Name: ダイヤモンド光源のXChem施設における効率的なフラグメントスクリーニングの実現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶXChem施設の結晶ベースフラグメントスクリーニング手法。X線結晶構造解析を用いて分子相互作用を可視化し、創薬研究における弱い結合分子の同定とリード化合物発見を効率化するプロセスを解説します。

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この研究は、ダイヤモンド光源と構造ゲノムコンソーシアムの間の大規模な共同作業を表しています。著者らは、i04-1ビームラインの自動化に貢献し、すべてのMXビームラインで共通して実行されるデータ収集と自動処理パイプラインを提供してくれたDiamondのさまざまなサポートグループとMXグループに感謝したいと思います。また、SGC PXグループのレジリエンス(回復力)と、セットアップをテストした最初のユーザーであるEvotecと、最初の本格的な産業ユーザーであるEvotecにも感謝しています。この研究は、欧州委員会のHorizon 2020プログラムの資金提供を受けたiNEXT-Discovery(助成金871037)の支援を受けました。

著者には開示すべき利益相反はありません。

このホワイトペーパーで概説したプロセスは、ユーザーコミュニティによって広範囲にテストされており、ここで説明するプロトコルの適応性は、プラットフォームで通常遭遇するさまざまなプロジェクトを処理するための鍵となります。ただし、結晶系にはいくつかの前提条件が必要です。
X線結晶構造解析を使用して実施するフラグメントスクリーニングキャンペーンでは、再現性のある堅牢な結晶システムが重要です。標準的なXChemプロトコルでは、結晶滴にフラグメントを直接添加する必要があるため、最適化では、結晶の総数ではなく、高品質の結晶を含む滴の数に焦点を当てる必要があります。液滴に複数の結晶が含まれている場合、それらは効果的に冗長ですが、収穫プロセスを軽減する可能性があります。さらに、結晶化プロトコルをホームインスティテュートからオンサイト施設に移すことは困難な場合があります。これは一般に、再現性のある核生成を促進するために結晶播種を用いて最もよく達成される54ので、したがって、ユーザがタンパク質および結晶化溶液とともに種子ストックを提供することが良い習慣である。
良好な化合物の溶解性と担体を確保するために、弱いフラグメントの結合を促進することを目的とした高濃度の浸漬、フラグメントライブラリは有機溶媒、特にDMSOおよびエチレングリコールで提供されます。2種類の溶媒を用意することで、DMSOをまったく許容しない結晶や、目的部位でのフラグメントの結合を閉塞させる結晶の代替品となります。ユーザーは水性バッファーで代替ライブラリを供給できます:化合物は、液体ディスペンスロボットと互換性のあるプレートで完全に溶解およびフォーマットされていれば、適切にディスペンスされます。
ライブラリーを可溶化し、結晶系で許容される適切な有機溶媒を見つけることが不可能なプロジェクトでは、BESSY55で確立された乾燥化合物を使用するという代替手順があります。
コミュニティでは、高塩濃度の結晶化条件で成長した結晶に化合物を浸すことができるかどうかについて長年の疑問があります。実際には、収穫段階での化合物のより多くの沈殿および塩結晶の急速な形成が観察され、これは収穫地域の周囲に湿潤な環境を適用することによって減少する。一般に、高塩分結晶化条件からの結晶系でのスクリーニングキャンペーンは、低塩分条件と同等のヒット率をもたらします。
XChemプロセスの初期段階(溶剤耐性試験と事前スクリーニング)は、比較的小規模で迅速な実験ですが、プロジェクトの明確な実行/中止の決定を可能にします。最も厄介なのは、どちらの溶媒も許容されない場合、または事前スクリーニングの結果、ヒット率が非常に低い場合は、代替の結晶システムを見つける必要があることです。対照的に、成功した場合、結果はスクリーニング実験に使用する浸漬条件とデータ収集の最良の戦略を直接通知します。データの品質、特に分解能は、ヒットの同定と分析のための電子密度の品質に影響を与えるため、回折品質に悪影響を与えない可能な限り高い化合物濃度で浸漬することを目的としています(データセットの大部分(~80%)は2.8 Å以上の分解能に回折します)。
