ダイヤモンド光源のXChem施設における効率的なフラグメントスクリーニングの実現
2021年5月29日
このホワイトペーパーでは、水晶ベースのフラグメントスクリーニングのための完全なXChemプロセスについて、アクセスの申請から始まり、その後のデータ配布までのすべてのステップについて説明します。
Diamond Light SourceのXChem施設は、日常的に大規模な結晶グラフィックフラグメントスクリーニングを提供し、結晶から堆積プロセス全体をサポートします。X線結晶構造解析は、FBDDツールキットに不可欠な要素です。弱い結合体を同定するのに十分な感度を持ち、分子レベルでの相互作用に関する構造情報を直接得ます。
フラグメントベースの創薬は、リード創薬に広く使用されている戦略です。これまでに6つの医薬品を臨床用に供給し、50以上の分子が臨床試験に進んでいます。XChemプラットフォームがもたらす進歩と効率性が、従来の浸漬方法、データ収集、分析方法に及ぼす影響は、視覚的に最もよく実証されています。
まず、結晶と化合物の位置を選択します。PCからTextRankを開き、右下のリストから、または左上のボックスにバーコードを入力して、クリスタルトレイを選択します。正しい画像形式とシングルウェルビューを選択します。
結晶に当たらずに溶媒や化合物を液滴に添加するには、液滴内を右クリックしますが、液滴画像内を移動しながら実験に適した結晶が見つかった場合は、結晶から離れます。Echoソフトウェアを開き、[新規]を選択して、アコースティックディスペンサーを使用して溶液をディスペンスします。正しいソースウェルプレートと液体クラスを選択してください。
正しいプレート タイプがデスティネーション プレートとして選択されていることを確認します。次に、カスタムボックスをオンにして続行します。[インポート] を選択し、関連するバッチ ファイルを選択します。
次に、ソフトウェアの指示に従ってインポート手順を完了します。プレートマップを使用して、分注する溶液と供給先を確認します。次に、表示されるプロンプトに従ってプロトコルを実行します。
ソースプレートからの溶液は、選択した結晶滴に分配されます。プレートをインキュベーターに必要時間保管します。半自動結晶採取装置を使用して結晶を採取するには、ワークフロー開始ボタンを押して、最初に選択したウェル位置に移動します。
結晶が残っている場合は、ループに取り付けて液体窒素に突入し、リストの最初のパックの1番目の位置に配置します。インターフェイスから水晶振動子の適切な説明を選択します。滴がコンパウンドソークの場合は、コンパウンドの状態の説明を記録します。
水晶振動子が正常にマウントされた場合は「マウント済み」を選択し、そうでない場合は「失敗」を選択します。結晶が収穫されたら、パックをバーコードスキャナーに持って行き、一度に1つずつホルダーに入れてパックをスキャンし、バーコードをピンで留めます。スキャンが完了したら、パックに蓋をして液体窒素貯蔵デュワーに保管します。
中心がずれたサンプルを回収するには、ISPyBのサンプルチェンジャービューで[rank by AP resolution]を選択し、緑から赤への色目盛りで自動処理された解像度でサンプルをグレーディングします。サンプルをクリックして、赤または黄色のサンプルを確認します。次に、結晶のスナップショットをチェックして、水晶が中央に配置されているかどうかを確認します。
XChem Explorer または XCE を使用して Diamond の自動処理結果を取得および分析するには、ターミナルでサブフォルダー processing に移動し、エイリアス XCE を使用して XChem Explorer を開きます。[概要] タブの [データ ソースからテーブルを更新] ボタンを選択して、実験データの概要を更新します。[設定] タブで、データ収集ディレクトリを選択し、[データセット] タブを開きます。
[ターゲットの選択] ドロップダウンメニューからターゲットを選択し、[データセット] ドロップダウンメニューから [自動処理から新しい結果を取得] を選択して、[実行] をクリックします。ディンプルを使用して初期マップを計算するには、マップタブを開き、ドロップダウンメニューから参照モデルを選択して目的のデータセットを選択し、選択したMTZファイルに対してDimpleを実行します。リガンド拘束を生成するには、目的のデータセットを選択し、マップと拘束ドロップダウンから選択した化合物のSCF、PDB、またはPNGファイルを作成します。
Panda を使用してヒットを識別するには、 [Pandas] タブを選択し、出力ディレクトリが正しく定義されていることを確認して、panda を実行します。[ヒット識別]ドロップダウンメニューから分析します。Panda によって識別されたヒットを分析するには、panda を実行します。
