Name: マウス間質弁細胞の分離を用いて大動脈弁の石灰化を 研究 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学ぶマウス大動脈弁細胞の2段階コラゲナーゼ分離法。石灰化の分子メカニズムを解明し、大動脈弁狭窄症の治療標的探索に貢献する重要な手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

注:ここで説明されているすべての動物の手順は、マウントシナイ機関コアと使用委員会のIcahn医学部によって承認されています。
1. 成体マウスからの弁細胞分離前の調製
<ol><li>図1Aに示す手術器具をすべて洗浄し、70%のv/vエタノールを使用し、その後30分間オートクレーブして、70%エタノールで手術用ワークスペースを洗浄します。</li>
	<li>500 μLのペニシリンストレプトマイシンを50 mLの10 mm HEPESに加えます。50 mLの 1x リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) のアリコートを準備します。氷の上にソリューションを維持します。</li>
	<li>1 mg/mLおよび4.5 mg/mLコラゲナーゼ溶液を調製し、15 mLチューブ内の各溶液の5 mLを使用して、全手順を実行します。1 mg/mLコラゲラーゼの5 mLを調製するには、5 mgのコラゲラーゼと2.5mLのダルベックコの変性イーグル培地(DMEM、ウシ胎児血清(FBS)フリー))と10mM HEPESの2.5 mLを抗生物質(1%ペニシリン・ストレプトマイシンステップ1.2から)を混ぜます。0.22 μmフィルターでソリューションをフィルター処理して、汚染を除去します。 注:酵素を保護するために氷の上にソリューションを保管してください。</li>
	<li>DMEM溶液を37°Cに温め、下記のすべてのステップで使用してください。DMEMを1%ペニシリンストレプトマイシン、1%ピルビン酸ナトリウム、200 mM L-グルタミンの5 mL、マイコプラズマ除去試薬1 mL( 材料表を参照)、FBS 10% で完全培地を調製します。</li>
</ol>2. バルブセルの分離
<ol><li>実験のために106 細胞を得るために、5つの8週齢のマウス(最低3匹)を使用する。イオブルランの1 mLを浸したティッシュペーパーの小片と一緒に誘導チャンバーにマウスを置くが、組織との接触を許可しない。動物が完全に麻酔されていることを確認する。つま先のピンチ反射をチェックし、子宮頸部脱臼によってマウスを安楽死させる。後述の手順が終末であるように、子宮頸部転位前の痛みを軽減するためにイオブルランを使用する。</li>
	<li>解剖プラットフォーム上にマウスを置き、それを所定の位置に保持するためにカニューレで足を固定します。胸と腹部をエタノールで洗浄します。腹部と胸をはさみで開きます。小さな外科用ハサミで、左心房と左心室の間を切り取り、マウスを外装する。心臓から血液を除去するために10 mLの冷たい1x PBSで心臓を浸透させます。</li>
	<li>心臓を切り、図1Bに示すように、上がりの大オルタから3mmを保ちます。大動脈弁を実体顕微鏡で解剖する。心室の中央に心臓を水平に切り取る(図1C)。左心室を大動脈に向かって切り、大動脈弁を慎重に解剖する(図1D-F)。小さい35 mmティッシュ培養皿の中に弁を一緒にプールしなさい。</li>
	<li>分離弁を75mm細胞培養皿で洗浄し、5 mLの冷たいHEPES(10 mM)に抗生物質(1%ペニシリンストレプトマイシン)を加えて血液を除去する(図2)。ステップ1.3で上述したようにコラゲナーゼ1mg/mLと4.5mg/mLの2つの15 mLチューブを調製します。 注:解剖後、無菌バイオセーフティフード内の隔離されたバルブを操作して、汚染を最小限に抑えます。</li>
	<li>コラゲターゼタイプI(1mg/mL)でバルブを37°Cで30分間連続揺動してインキュベートする(図2)。チューブを150×gで5分間遠心し、2mLのHEPES(10mM)で1回ペレットを洗浄し、渦を30s高速で30sで洗浄します。 このチューブの内容物を35mm培養皿に注ぎ、薄いピンセットを使って慎重に組織の断片を新しいチューブに移します。 注:この段階では、VICはまだ組織から解離されず、ペレットには組織の破片が含まれています。内皮細胞との汚染を避けるために、ステップ2.5で渦を巻いた後に遠心分離しないでください。</li>
	<li>37°CのコラゲターゼタイプI型5mL(4.5mg/mL)を35分間連続撹拌して15mLチューブにインキュベートします。細胞を1 mLピペットで再懸濁して細胞を分離し、遠心分離機を150×gで4°Cで5分間再中断します。 </li>
	<li>上清を捨て、ペレットを完全DMEMの2mLに再び懸濁します。遠心分離機150×gで5分間4°Cで5分間。 この手順を 2 回繰り返して、セルをクリーニングします。 注:ペレットにはまだいくつかの組織断片があります。</li>
	<li>ペレットを完全培地1 mLに再懸濁し、培養皿への付着を容易にするために、6ウェル培養皿の1ウェルに細胞を最低量の培地でプレートします。細胞を、邪魔されずに、5%の二酸化炭素を含む37°Cインキュベーターに残す。</li>
	<li>3日後、顕微鏡下の細胞をチェックして、組織の破片に近い良好な成長を確認します。顕微鏡下で1,000個の細胞が見えるようになったら、オートクレーブされたピンセットで組織の破片を慎重に取り除き、培地を変えます。 注:プレートが邪魔されるべきではありません。必要な数の細胞が観察されない場合は、細胞培養皿をインキュベーターに2日間戻します。</li>
	<li>細胞が70%コンフルエント(2.5×105)である場合、トリプシン化し、75mmの組織培養皿に移します。</li>
</ol>3. 細胞の同一性と形態の解析