データ解析プロセスはXChemExplorer内で合理化されており、弱いバインダーの検出にはPanDDAソフトウェアに依存しており、ユーザーはスクリーニングキャンペーンの結果を迅速に視覚化して確認することができます。XChemExplorerは、Diamondで入手可能なパッケージ(DIALS16、autoPROC 30、STARANISO31、Xia214)から、各パッケージの標準的な方法(CC1/2 = 0.3)によって決定された分解能制限でデータ処理結果をインポートします。デフォルトでは、データセットの選択は、I/sigI、完全性、および多数の一意の反射から計算されたスコアに基づいているが、特定の処理結果は、グローバルまたは個々のサンプルの両方に使用するために選択することができる25。また、分解能、Rフリー、リファレンスデータとターゲットデータ間の単位セル体積の差(デフォルトはそれぞれ3.5 Å、0.4、12%)などの基準に基づいて、PanDDAによる分析からデータを除外し、回折が不十分な結晶、偏芯、または誤ったインデックスが分析に影響を与えないようにします。
PanDDAアルゴリズムは、フラグメントキャンペーン中に収集された大量のデータセットを利用して、標準的な結晶構造マップでは見えない部分占有リガンドを検出します。最初に、PanDDAは溶媒耐性試験と事前スクリーニングのステップで収集されたデータを使用して平均密度マップを作成し、それを使用して基底状態モデルを作成します。このモデルはその後のすべての分析ステップに使用されるため、フラグメントスクリーニングに使用される条件下でリガンド化されていないタンパク質を正確に表すことが重要です。次に、PanDDAは統計解析を使用して結合配位子を同定し、結晶の結合状態のイベントマップを生成します。イベントマップは、部分占有データセットから結晶の結合していない画分を差し引くことによって生成され、リガンドが全占有で結合した場合に観察されるものを示します。従来の2mFのo-DFCマップでは明瞭に見えるフラグメントでさえ、事象マップを参照しなければ、モデル化が誤られる可能性がある32。PanDDAは、平均マップ(通常はフラグメント結合を示す)とは異なるデータセットを特定するための強力な方法であり、RSCC、RSZD、Bファクター比、リファインメント中のRMSDなどの指標がユーザーの利益のために提供されていますが、観察された密度が予想されるリガンドと最適なコンフォメーションを正確に表しているかどうかを判断する最終的な責任はユーザーにあります。
データの解析と精緻化により、XChemExplorerを用いて、すべてのユーザーが同時にタンパク質データバンク(PDB)に複数の構造を寄託することが可能になりました。各フラグメントスクリーンに対して、2つのグループ堆積が行われます。最初の堆積には、MMCIFファイルに含まれるPanDDAイベントマップを計算するための係数を持つ、すべてのフラグメント結合モデルが含まれています。2回目の堆積では、実験の全データセットの測定された構造因子に沿って、付随する基底状態モデルが提供され、このデータはPanDDA分析の再現や将来のアルゴリズムの開発に使用できます。ヒットの構造に関しては、フラグメント占有率が低い場合、モデルがリガンド結合と交絡基底状態構造の複合体である場合、精緻化はより良好に動作します32。それにもかかわらず、完全な複合モデルは一般的に複雑で解釈が難しいため、実際には束縛状態分数のみを堆積させます。その結果、PDBによって再計算される一部の品質指標(特にR/Rfree)は、わずかに上昇することがあります。Zenodo56 などのプラットフォームを使用してすべての生データを提供することもできますが、これは現在 XChem パイプラインではサポートされていません。
全体として、2016年の運用以来、この手順を使用してターゲットの95%以上でフラグメントリガンドを同定することができました。XChemがサポートした多くのプロジェクトからの経験は、結晶調製33のベストプラクティスに凝縮され、フラグメントの進行を支援するための確立された概念を実装したフラグメントライブラリが進化し29、ライブラリ組成を公開する慣行の確立にも役立ちました。このプラットフォームは、ここで詳述されているように、よく維持されたインフラストラクチャと文書化されたプロセスの重要性を実証し、他のフラグメントライブラリ57,58を評価し、ライブラリ48を比較し、共同EUOpenscreen-DRIVEライブラリ59,60の設計に情報を提供することを可能にしました。

