコルは、Tol2トランスポゾンシステムを使用した人工マイクロRNA(miRNA)のトランスジェニック発現を含む、発生中のニワトリ網膜における遺伝子サイレンシングの方法論を説明しています。このアプローチでは、EmGFP(エメラルドグリーン蛍光タンパク質)マーカーの発現カセットと標的遺伝子に対する人工pre-miRNA配列を含むTol2トランスポゾンプラスミドを、 in ovo エレクトロポレーションによってTol2トランスポザーゼ発現コンストラクトとともに胚性ニワトリ網膜に導入します。トランスフェクトされた網膜細胞において、トランスポザーゼはトランスポゾンベクターからの発現カセットの切除および宿主染色体への組み込みを触媒し、miRNAおよびEmGFPタンパク質の安定した発現をもたらす。これまでの研究では、この手法を用いることで、神経発生において複数の機能を発揮する糖タンパク質であるNelの発現を、発生中のニワトリ網膜において有意に抑制できることを実証しました。我々の結果は、この方法論が遺伝子発現の安定的かつ堅牢な抑制を誘導し、したがって網膜発生の研究のための効率的な機能喪失アプローチを提供することを示しています。

Nelに対する人工miRNA発現のためのTol2トランスポゾンコンストラクトの構築 ネル(N耳Eピダーマル成長因子(EGF)-Like;Nell2としても知られています)は、細胞外糖タンパク質です。トロンボスポンジン-1と構造的に類似しており、主に神経系で発現しています20,21。我々は以前に、Nelが網膜神経節細胞15の分化および生存を調節し、網膜軸索22、23、24に対する抑制誘導手がかりとして作用することを実証した。発生中のニワトリ網膜では、HH15の推定色素上皮でNel発現が検出されます(胚日(E)2.5)。HH20(E3.5)では、新たに分化した網膜神経節細胞でもNel発現が観察されます。色素上皮お...

我々は、ニワトリ胚への人工マイクロRNA配列の導入とゲノム組み込みを、 in ovo エレクトロポレーションとTol2トランスポゾンシステムを用いて行う新しい機能喪失アプローチを開発しました。この技術は、発生中の遺伝子機能の研究のための堅牢で安定した遺伝子ノックダウン方法論を提供します。

Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ

The chick retina has long been an important model system in developmental neurobiology, with advantages including its large size, rapid development, and ...

