Name: 神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 学ぶ神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル構築法。MYCNとLMO1の過発現により転移機構をリアルタイムで可視化し、小児がん研究や創薬スクリーニングへの応用が可能です。

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この研究は、国立がん研究所からの助成金R01 CA240323(S.Z.)によって支援された。米国国防総省(DoD)からの助成金W81XWH-17-1-0498(S.Z.)。V Foundation for Cancer Research(S.Z.)のV奨学生賞とMayo Center for Biomedical Discovery(S.Z.)のプラットフォーム助成金。メイヨークリニックがんセンターと個別化医療センター(S.Z.)からの支援。

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

ゼブラフィッシュは、メンテナンスの容易さ、堅牢な再生、in vivoイメージングの明確な利点などの明白な理由から、過去数十年間、特にがん研究で一般的に使用されてきました1,28。ゼブラフィッシュモデルは、大規模な遺伝学的研究のために、ラットやマウスなどの哺乳類モデル生物をうまく補完する外部受精および発達のために、胚的に容易に操作することができます1,2,3。さらに、ゼブラフィッシュゲノムはヒトゲノムと高いレベルの類似性を有する。ゼブラフィッシュゲノムの詳細な注釈をヒト参照ゲノムと比較すると、ヒト遺伝子の約70%がゼブラフィッシュオルソログ29を得ることが示されている。さらに、研究におけるゼブラフィッシュの他の用途は、個別化がん治療のための創薬および患者アバターに拡張されて...

ゼブラフィッシュは広く使用されており、特に癌において、いくつかの研究分野に適用されています。このモデルは、堅牢な再生、費用対効果の高いメンテナンス、腫瘍の成長と転移の汎用性の高い視覚化など、多くの利点を提供し、ゼブラフィッシュを腫瘍形成と転移の細胞および分子基盤を研究および調査するための強力なツールにします。大規模なゲノムマッピング、トランスジェネシス、遺伝子の過剰発現またはノックアウト、細胞移植、および化学スクリーニングのための新しい技術は、ゼブラフィッシュモデルの力を非常に増強しました1。過去数年間、白血病、黒色腫、横紋筋肉腫、肝細胞癌を含むがこれらに限定されない様々なヒト癌の腫瘍形成および転移を研究するために、多くのゼブラフィッシュ系統が開発されてきた2,3,4,5。さらに、神経芽細胞腫(NB)の最初のゼブラフィッシュモデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で末梢交感神経系(PSNS)において癌遺伝子であるMYCNを過剰発現させることによって生成された。このモデルでは、活性化ALKがMYCNと相乗作用して腫瘍発症を加速し、vivoでの腫瘍浸透度を高めることができることがさらに実証されました6。
NBは神経堤細胞の交感神経副腎系譜に由来し、小児において転移性の高い癌である7。小児がん関連死の10%を占めています8。診断時に広く転移したNBは、主にPSNS9,10の交感神経節および副腎髄質の鎖に沿って起源とする腫瘍として臨床的に提示され得る。MYCN増幅は、NB患者における転帰不良と一般的に関連している11、12。さらに、LMO1は高リスク症例において重要なNB感受性遺伝子として同定されている13,14。ゼブラフィッシュモデルのPSNSにおけるMYCNとLMO1のトランスジェニック共発現は、NBの早期発症を促進するだけでなく、高リスクNB13患者で一般的に見られる部位に類似した組織および器官への広範な転移を誘導することも研究によって見出された。ごく最近、NBの新しいゼブラフィッシュモデルでもNBの別の転移表現型が観察されており、RNA結合タンパク質をコードするMYCNとLin28Bの両方がdβhプロモーターの制御下で過剰発現している16。
ゼブラフィッシュにおける安定したトランスジェニックアプローチは、目的の遺伝子の過剰発現が正常な発育および疾患の病因に寄与するかどうかを研究するためによく使用されます14,15。この技術は、NB腫瘍形成に対する複数の遺伝子および経路の重要性を実証するために首尾よく使用されている6、16、17、18、19、20。本稿では、PSNSにおいてMYCNとLMO1の両方を過剰発現するトランスジェニックフィッシュラインがどのように作られたのか、そしてこれら2つのがん遺伝子の協力がNB腫瘍形成と転移の発症を加速させることがどのように実証されたかを紹介します13。まず、dβhプロモーターの制御下でEGFP-MYCNを過剰発現するトランスジェニック株(MYCN株と命名)を、先に説明したように、dβh-EGFP-MYCN構築物を野生型(WT)AB胚の1細胞段階に注入することによって開発した6,17。PSNSでLMO1を過剰発現する別のトランスジェニック株(LMO1株と命名)は、2つのDNA構築物dβh-LMO1と dβh-mCherryをWT胚に1細胞段階で同時注入することによって開発された13。共注入された二重DNA構築物が魚のゲノムに共統合され得ることが以前に実証されている。したがって、LMO1およびmCherryは、トランスジェニック動物のPSNS細胞において共発現される。注入されたF0胚が性的成熟に達すると、それらはWT魚と交配され、導入遺伝子が組み込まれた陽性魚の同定が行われた。簡単に説明すると、F1の子孫を、PSNS細胞におけるmCherry発現について蛍光顕微鏡によって最初にスクリーニングした。mCherry陽性魚類におけるLMO1の生殖細胞系列の組み込みを、ゲノムPCRおよびシーケンシングによってさらに確認した。各トランスジェニック系統の同定に成功した後、ヘテロ接合型MYCNおよびLMO1トランスジェニック魚の子孫を交配して、MYCNおよびLMO1の両方を発現する複合魚系統(MYCNと命名;LMO1 行)。担癌性MYCN;LMO1魚類を隔週で蛍光顕微鏡によりモニターし、原発部位から離れた領域、腎間領域(IRG、ヒト副腎のゼブラフィッシュと同等)における転移性腫瘍の証拠について13。MYCNにおける腫瘍の転移を確認するために;LMO1魚類、組織学的および免疫組織化学的分析を適用した。