フラグメントベース創薬(FBDD)は、リード創薬に広く利用されている戦略であり、25年前に登場して以来、4つの医薬品を臨床用に供与し、40以上の分子が臨床試験に進んでいます1,2,3。フラグメントは、通常、分子量が300Da以下の小さな化学体です。これらは、化学的複雑性が低いため、優れた物理化学的特性を備えたリガンド効率の高い阻害剤を開発するための良い出発点となるために選ばれました。その大きさは、より大きな薬物や鉛様化合物のライブラリーよりもタンパク質の結合ランドスケープを徹底的にサンプリングし、ホットスポットや推定アロステリック部位を明らかにすることを意味します。フラグメントは、構造情報と組み合わせることで、タンパク質とリガンドの間の潜在的な分子相互作用の詳細なマップを提供します。しかし、標的タンパク質への結合が弱い傾向にあるこれらの実体を確実に検出および検証するには、表面プラズモン共鳴(SPR)、核磁気共鳴(NMR)、等温滴定熱量測定(ITC)などの一連の堅牢で高感度な生物物理学的スクリーニング法が必要です4,5。
X線結晶構造解析は、FBDDツールキットの重要な部分であり、弱い結合体を同定するのに十分な感度を持ち、分子レベルでの相互作用に関する構造情報を直接得ます。これは他の生物物理学スクリーニングを補完するものであり、通常、フラグメントヒットをリード化合物に進行させるために不可欠です。高品質の結晶システムが必要であり、結晶化の再現性が高く、結晶は理想的には 2.8 Å 以上の分解能に回折する必要があります。
歴史的に、結晶学を一次フラグメントスクリーン6,7,8として使用することは、学界であろうと産業界であろうと非常に困難であった。対照的に、シンクロトロンは、ロボット工学、自動化9,10,11、検出器技術12,13において桁違いの進歩を達成し、同様に加速された計算能力とデータ処理のアルゴリズム14,15,16と組み合わせることで、LillyCAT 7で開拓されたように、完全な回折データセットを数秒で測定し、多数の回折データセットを完全に無人で測定することができますその後、MASSIF17,18(欧州放射光施設(ESRF))に認定されました。これにより、シンクロトロンは、幅広いユーザーコミュニティが主要なスクリーニングとして水晶ベースのフラグメントスクリーニングにアクセスできるように、高度に合理化されたプラットフォームを開発しました(XChem at Diamond;EMBL/ESRF19でのCrystalDirect。BESSY at Helmholtz-Zentrum Berlin20;MaxIV21のFragMax)。
この論文では、サンプル調製から3Dモデルヒットの最終的な構造結果まで、X線結晶構造解析によるフラグメントスクリーニングのためのXChemプラットフォームを構成するプロトコルを文書化します。パイプライン(図1)では、結晶同定22、浸漬23、および収穫24への新しいアプローチ、データ管理ソフトウェア25、および現在コミュニティで広く使用されているフラグメント同定26へのアルゴリズムアプローチの開発が必要でした。結晶採取技術は現在、ベンダーによって販売されており(材料表を参照)、ツールがオープンに利用できるようになったことで、他のシンクロトロンはそれらを適応させて同等のプラットフォームをセットアップできるようになりました21。進行中のプロジェクトは、Fragalysisプラットフォーム27を通じて、データ分析、モデル完成、およびデータ普及に取り組んでいます。サンプル調製ラボはビームラインI04-1に隣接しているため、数百個の凍結サンプルをビームラインに移すためのロジスティクスが簡素化され、I04-1の専用ビームタイムにより、キャンペーンの指針となる迅速なX線フィードバックが可能になります。
XChemはDiamondのユーザープログラムに欠かせない存在で、年に2回(4月上旬と10月初旬)の電話があります。ピアレビューのプロセスは、学界や産業界の創薬の専門家と協議して洗練されています。提案プロセス28 では、強力な科学的ケースに加えて、申請者は結晶システムの準備状況だけでなく、生化学的および直交的な生物物理学的方法の専門知識と、フォローアップ化学を通じてスクリーニングヒットを進行させる能力も自己評価する必要があります。アクセスモードも、学際的なユーザーコミュニティに対応するために進化しています。
Tier 1 (単一 プロジェクト) は、探索段階のプロジェクト用であり、ヒット検証ツール (生物物理学または生化学ツール) であり、フォローアップ戦略を用意する必要はありません。採択されれば、プロジェクトには概念実証に十分なビームタイムシフトの回数が減ります。
Tier 2 (単一プロジェクト) は、十分に検証されたプロジェクト用であり、下流のツールとフォローアップ戦略を整備する必要があります。採択された場合、プロジェクトには完全なフラグメントスクリーニングキャンペーンに十分なビームタイムが割り当てられます。単一プロジェクト(ティア1またはティア2)は、配分期間(4月から9月または10月から3月)の6か月以内に完了する必要があります。