注:免疫蛍光染色は、細胞形態および内皮細胞汚染を研究するために使用された。
<ol><li>70%v/v/エタノールでフードを清掃してください。滅菌カバーリップ(22 mm x 22 mm)を6ウェルプレートに入れます。 注:カバーリップを殺菌するには、70%エタノールで洗浄し、紫外線の下で一晩フードに保管してください。</li>
	<li>6ウェルプレートに1ウェルあたり100,000個の細胞をシードします。24時間後、1x PBSで細胞を2回洗浄し、4%パラホルムアルデヒド(PFA)で20分間固定します。1倍PBSで細胞を再び2回洗います。 注:この時点で、細胞は染色手順の開始まで4°CでPBSに保つことができた。</li>
	<li>VICの純度を検証するには、Α平滑筋アクチン(αSMA)、ビメンチン、および分化31(CD31)のクラスターを使用して、VECによる汚染を検出する。</li>
	<li>500 μLの正常血清(二次抗体と同じ種)、9.5 mLの1x PBS、30 μLのTriton X-100を混合してブロッキングバッファーのアリコートを用意します。細胞を2mLのブロッキングバッファーに1時間インキュベートする。</li>
	<li>トリトンX-100の30μL、1x PBSの10 mL、および0.1gのウシ血清アルブミン(BSA)を含む抗体希釈バッファーを調製する。</li>
	<li>空のヒントボックスを取り、湿気の多い部屋を作成するために水で箱の半分を埋めます。チップホルダーを濡れたティッシュで覆い、次にパラフィルムのシートで覆います。</li>
	<li>1次抗体を1μLとし、ステップ3.5で調製した希釈バッファーの100 μLと混合します。50μLの希釈抗体をパラフィルムに配置します。ウェルからカバースリップを取り、それらをひっくり返し、抗体の滴の上に置きます。抗体で細胞を一晩インキュベートする。</li>
	<li>6ウェルプレートにPBS 1 mLを加えます。慎重にパラフィルムからカバースリップを取り出し、それをひっくり返し、井戸に置きます。細胞を5分間、穏やかな撹拌で洗浄します。PBS を新しい PBS に置き換えます。細胞を3回洗う。</li>
	<li>希釈した二次抗体(1/500)(Alexa-488、Alexa-555)を1時間インキュベートします。2次抗体の1 μLを抗体希釈バッファーの 500 μL に加えます(ステップ 3.5 で作成)。プレートをアルミホイルで覆います。連続撹拌で1mLの1x PBSで細胞を3回洗浄します。</li>
	<li>カバーリップを4′,6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)実装媒体の50 μLで取り付け、顕微鏡下で細胞を観察し、細胞の形態とVEC汚染を解析します。</li>
</ol>4. インビトロ 石灰化アッセイ
<ol><li>70%エタノールでフードを洗浄し、DMEM培地を37°Cに温めます。</li>
	<li>完全なDMEMで6ウェルプレートに100,000個の細胞/条件をシードし、37°Cで24時間培養します。</li>
	<li>2 mM の NaH2PO4、10-7 Mインスリン、および 5% FBS の DMEM で 50 μg/mL アスコルビン酸を混合して石灰化培地を調製します。DMEMの93 mLの場合、FBSの5 mL、抗生物質1mL(最終濃度1%)、ピルビン酸ナトリウム(100mM)の1mL、NaH2PO4の27.5mg、インスリン5.8μL、アスコルビン酸5mgを加えます。 注:使用前に0.22 μmフィルタを使用して溶液をフィルタリングしてください。</li>
	<li>24時間後、上清培地を石灰化媒体に交換する。37°Cで7日間細胞をインキュベートする。 3日目 に、新鮮な石灰化培地に交換し、プレートをインキュベーターに戻して7日間の治療を完了します。</li>
	<li>7日後、培地を取り出し、2mLの1xPBSで細胞を2回洗浄した。37°Cで24時間0.6 N塩酸(HCl)の1 mLで細胞をインキュベートする。 HClを1.5 mLチューブに集め、ロータリーエバポレーターで蒸発させ、HClの60 μLですべての管の内容物を再中断します。 注:乾燥手順は、溶液を集中させ、各条件に同じ体積を持つために重要です。</li>
	<li>96ウェルプレートを使用して、すぐに使用できるキットで入手可能なアルセナゾIII試薬を使用してカルシウム濃度を測定します(詳細については 、材料表 を参照)。</li>
	<li>10 mg/dL濃度のカルシウム標準溶液を調製します。水酸化カルシウム(OH)2の10mgを秤量し、100mLの蒸留水に溶解します。</li>
	<li>透明な96ウェルプレート、ブランク溶液(HCl、0.6 N)のピペット2 μL、標準溶液、ウェル当たりのサンプル(10mg/dL)、およびサンプル。三重で実験を行い、ピペットの変動性を確認します。各条件に対して200μLの試薬を加えます。 注:15mg/dLを超えるサンプルは、生理食塩水で1:1を希釈し、再アッセイし、結果に2を掛ける必要があります。</li>
	<li>反応を室温で15分間インキュベートします。 注:反応は60分間安定しています。</li>
	<li>650 nmでプレートの吸光度を読み取り、記録します。サンプル中のカルシウムの量を計算するには、次の式を使用します。 カルシウム(mg/mL)=(標準のサンプル/吸光度の吸光度)×標準の濃度</li>
</ol>

<ol><li>Rostagno, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+disease+in+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Heart valve disease in elderly.</a> World Journal of Cardiology. 11 (2), 71-83 (2019).</li>