<table><tbody><tr><td>3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)ベクトルキット</td><td>ベクトル</td><td>SK-4100</td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック/アクロス有機</td><td>64-19-7</td><td></td></tr><tr><td>アガロースGP2</td>中<td>西部科学</td><td>009012-36-6</td><td></td></tr>抗<tr><td>チロシンヒドロキシラーゼ(TH)抗体</td><td>ペルフリーズ</td><td>P40101</td><td></td></tr>ア<tr><td>ビジン/ビオチンブロッキングキット</td><td>ベクトルSP-2001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BOND Intense R Detection</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>DS9263</td><td></td></tr><tr><td>BOND 一次抗体希釈剤</td><td>ライカバイオシステムズニューカッスル</td><td>AR9352</td><td></td></tr><tr><td>BOND-MAX IHC装置</td><td>ライカバイオシステムズ・ニューカッスル(株)</td><td>N/A</td><td>全自動IHC染色システム</td></tr><tr><td>CH211-270H11 BACクローン</td><td>BACPACリソースセンター(BRFC)</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>DP71カメラ搭載化合物顕微鏡</td><td>Olympus</td><td>AX70</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL (キシレンベースの封入剤)</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8312-4</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Leica</td><td>3801601</td><td>ready-to-use (準備不要)</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Carolina</td><td>86-1263</td><td></td></tr><tr><td>Expand Long Template PCR System</td><td>Roche Applied Science, IN 11681834001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gateway BP Clonase II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11789-020</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR Clonase II enzyme mix</td><td>Invitrogen, CA</td><td>11791-100</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗Rb二次抗体(ビオチン化)</td><td>Dako</td><td>E0432</td><td></td></tr><tr><td>ヘマトキシリン溶液、ハリス修正</td><td>シグマ アルドリッチ ケミカル カンパニー / SAFC</td><td>HHS-32-1L</td><td></td></tr><tr><td>HRP アビジン D</td><td>ベクター</td><td>A-2004</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>アクア ソリューション</td><td>4360-1L</td><td></td></tr><tr><td>過酸化水素、3%</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>H324-500</td><td></td></tr><tr><td>I-SceI 酵素</td><td>ニューイングランド バイオラボ、マサチューセッツ</td>州 <td>R0694L</td><td></td></tr><tr><td>硫酸カナマイシン</td><td>テクノバ(株)</td><td>K2150</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>炭酸リチウム</td><td>Sigma Aldrich Chemical Company Inc. / SAFC</td><td>554-13-2</td><td></td></tr><tr><td>切片化用ミクロトーム</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>ワンショット TOP10 Chemically Competent&nbsp;E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C404006</td><td></td></tr><tr><td>p3E-polyA</td><td>&nbsp;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>a 寛大な贈り物 (資料を入手するには、説明されているように自由に配布できるウェブページ http://tol2kit.genetics.utah.edu/index.php/Main_Page を参照してください。</td></tr><tr><td>パラフィンワックス</td><td>Surgipath Paraplast</td><td>39603002</td><td>パラフィンからパラフィンへ</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11313</td><td></td></tr><tr><td>pDEST ベクター (I-SceI 認識部位を含む修正された目的地ベクター)</td><td>Dr. C. Grabher, Karlsruhe Institute of Technology, Karlsruhe, Germany</td><td>N/A</td><td>a 寛大な贈り物</td></tr><tr><td>pDONR 221 ゲートウェイ ドナー ベクター</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12536-017</td><td></td></tr><tr><td>pDONRP4-P1R ドナーベクター</td><td>&nbsp;Dr. Chi-Bin Chien, Univ. of Utah</td><td>N/A</td><td>a a 寛大な贈り物</td></tr><tr><td>フェノールレッド、0.5%</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>&nbsp;P0290</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)、10X</td><td>BioRad</td><td>1610780</td><td></td></tr><tr><td>Picrosirrius 赤染色キット</td><td>Polysciences</td><td>24901-250</td><td></td></tr><tr><td>pME-mCherry</td><td>Addgene</td><td>26028</td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K、組換え、PCR グレード</td><td>Roche</td><td>21712520</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin MiniPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>RDO急速脱灰剤</td><td>Apex Enginerring</td><td>RDO04</td><td></td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム (NaN3)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>26628-22-8</td><td></td></tr><tr><td>実体蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>MZ10F</td><td></td></tr><tr><td>デジタルサイトを搭載した立体蛍光顕微鏡 DS-U1 イメージング用</td>カメラ <td>Nikon</td><td>SMZ-1500</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs, MA</td><td>M0273L</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュテックVIP&reg;&nbsp;6 AI 真空浸透プロセッサ</td><td>さくら</td><td>N/A</td><td>モデル #: VIP-6-A1</td></tr><tr><td>Tricaine-S</td><td>Western Chemical Incorporated</td><td>20513</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック X3P1GAL</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