[Hit Identification] ドロップダウンメニューから inspect を実行します。PandaコントロールパネルでCootを開きます。イベントマップおよびモデルと比較するためのディンプルからのロード平均および2mFo-DFcマップ。
リガンドがフィットしたら、バインドされた状態モデルへの変更が失われないように、別のイベントに移動する前に、リガンドをモデルとマージしてモデルを保存をクリックします。イベント・コメント・フィールドを使用してバインディング・イベントに注釈を付け、レコード・サイト情報を使用してバインディング・サイトに注釈を付けます。すべての実行可能なリガンドがモデル化され、マージされ、イベントマップに基づいて保存されたら、panda.inspectを閉じます。
Panda inspectモデルをプロジェクトディレクトリにエクスポートし直し、選択したデータセットのリファインメントの最初のラウンドを開始すると、リファインメントがリファインメントタブに表示されます。X線結晶構造解析によるフラグメントスクリーニング用のXChemパイプラインは大幅に合理化され、科学界による採用が可能になりました。このチャートは、2015年から2019年にかけてのユーザープログラムの取り込みと統合を示しており、2019年のブロック割り当てグループの作成と、2020年のCOVID-19パンデミックによるプラットフォームの回復力を示しています。
キャンペーンが成功すると、標的タンパク質上の潜在的な相互作用部位の3次元マップが得られます。典型的な結果は、SARS-CoV-2の主要なプロテアーゼのXChemスクリーニングです。酵素活性部位やサブポケットなどの既知の関心部位は黄色で示されています。
タンパク質間相互作用に関与するものなどの推定アロステリック部位はマゼンタで示され、一般に偽陽性と見なされる結晶パッキング界面は緑色で示されています。歴史的に、結晶構造解析を主要なフラグメントスクリーニングとして使用することは困難でした。この研究では、サンプル調製から最終構造までのXChemパイプラインプロトコルを文書化しました。
結晶学的フラグメントスクリーニングは、他の生物物理学的手法を補完するものであり、通常、フラグメントヒットをリード化合物に進行させるために不可欠です。あらゆる創薬ターゲットクラスに適用できます。
概要
本論文では、結晶ベースのフラグメントスクリーニングにおけるXChemの全プロセスについて、利用申請からデータの普及までの手順を詳細に記述します。Diamond Light SourceのXChem Facilityは、効率的なX線結晶構造解析を通じて、フラグメントベースの創薬を促進しています。
研究の主要構成要素
科学分野
- フラグメントベースの創薬 (FBDD)
- X線結晶構造解析
- 構造生物学
背景
- フラグメントベースの医薬品設計は、リード化合物探索のための戦略である。
- X線結晶構造解析は、分子間相互作用に関する構造的な知見を提供する。
- 従来の浸漬法には限界があるが、XChemはこれを解消している。
- XChemプラットフォームは、COVID-19パンデミックにおいてもその有用性が示された。
研究の目的
- サンプルの調製から最終構造の決定まで、XChemパイプラインのプロトコルを記録すること。
- フラグメントスクリーニングにおけるXChemプラットフォームの効率性を実証すること。
- 結晶構造解析によるフラグメントスクリーニングが創薬に与える影響を強調すること。
使用した手法
- スクリーニング用結晶および化合物の選定。
- 溶液分注へのアコースティックディスペンサーの活用。
- 半自動装置を用いた結晶の回収。
- XChem ExplorerおよびPandaソフトウェアによるデータ解析。
主な結果
- キャンペーンの成功により、相互作用部位の三次元マップが得られる。
- 2015年から2019年までのユーザープログラムの導入実績。
- タンパク質における潜在的なアロステリック部位および活性部位の同定。
- 合理化されたプロトコルにより、より幅広い科学コミュニティへのアクセスが可能になる。
結論
- XChemパイプラインにより、フラグメントスクリーニングの効率が大幅に向上します。
- 結晶構造解析によるフラグメントスクリーニングは、他の生物物理学的手法を補完します。
- XChemプラットフォームの進歩は、継続的な創薬研究を支援します。
よくある質問
業界における重要性
フラグメントベースの創薬は、弱い分子間相互作用の高感度な検出に依存しており、X線結晶構造解析は、リード最適化に不可欠な結合親和性と構造的詳細の両方を提供します。Diamond Light SourceのXChem Facilityは、サンプルの調製からデータの登録に至るまで、結晶構造ベースのフラグメントスクリーニングを効率化し、高い構造忠実度で弱い結合剤を日常的に同定することを可能にします。この機能は、多様な治療領域における初期のターゲット検証およびヒットからリードへの展開を支援し、創薬パイプラインにおけるメカニズム上の不確実性を低減します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期創薬およびターゲットバリデーション