ブロック・アロケーション・グループ(BAG) は、グループとプロジェクトのコンソーシアムのためのもので、BAG内で堅牢なターゲット選択と優先順位付けのプロセスが実施され、明確なフォローアップ・パイプラインが実施されています。BAGには、XChemのトレーニングを受けたエキスパート(スーパーユーザー)が少なくとも1人必要で、ダイアモンドスタッフと活動を調整し、BAGメンバーをトレーニングします。ビームタイムシフトの割り当て数は、BAG内の科学的に強いプロジェクトの数によって定義され、BAGのレポートに基づいて割り当て期間ごとに再評価されます。アクセスは2年間利用できます。
XChem実験は3つの段階に分かれており、それぞれに溶媒耐性試験、プレスクリーニング、メインスクリーンの判断ポイントがあります(図2)。溶媒耐性試験は、浸漬パラメータ、結晶システムが許容できる溶媒(DMSO、エチレングリコール、または必要に応じて他の凍結保護剤)の量、および期間を定義するのに役立ちます。溶媒濃度は通常、少なくとも2つの時点で5%〜30%の範囲です。回折データが収集され、結晶系の塩基回折と比較されます。これにより、次の段階のソーキング パラメーターが決まります。プレスクリーニングでは、溶媒試験で決定された条件を使用して100〜150個の化合物を浸し、その目的は、結晶がそれらの条件で化合物に耐えられることを確認することです。必要に応じて、凍結保護剤を、すでにフラグメントを含む液滴に添加します。成功基準は、結晶の80%以上が良好で一貫した品質の回折データを生成するのに十分なほど生き残ることです。これがうまくいかない場合は、通常、浸漬時間や溶媒濃度を変更して浸漬条件を修正します。事前スクリーニングが成功したら、実験用に選択した残りの化合物を最終パラメーターを使用してセットアップできます。
DSI態勢を整えたライブラリ( 材料表を参照)は、構えた化学29 を使用して迅速なフォローアップ進行を可能にするように意図的に設計されており、施設の主力ライブラリとなっています。DMSO中の濃度が500 mMです。アカデミックユーザーは、DMSOの濃度が100〜500mMで、共同研究者が提供する他のライブラリ(合計2,000を超える化合物)にアクセスすることもできます(完全なリストはウェブサイト28にあります)。全体的なコレクションの多くは、DMSOに耐えられない結晶系用のエチレングリコールでも利用できます。ユーザーは、音響リキッドハンドリングシステムと互換性のあるプレートに入っている場合、独自のライブラリを持ち込むこともできます( 材料表を参照)。
実験の 3 つのステップ(溶媒特性評価、プレスクリーニング、またはフルスクリーン)すべてにおいて、以下のサンプル前処理手順は同じです(図 3)。溶媒と化合物の両方に対する音響液体分注システムを使用して滴に分注する23;クリスタルシフター24を使用した結晶の効率的な収穫。ビームラインデータベース(ISPyB)へのサンプル情報のアップロード実験の設計と実行のための現在のインターフェースは、Excelベースのアプリケーション(SoakDB)であり、プラットフォームのさまざまな機器に必要な入力ファイルを生成し、すべての結果をSQLiteデータベースに追跡して記録します。バーコードスキャナーは、サンプルの追跡を支援するためにプロセス全体のさまざまな段階で使用され、このデータはデータベースに追加されます。
回折データは、ビームラインI04-1の専用ビームタイムを用いて無人モードで収集します。センタリングモードには、光学式とX線式の2種類があります17.針状結晶や棒状結晶にはX線センタリングが推奨されますが、分厚い結晶は一般的に光学モードをサポートしているため、割り当てられたビーム時間内により多くのサンプルを収集できます。結晶の分解能(プラットフォームに入る前に確立)に応じて、データ収集は60秒または15秒の総曝露のいずれかになります。溶媒試験段階でのデータ収集により、通常、ビームラインI04-1の性能に最も適した組み合わせがわかります。
大量のデータ分析はXChemExplorer(XCE)25を介して管理され、PanDDA26を使用してヒット識別ステップを起動するためにも使用できます。XCEは、タンパク質-リガンド構造の大規模解析をサポートするデータ管理およびワークフローツールです(図4)。ダイヤモンド光源(DIALS16、Xia214、AutoPROC30、STARANISO31)で収集されたデータから自動処理結果を読み取り、データ品質と参照モデルとの類似性に基づいて結果の1つを自動選択します。このモデルがXChemスクリーニングに用いる結晶系を代表するものであり、すべての水またはその他の溶媒分子、および溶媒のみに浸した結晶で見られるすべての補因子、リガンド、および代替コンフォメーションが含まれていることが重要です。この参照モデルの品質は、モデルの構築と改良の段階で必要な作業量に直接影響します。PanDDAは、すべてのデータを分析し、結合部位を特定するために使用されます。構造を参照構造に位置合わせし、統計マップを計算し、事象を識別し、事象マップを計算する26,32。PanDDAパラダイムでは、完全な結晶学的モデルを構築する必要はなく、望ましくもありません。モデル化されなければならないのは、フラグメントが結合しているタンパク質のビュー(結合状態モデル)のみであるため、イベントマップ32に従って、リガンドと周囲の残基/溶媒分子を構築することのみに焦点を当てる必要があります。