ゼブラフィッシュは、ヒトの疾患、特に癌を研究するための重要な動物モデルとして浮上している。ゼブラフィッシュのモデリングに適用される堅牢なトランスジェニックおよびゲノム編集技術に加えて、メンテナンスの容易さ、高収率の生産性、および強力なライブイメージングにより、ゼブラフィッシュは、このプロセスの根底にある転移および細胞および分子基盤をインビボで研究するための貴重なモデルシステムとなっています。転移の最初のゼブラフィッシュ神経芽細胞腫(NB)モデルは、ドーパミン-β-ヒドロキシラーゼ(dβh)プロモーターの制御下で、2つの癌遺伝子、MYCNおよびLMO1を過剰発現させることによって開発された。MYCNおよびLMO1を共発現させることは、神経芽細胞腫形成の潜伏期間の減少および浸透度の増加、ならびに腫瘍細胞の遠隔転移の加速をもたらした。この新しいモデルは、臨床的に関連する遺伝子改変および転移関連遺伝子改変の関与を含む、ヒト転移性NBの多くの重要な特徴を確実に繰り返している。インビボでの転移の自然および自発的な発生;転移の保存された部位。したがって、ゼブラフィッシュモデルは、インビボでの腫瘍転移の複雑なプロセスを解剖するユニークな利点を有する。

LMO1がMYCNと相乗作用してNBの病因に影響を及ぼすかどうかを決定するために、dβhプロモーターの制御下にあるPSNS細胞におけるLMO1(dβh:LMO1およびdβh:mCherry)またはMYCN(dβh:EGFP-MYCN)のいずれかの発現を駆動するトランスジェニック構築物をゼブラフィッシュ胚に注入した13。 図1Aに例示されるように、安定なトランスジェニック株の発達およびそれらの遺伝子型の検証の後、ヘテロ接合型MYCNおよびLMO1魚が交配された。彼らの子孫は、それぞれ1dpfまたは3-4dpfでMYCN(EGFP+)またはLMO1(mCherry+)発現についてソートされた。MYCN過剰発現はPSNSの発達を抑制することが示されている6。し...