- 科学的価値： 原子分解能でのリガンド結合モードを直接観察することにより、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用的価値： キャンペーンへの投資前に、ターゲットへの結合（ターゲット・エンゲージメント）と結合部位へのアクセシビリティを確認することで、生物学的リスクの低減をサポートする。
- 予測的価値： 明確な相互作用幾何学を持つフラグメントを特定することで、薬剤化学における信頼性の高い出発点を提供する。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- アッセイの準備状況： キャンペーン全体を通じて信頼性の高い化合物評価を可能にする、標準化され再現性のある構造出力を提供します。
- スケーラビリティ： I04-1ビームラインにおける自動サンプルハンドリングと無人データ収集により、ハイスループットスクリーニングを促進します。
- データ品質： ヒット化合物の検証および後続のリファインメントをサポートする、定量的な電子密度マップとリガンド拘束条件を生成します。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- トランスレーショナルな継続性： 機能に関連する相互作用部位をマッピングすることで、バイオマーカー開発に沿った構造的洞察を提供します。
- 前臨床段階のリスク低減： SARS-CoV-2メインプロテアーゼのスクリーニングにおいて3週間のターンアラウンドタイムで実証されたように、新規ターゲットから得られたヒット化合物の迅速なフォローアップを可能にします。
- ポートフォリオへの有用性： 多様なターゲットクラスにわたる結合の構造的エビデンスを提供することで、リスク調整後の推進決定を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
XChemプラットフォームは、初期のターゲットバリデーションからリード化合物の同定に至る創薬の連続的なプロセスに統合されており、ヒット化合物の選定および最適化戦略に有用な構造データを提供します。
- 探索生物学： 化合物とターゲットの相互作用に関する直接的な構造的証拠を提供することで、仮説検証をサポートし、結合メカニズムを明らかにします。
- スクリーニング： 自動化された結晶ハンドリング、溶媒分注、およびデータ処理ワークフローにより、再現性を確保したアッセイ準備を可能にします。
- 分析： リガンド結合イベントマップ、精緻化可能なモデル、および条件間の比較分析を可能にするサイトアノテーションを含む、測定可能なアウトプットを生成します。
- トランスレーショナルリサーチ： ターゲット結合およびアロステリック調節の構造的コンテキストを提供することで、フラグメントヒットを前臨床段階へとつなげます。
- エンタープライズ再利用： 査読済みのアカデミックな経路および独自の産業用経路を通じてアクセス可能な、再利用可能な構造スクリーニング機能として機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 弱い結合剤の相互作用を構造的に直接可視化することで予測の信頼性を高め、ターゲット検証における曖昧さを軽減します。
- 運用的価値： 合理化されたプロトコル、自動分注、およびXChem Explorerによる一元的なデータ管理を通じて、標準化と再現性を実現します。
- 戦略的価値： 生物物理学的スクリーニングのトリアージを補完する構造的ヒット確認を提供することで、go/no-go判断を改善します。
- ポートフォリオへの影響： 結合部位の可塑性と相互作用ホットスポットに関する構造データに基づいた、リスク調整後の優先順位付けが可能になります。
実施上の検討事項
- 結晶構造解析、フラグメントライブラリの取り扱い、および構造データの解釈に関する専門知識が必要です。
- 放射光ビームライン、音響分散システム、および自動結晶回収ツールへのアクセスに依存します。
- ISPyBおよびXChem Explorerを介した、サンプル追跡、データ命名、およびデポジションプロトコルのチーム間標準化が必要です。
- 結晶の品質、溶媒の適合性、およびターゲット特異的なソーキング条件に関する適応上の検討事項が含まれます。
- 実用上の制限として、研究で述べられているように、結晶の得やすさや特定のターゲットのX線感受性への依存が挙げられます。