<table><tbody><tr><td>DSI-poised library</td><td>Enamine</td><td>DSI-896</td><td>fragment library</td></tr><tr><td>Echo 550 and 650 series</td><td>Beckman-Coulter</td><td></td><td>acoustic dispensing system</td></tr><tr><td>Echo microplates</td><td>Beckman-Coulter</td><td>001-12380; 001-8768; 001-6025</td><td>1536-well and 384-well microplates</td></tr><tr><td>Shifter</td><td>Oxford Lab Technology</td><td></td><td>harvesting device</td></tr><tr><td>マイクロプレートスイングアウトローター付き遠心分離機</td><td>シグマ</td><td>モデル11121</td><td>マイクロプレート遠心分離機</td></tr><tr><td>3滴結晶化プレート</td><td>Swissci</td><td>3W96T-UVP</td><td>結晶化プレート</td></tr><tr><td>FormulatrixプレートイメージャーおよびRockmakerソフトウェア</td><td>Formulatrix</td><td></td><td>結晶化プレートイメージングデバイス</td></tr></tbody></table>

ダイヤモンド光源のxchem施設における効率的なフラグメントスクリーニングの実現

Achieving Efficient Fragment Screening at XChem Facility at Diamond Light Source

フラグメントベースの創薬では、~300 Da未満の数百または数千の化合物を目的のタンパク質に対して試験し、強力な医薬品候補に開発できる化合物を特定します。化合物が小さいため、相互作用が弱いため、スクリーニング法は高感度でなければなりません。さらに、構造情報は、これらのヒットを鉛のような化合物に精緻化するために重要になる傾向があります。したがって、タンパク質結晶構造解析は常にゴールドスタンダードの手法でしたが、歴史的に見ても、一次スクリーニングとして広く使用するには難しすぎます。
2014 年に最初の XChem 実験が実証され、その後、プロセスを検証するために学術および産業界の共同研究者と試行されました。それ以来、多大な研究努力と大幅なビームタイムにより、サンプル調製の合理化、迅速なフォローアップが可能なフラグメントライブラリの開発、I04-1ビームラインの無人データ収集機能の自動化と改善、データ管理、分析、ヒット同定のための新しいツールの導入が行われました。
XChemは現在、大規模な結晶学的フラグメントスクリーニングのための施設であり、結晶から堆積までのプロセス全体をサポートし、世界中の学術および産業ユーザーが利用できます。2016年以降、査読付きアカデミックユーザープログラムは、十分に検証されたプロジェクトや探索的なプロジェクトなど、可能な限り幅広い科学的範囲のプロジェクトに対応するために積極的に開発されています。アカデミックアクセスは、査読付き提案の半年ごとの募集を通じて割り当てられ、独自の作業はダイヤモンドの産業連絡グループによって手配されます。このワークフローは、すでにさまざまな治療領域の100以上のターゲットに日常的に適用されており、化合物設計の高品質の出発点として機能し、結合部位に関する広範な構造情報を提供する弱い結合剤(ヒット率1%〜30%)を効果的に特定します。このプロセスの回復力は、COVID-19パンデミックの間、メインプロテアーゼの3週間のターンアラウンドを含む、SARS-CoV-2標的の継続的なスクリーニングによって実証されました。