本稿では、神経芽細胞腫のゼブラフィッシュモデル、特に自発的に転移を発症する MYCN および LMO1の過剰発現を伴うトランスジェニックゼブラフィッシュ系統における腫瘍転移をリアルタイムで発生、特徴付け、および追跡する方法を紹介する。

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

これらの方法は、神経芽細胞腫転移の最初のゼブラフィッシュモデルを開発するために使用された。そして、このモデルが神経芽細胞腫のリスクが高い患者に見られる転移の多くの特徴を忠実に再現できることを実証する。この転移性ゼブラフィッシュモデルの主な利点は、腫瘍播種をリアルタイムでin vivoでイメージングして、転移がいつ、そしておそらくどのように起こるかをよりよく理解できることです。この技術は神経芽細胞腫に特有のものではありません。これは、腫瘍細胞が同定され、追跡され、一連の可能性につながる限り、多様なタイプの癌のゼブラフィッシュモデルに適用することができる。まず、MYCNとLMO1トランスジェニック系統を交配させることによって、MYCNとLMO1の両方を過剰発現するヘテロ接合型トランスジェニック魚系統を開発する。受精後のある日、実体蛍光顕微鏡を使用して、EGFP発現のためのアウトクロスの子孫を分類し、EGFP陽性点として提示する。選別後、スクリーニングした胚を別々のペトリ皿に単離し、皿をMYCN陽性またはMYCN陰性としてラベル付けする。受精後3~4日でLMO1発現について両群の胚を可視化・選別する。上頸部神経節と非PSNSドーパミン作動性神経細胞の両方、特に後脳の延髄質に赤い蛍光斑点を探してください。胚が受精後5日に達する前にスクリーニングを行う。次に、選別した魚を異なる遺伝子型の4つのグループに分離し、MYCNのみ、LMO1のみ、MYCNおよびLMO1の両方および野生型としてラベル付けする。標準プロトコルに従って同じ条件でそれらを育てます。両側の金属ヘラで魚を優しくひっくり返して実体蛍光顕微鏡で腫瘍を可視化し、腫瘍を表示します。可能性のある腫瘍性魚を同定した後、生年月日、腫瘍がスクリーニングされた日付、および遺伝子型を含む適切なラベルでそれらを別のタンクに単離する。受精後6週間で、前のステップを繰り返して、担がん魚と非担がん魚をスクリーニングし、以前にスクリーニングした魚の腫瘍の存在を確認するか、または新しい可能性のある担がん魚を同定する。蛍光陽性塊の持続または増加したサイズを探し、腫瘍を有する魚を確認した。担がん魚を同定した後、腫瘍細胞遊走の証拠について隔週でそれらを監視しますが、これは腫瘍発生の原発部位から遠く離れた小さなEGFPまたはmCherry陽性腫瘍塊として提示されます。必要に応じてこれらの魚を別々のタンクに隔離し、転移の可能性を示すために適切にラベルを付けます。LMO1魚類におけるヘテロ接合型MYCNを解釈した後、それらの子孫を選別しながら、受精後1日で非PSNSドーパミン作動性神経細胞においてEGFP MYCN発現が顕著であった。対照的に、LMO1発現は、PSNS細胞および非PSNSドーパミン作動性ニューロン細胞の両方で顕著であった。蛍光陽性腫瘍塊は、MYCNおよびLMO1の両方の過剰発現を有する化合物トランスジェニック魚の原発腫瘍部位から離れた器官の組織において検出されたが、MYCN単独の発現を有するトランスジェニック魚では検出されなかった。手術切片のH&E染色は、原発性腫瘍が神経芽細胞腫患者における原発疾患の最も一般的な部位であるヒト副腎と同等のゼブラフィッシュである腎間領域から生じたことを示している。腎間腺から離れた腫瘍塊は、腎臓の遠位部、眼窩、えら、脾臓、および心臓の心房室の内壁を含む複数の領域で検出された。原発巣および全ての転移部位における腫瘍細胞のPSNS神経芽細胞系統が確認された。有意に増幅された量およびPSR染色コラーゲン線維の厚さの増加は、MYCNのみを発現する腫瘍と比較した場合、MYCN LMO1腫瘍において見出された。この手順を使用した後、薬物スクリーニングおよび新規がん治療法の試験を適用することができ、転移性がんを予防および治療するための代替薬剤の開発につながる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、トランスジェニックゼブラフィッシュ胚の周辺領域への乳がん細胞送達のためのマイクロインジェクション方法を説明しています。インキュベーション後、蛍光顕微鏡で胚を可視化し、がん細胞の浸潤、播種、転移を観察します。...