この方法論は、ニワトリの網膜発達の研究のための機能喪失アプローチを提供します。この技術は、網膜の特定の領域における標的遺伝子の迅速かつ持続的な抑制をサポートします。このアプローチは、神経組織と非神経組織の両方を含む、ニワトリ胚の他の部分にも適用できます。インオボエレクトロポレーションでは、25ミリグラムのファストグリーンFCFを10ミリリットルのPBSに溶解して0.25%ファストグリーン溶液を調製し、0.2ミクロンのシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。次に、マイクロRNAエメラルドGFPプラスミドとTol2トランスポザーゼ発現プラスミドとを2対1の比率で混合してDNAカクテル注入液を調製する。次に、注入された領域を視覚化するために、調製したファストグリーン溶液を1対10の比率でDNAカクテルに加えます。次に、マイクロインジェクション装置を設置した。この装置は、ハミルトンシリンジ、18ゲージの2インチ針、長さ2センチメートルのポリ塩化ビニルチューブ、およびマイクロピペット針で構成されています。ハミルトンシリンジに重鉱物油を充填し、次に18ゲージの針をシリンジに取り付け、シリンジプランジャーを押し下げて針の内部空間をオイルで満たします。次に、ポリ塩化ビニルチューブを針の端に取り付け、チューブにオイルを充填します。引っ張ったマイクロピペット針をチューブに取り付けます。次に、細かい鉗子を使用して解剖顕微鏡の下で、針の先端を直径10〜20マイクロメートルに折って小さな開口部を作ります。針全体をオイルで満たします。次に、5マイクロリットルの着色されたDNAカクテルをペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡下で、マイクロピペット針の先端をペトリ皿のDNA溶液に入れ、溶液をゆっくりと針に引き込みます。針の内側と外側の圧力が平衡になったら、針の先端をDNA溶液から取り出し、注射するまで小さなビーカー内の滅菌PBSに沈めたままにします。次にエレクトロポレーション装置を設置し、マイクロマニピュレーター上に電極ホルダーで一対の白金電極を強固にセットする。電極の先端の間隔を2ミリメートルに調整し、電極をケーブルで矩形波パルス発生器に接続します。次に、DNAマイクロインジェクションのために、インキュベーターから受精したホワイトレグホン卵を取り出し、70%エタノールに浸したティッシュペーパーで卵の表面を拭きます。次に、18ゲージの針を10ミリリットルの注射器に取り付け、卵黄を傷つけないように下向きに傾けた卵の鈍い端に針を挿入します。卵から2〜3ミリリットルのアルブミンを引き出した後、スコッチテープで穴を塞ぎ、卵を光でろうそくにして、胚と硝子膜が殻から外れていることを確認します。次に、鉗子を使用して、卵の上から卵殻を取り除き、胚を露出させます。エレクトロポレーション中の胚の乾燥を防ぐために、一度に5個を超える卵を窓に入れないでください。針の先端を近位側から視小胞に45度の角度で挿入し、青色の溶液が内腔を満たすまでプランジャーをゆっくりと押し下げてDNAカクテルを注入します。針を引き出し、その先端をPBSに戻します。エレクトロポレーションの場合は、パルス電圧を15ボルト、パルス長を15ミリ秒、パルス間隔を915ミリ秒、パルス数を5に設定します。胚の上の硝子膜に数滴のHBSSを加えた後、マイクロマニピュレーターを使用して電極を胚の前後軸に垂直なHBSSに下げます。視静脈胞の両側に電極を置き、電極が胚や血管に触れないようにしてから、パルス電界を印加します。エレクトロポレーションが完了したら、電極を取り外し、アルブミンの蓄積を防ぐために、水に浸した滅菌綿棒で電極をそっと洗浄します。スコッチテープで窓を密封し、目的の発達段階まで胚を再インキュベートします。個々のプレマイクロRNA配列をNel AP発現細胞にトランスフェクションするとHEK293Tヌクレオチド482〜502、910〜930、および2461〜2481に対するコンストラクトによるNel発現の有意な抑制がもたらされました。2つのマイクロRNA配列を連鎖させることで、ノックダウン効率が大幅に向上しました。3つの組み合わせはすべて、非鎖の個々のプレマイクロRNA配列と比較して、強化された抑制活性を示しました。トランスフェクションの少なくとも13日後に強力な抑制が観察されました。ヌクレオチド482〜502および2461〜2481を標的とするNelプレマイクロRNA構築物をトランスポザーゼ発現ベクターとニワトリ網膜に同時トランスフェクトすると、胚4.5日目にエメラルドGFP発現細胞において網膜色素上皮におけるNel発現が有意に減少した。8日齢の胚では、網膜神経節細胞でもNel発現が減少しました。対照的に、網膜におけるNel発現は、対照マイクロRNAの導入によって影響を受けなかった。この手順に続いて、細胞の増殖と分化、細胞死、細胞と軸索のトレースなどのさまざまな方法を使用して、標的遺伝子抑制への影響を調べることができます。

loss-function-approach-embryonic-chick-retina-using-tol2-transposon

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ゲインまたは機能研究の損失のいずれかを実行する目的のためのマウス網膜細胞へのプラスミドDNAの取り込みのための方法...

開発マウス網膜の in vivoエレクトロポレーションで

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ニワトリ胚網膜細胞培養物は、感光体の生物学の研究のための貴重なツールを構成しています。私たちは文化の前に網膜のプラスミドエレクトロポOVOの元に基づいて、効率的な遺伝子導入技術を開発しました。この技術はかなりこのシステムの実現可能な遺伝子操作を行う、現在利用可能なプロトコルを介してトランスフェクション効率を向上させます。...

初代細胞培養研究のためのひよこ網膜における効率的な遺伝子導入：元オボエレクトロポレーションアプローチ

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細胞非自律影響を研究するためのキメラゼブラフィッシュ胚における個々の網膜前駆細胞におけるトランスジェニック遺伝子発現のin vivoイメージング

このプロトコルは、そのまま神経回路内で選択的な遺伝子の発現低下と特にシナプス研究を刺激するために光遺伝学と人工のマイクロ Rna を介した RNA...

オプトジェネティクスを組み合わせてそのまま神経回路内でのシナプス前機能に関する遺伝子ノックダウンの効果を特徴付ける人工マイクロ Rna

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Tol2トランスポゾンを介した人工マイクロRNAのトランスジェニック発現を用いたニワトリ胚網膜における機能喪失アプローチ

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