X線結晶構造解析によるフラグメントスクリーニング用のXChemパイプラインは大幅に合理化され、科学界に採用されています(図5)。このプロセスは、ヒット率が1%から30%の間で変動する150以上のスクリーニングキャンペーンで検証されており47、48、49、50、51、52、および多くのリピートユーザーによって検証されています。適さない(分解能が低い、結晶化や回折品質に一貫性がない)結晶系や、DMSOやエチレングリコールに耐えられない結晶系は、プロセスの早い段階で排除され、時間、労力、リソースを節約できます。キャンペーンが成功すると、標的タンパク質上の潜在的な相互作用部位の3次元マップが提供されます。典型的な結果は、SARS-CoV-2の主要なプロテアーゼのXChemスクリーニングです(図6)。典型的には、フラグメントヒットは、(a)酵素活性部位およびサブポケット48などの既知の関心部位において見出される。(b)推定アロステリック部位、例えば、タンパク質間相互作用53;(c)一般に偽陽性と見なされる結晶パッキング界面(図6)。この構造データは一般に、フラグメントヒットを鉛様の低分子に融合、連結、または成長させるための基礎を提供する1,3。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig01.jpg"> 図 1: XChem パイプライン このプラットフォームは、プロジェクトの提案からサンプルの準備、データ収集、ヒットの識別まで、概略的に表現されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig02.jpg"> 図2:スクリーニング戦略。 ワークフローは、各マイルストーンの目的、実験の要件、および決定ポイントを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig03.jpg"> 図3:サンプル前処理のワークフロー。 サンプル調製の重要なステップは、SQLiteデータベースに記録されている各ステップの情報で表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig04.jpg"> 図4:XCEを用いたデータ解析 データ分析の重要なステップは、関連するソフトウェアパッケージを含むワークフロー図で表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig05.jpg"> 図5:XChemユーザープログラムの進化:このグラフは、2015年から2019年にかけてのユーザープログラムの採用と統合を示しており、2019年のBAGの作成と、2020年のCOVID-19パンデミックによるプラットフォームの回復力を示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62414/62414fig06.jpg"> 図6:XChemフラグメントスクリーニングの代表的な結果。 SARS-CoV2メインプロテアーゼ(Mpro)二量体は表面で表され、活性部位ヒットは黄色、推定アロステリックヒットはマゼンタ、表面/結晶充填アーチファクトは緑色で示されています。この図は、グループ堆積G_1002156のChimeraおよびMpro PDBエントリを使用して作成されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62414/62414fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

このホワイトペーパーでは、水晶ベースのフラグメントスクリーニングのための完全なXChemプロセスについて、アクセスの申請から始まり、その後のデータ配布までのすべてのステップについて説明します。

ダイヤモンド光源のXChem施設における効率的なフラグメントスクリーニングの実現

In fragment-based drug discovery, hundreds or often thousands of compounds smaller than ~300 Da are tested against the protein of interest to identify ...