zPDX-侵襲性の解析:ゼブラフィッシュ胚異種移植片における転移性がん細胞の侵襲性挙動の調査

ゼブラフィッシュ土着腫瘍モデルを用いてメラノーマ修飾するための画面への迅速な方法が提示される。これは、メラノサイト内の候補メラノーマの遺伝子の発現を可能にminiCoopRベクトルを利用しています。メラノーマフリー生存曲線、浸潤アッセイ、スケールメラノサイトおよびメラノーマ移植アッセイの抗体染色のためのプロトコルを取得するための方法が記載されている。...

ゼブラ土着腫瘍モデルを用いたメラノーマの修飾のためのスクリーニング

この研究の目標は、ゼブラフィッシュにおけるモザイク導入戦略がどのように使用され、生体内での腫瘍の開始と進行における複数のがん遺伝子の相対的な寄与を迅速かつ効率的に評価できるかを示すことです。...

腫瘍の病因に候補協同遺伝子の機能ゲノム解析のためのモザイクゼブラフィッシュ遺伝子導入

この方法は、効果的に癌細胞の血管の浸潤能をテストするためにゼブラフィッシュ胚を利用します。蛍光性の癌細胞は、心臓前方の洞または胚の開発の卵黄嚢に注入されます。癌細胞血管浸潤と血管外漏出は、24から96時間後に尾部領域の蛍光顕微鏡によって評価します。...

（ゼブラフィッシュにおける癌細胞の血管浸潤能をテストします<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;）

ここでは、侵襲的な行動を調査し、それぞれ、ヒト乳癌細胞の脈管内および血管外漏出の可能性を評価するために、二つの異なる注射部位、 すなわち、卵黄周囲のスペースとキュビエのダクトを使用して異種移植ゼブラフィッシュモデルを記述します。...

胚ゼブラフィッシュにおけるヒト乳癌細胞の浸潤挙動

癌細胞の移植は、癌のメカニズムおよび治療応答の同定のための重要なツールである。現在の技術は免疫不全動物に依存する。ここでは、腫瘍細胞の挙動およびインビボでの薬物応答の長期解析のために、ゼブラフィッシュ腫瘍細胞を免疫コンピテント胚に移植する方法を説明する。...

腫瘍細胞の挙動および薬物応答の長期的研究のためのゼブラフィッシュ小児脳腫瘍の免疫適格宿主への移植

ここでは、胚の動きを可視化する携帯電話の電気電圧記者ゼブラフィッシュ...

ゼブラフィッシュ初期胚および腫瘍の細胞の電気的活動の可視化

ここでは、異種移植片を生成するためのヒントと腫瘍行動分析、全実装免疫蛍光、共焦点イメージング定量のためのガイドラインを含むステップバイステップのプロトコルを提供します。...

ゼブラフィッシュラーバル異種移植片の生成と腫瘍行動解析

脊椎動物の脳組織に侵入する膠芽腫(GBM)細胞における微小管動態のライブイメージングを可能にする技術を報告する。蛍光タグ付きGBM細胞の透明なゼブラフィッシュ脳への同所性注射と高解像度の生体内イメージングを組み合わせることで、 in situ...

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透明ゼブラフィッシュ胚の卵黄への異種移植のプロトコルについて、シンプルで迅速な病期分類法によって最適化されています。注射後の解析には、生存率と、フローサイトメトリーによる異種移植細胞の疾患負荷の評価が含まれます。...

透明ゼブラフィッシュ胚における腫瘍異種移植解析のための簡便、迅速、効果的な方法

学ぶ神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル構築法。MYCNとLMO1の過発現により転移機構をリアルタイムで可視化し、小児がん研究や創薬スクリーニングへの応用が可能です。

神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル

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