Diamond Light SourceのXChem施設は、日常的に大規模な結晶グラフィックフラグメントスクリーニングを提供し、結晶から堆積プロセス全体をサポートします。X線結晶構造解析は、FBDDツールキットに不可欠な要素です。弱い結合体を同定するのに十分な感度を持ち、分子レベルでの相互作用に関する構造情報を直接得ます。フラグメントベースの創薬は、リード創薬に広く使用されている戦略です。これまでに6つの医薬品を臨床用に供給し、50以上の分子が臨床試験に進んでいます。XChemプラットフォームがもたらす進歩と効率性が、従来の浸漬方法、データ収集、分析方法に及ぼす影響は、視覚的に最もよく実証されています。まず、結晶と化合物の位置を選択します。PCからTextRankを開き、右下のリストから、または左上のボックスにバーコードを入力して、クリスタルトレイを選択します。正しい画像形式とシングルウェルビューを選択します。結晶に当たらずに溶媒や化合物を液滴に添加するには、液滴内を右クリックしますが、液滴画像内を移動しながら実験に適した結晶が見つかった場合は、結晶から離れます。Echoソフトウェアを開き、[新規]を選択して、アコースティックディスペンサーを使用して溶液をディスペンスします。正しいソースウェルプレートと液体クラスを選択してください。正しいプレート タイプがデスティネーション プレートとして選択されていることを確認します。次に、カスタムボックスをオンにして続行します。[インポート] を選択し、関連するバッチ ファイルを選択します。次に、ソフトウェアの指示に従ってインポート手順を完了します。プレートマップを使用して、分注する溶液と供給先を確認します。次に、表示されるプロンプトに従ってプロトコルを実行します。ソースプレートからの溶液は、選択した結晶滴に分配されます。プレートをインキュベーターに必要時間保管します。半自動結晶採取装置を使用して結晶を採取するには、ワークフロー開始ボタンを押して、最初に選択したウェル位置に移動します。結晶が残っている場合は、ループに取り付けて液体窒素に突入し、リストの最初のパックの1番目の位置に配置します。インターフェイスから水晶振動子の適切な説明を選択します。滴がコンパウンドソークの場合は、コンパウンドの状態の説明を記録します。水晶振動子が正常にマウントされた場合は「マウント済み」を選択し、そうでない場合は「失敗」を選択します。結晶が収穫されたら、パックをバーコードスキャナーに持って行き、一度に1つずつホルダーに入れてパックをスキャンし、バーコードをピンで留めます。スキャンが完了したら、パックに蓋をして液体窒素貯蔵デュワーに保管します。中心がずれたサンプルを回収するには、ISPyBのサンプルチェンジャービューで[rank by AP resolution]を選択し、緑から赤への色目盛りで自動処理された解像度でサンプルをグレーディングします。サンプルをクリックして、赤または黄色のサンプルを確認します。次に、結晶のスナップショットをチェックして、水晶が中央に配置されているかどうかを確認します。XChem Explorer または XCE を使用して Diamond の自動処理結果を取得および分析するには、ターミナルでサブフォルダー processing に移動し、エイリアス XCE を使用して XChem Explorer を開きます。[概要] タブの [データ ソースからテーブルを更新] ボタンを選択して、実験データの概要を更新します。[設定] タブで、データ収集ディレクトリを選択し、[データセット] タブを開きます。[ターゲットの選択] ドロップダウンメニューからターゲットを選択し、[データセット] ドロップダウンメニューから [自動処理から新しい結果を取得] を選択して、[実行] をクリックします。ディンプルを使用して初期マップを計算するには、マップタブを開き、ドロップダウンメニューから参照モデルを選択して目的のデータセットを選択し、選択したMTZファイルに対してDimpleを実行します。リガンド拘束を生成するには、目的のデータセットを選択し、マップと拘束ドロップダウンから選択した化合物のSCF、PDB、またはPNGファイルを作成します。Panda を使用してヒットを識別するには、 [Pandas] タブを選択し、出力ディレクトリが正しく定義されていることを確認して、panda を実行します。[ヒット識別]ドロップダウンメニューから分析します。Panda によって識別されたヒットを分析するには、panda を実行します。[Hit Identification] ドロップダウンメニューから inspect を実行します。PandaコントロールパネルでCootを開きます。イベントマップおよびモデルと比較するためのディンプルからのロード平均および2mFo-DFcマップ。リガンドがフィットしたら、バインドされた状態モデルへの変更が失われないように、別のイベントに移動する前に、リガンドをモデルとマージしてモデルを保存をクリックします。イベント・コメント・フィールドを使用してバインディング・イベントに注釈を付け、レコード・サイト情報を使用してバインディング・サイトに注釈を付けます。すべての実行可能なリガンドがモデル化され、マージされ、イベントマップに基づいて保存されたら、panda.inspectを閉じます。Panda inspectモデルをプロジェクトディレクトリにエクスポートし直し、選択したデータセットのリファインメントの最初のラウンドを開始すると、リファインメントがリファインメントタブに表示されます。X線結晶構造解析によるフラグメントスクリーニング用のXChemパイプラインは大幅に合理化され、科学界による採用が可能になりました。このチャートは、2015年から2019年にかけてのユーザープログラムの取り込みと統合を示しており、2019年のブロック割り当てグループの作成と、2020年のCOVID-19パンデミックによるプラットフォームの回復力を示しています。キャンペーンが成功すると、標的タンパク質上の潜在的な相互作用部位の3次元マップが得られます。典型的な結果は、SARS-CoV-2の主要なプロテアーゼのXChemスクリーニングです。酵素活性部位やサブポケットなどの既知の関心部位は黄色で示されています。タンパク質間相互作用に関与するものなどの推定アロステリック部位はマゼンタで示され、一般に偽陽性と見なされる結晶パッキング界面は緑色で示されています。歴史的に、結晶構造解析を主要なフラグメントスクリーニングとして使用することは困難でした。この研究では、サンプル調製から最終構造までのXChemパイプラインプロトコルを文書化しました。結晶学的フラグメントスクリーニングは、他の生物物理学的手法を補完するものであり、通常、フラグメントヒットをリード化合物に進行させるために不可欠です。あらゆる創薬ターゲットクラスに適用できます。

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本稿では、光量子ソースでGSECARS 13-BM-Cのビームラインでダイヤモンドアンビルセルを用いて単結晶X線回折実験を行うための詳細な手順について説明します。 ATREX及びRSVプログラムは、データを分析するために使用されます。...

PX ^ 2の高圧単結晶回折

肺炎球菌から炭水化物基質結合タンパク質の豊富な生化学的および構造解析を実行するための合理化されたプロトコルが表示されます。...

炭水化物輸送基質結合タンパク質 SP0092 の生化学的および構造特性

ビームライン セットアップ ラウエ (多色放射) または回折 (単色放射) を使用して単一の結晶または粉末試料の急速な二次元 x 線蛍光と x...

・鉱物及び岩石試料の蛍光を放射光 x 線回折

ここでは、いくつかの放射光ビームラインで自動スクリーニングおよびデータ コレクションは、使用可能なオプションを使用する方法をについて説明します。科学者が、放射光に冷凍サンプルを送る回折特性を上映、データ...

完全自律型の特性と生体高分子の結晶からのデータ収集

ダイヤモンドビームラインI24でのシリアルシンクロトロン結晶学用の固定対象サンプル調製、データ収集、データ処理に関する包括的なガイドを提供します。...

ダイヤモンド光源での固定ターゲットシリアルデータ収集

ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンでの結晶学的断片スクリーニングは、専用の複合ライブラリ、結晶処理ツール、高速データ収集機能、および大部分が自動化されたデータ分析を含むワークフローを使用して行われます。提示されたプロトコルは、下流の構造ベースのリガンド設計の有望な出発点を提供するために、このような実験の出力を最大化することを意図しています。...

ヘルムホルツ・ツェントルムベルリンにおける結晶学的フラグメントスクリーニングのワークフローとツール

データの信号対雑音比は、マイクロクリスタルからのX線回折測定を行う上で最も重要な考慮事項の1つです。VMXmビームラインは、このような実験のための低ノイズ環境とマイクロビームを提供します。ここでは、VMXmおよび他のマイクロフォーカス高分子結晶結晶ビームライン用のマイクロ結晶を取り付け、冷却するためのサンプル調製方法について述べる。...

VMXmビームラインにおける微結晶のサンプル調製パイプライン

ここでは、長波長高分子X線結晶構造解析実験のために、ダイヤモンド光源のビームラインI23上の真空端局への極低温サンプル調製および結晶の移送のためのプロトコルを提示する。...

ダイヤモンド光源におけるビームラインI23上の真空中長波長結晶構造解析のためのサンプル調製および移送プロトコル

標的タンパク質の溶融温度の変化をモニタリングする(すなわち、熱シフトアッセイ、TSA)は、数百化合物の断片ライブラリーをスクリーニングするための効率的な方法である。フラグメントスクリーニング用の固有トリプトファン蛍光と光逆散乱をモニタリングするためのロボット工学支援ナノ微分走査蛍光測定(nano-DSF)を実装するTSAプロトコルを発表する。...

フラグメントベースのリード発見におけるスクリーニングのためのナノ差動走査フルオリメトリー

ここでは、EMBLグルノーブルのHTX研究所でCrystalDirect技術に基づくタンパク質から構造への自動高分子結晶学パイプラインの使用方法、迅速なリガンド-タンパク質複合体分析、大規模なフラグメントスクリーニングの方法について説明します。...

グルノーブルのEMBL HTX施設における自動結晶学パイプライン

ハーウェル研究施設の結晶化施設を使用したタンパク質の結晶化のプロトコルと、その後のダイヤモンドの多用途高分子結晶構造解析in...

Harwellの結晶化施設とダイヤモンド光源Beamline VMXiを用いた結晶化とその 場 室温データ収集

学ぶXChem施設の結晶ベースフラグメントスクリーニング手法。X線結晶構造解析を用いて分子相互作用を可視化し、創薬研究における弱い結合分子の同定とリード化合物発見を効率化するプロセスを解説します。

ダイヤモンド光源のXChem施設における効率的なフラグメントスクリーニングの実現

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