<li>Stewart, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+factors+associated+with+calcific+aortic+valve+disease.+Cardiovascular+Health+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Clinical factors associated with calcific aortic valve disease. Cardiovascular Health Study.</a> Journal of the American College of Cardiology. 29 (3), 630-634 (1997).</li>
<li>Marquis-Gravel, G., Redfors, B., Leon, M. B., Généreux, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medical+treatment+of+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Medical treatment of aortic stenosis.</a> Circulation. 134 (22), 1766-1784 (2016).</li>
<li>Spitzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aortic+stenosis+and+heart+failure%3A+disease+ascertainment+and+statistical+considerations+for+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiac+Failure+Review%22%5BJournal%5D)">Aortic stenosis and heart failure: disease ascertainment and statistical considerations for clinical trials.</a> Cardiac Failure Review. 5 (2), 99-105 (2019).</li>
<li>Hinton, R. B., Yutzey, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+valve+structure+and+function+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heart valve structure and function in development and disease.</a> Annual Review of Physiology. 73, 29-46 (2011).</li>
<li>Simionescu, D. T., Chen, J., Jaeggli, M., Wang, B., Liao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Form+follows+function%3A+advances+in+trilayered+structure+replication+for+aortic+heart+valve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Healthcare+Engineering%22%5BJournal%5D)">Form follows function: advances in trilayered structure replication for aortic heart valve tissue engineering.</a> Journal of Healthcare Engineering. 3 (2), 179-202 (2012).</li>
<li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+platelets+promote+an+osteogenic+programme+and+the+progression+of+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Activated platelets promote an osteogenic programme and the progression of calcific aortic valve stenosis.</a> European Heart Journal. 40 (17), 1362-1373 (2019).</li>
<li>Rutkovskiy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Valve+interstitial+cells%3A+the+key+to+understanding+the+pathophysiology+of+heart+valve+calcification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Heart+Association%22%5BJournal%5D)">Valve interstitial cells: the key to understanding the pathophysiology of heart valve calcification.</a> Journal of the American Heart Association. 6 (9), (2017).</li>
<li>Bosse, Y., Mathieu, P., Pibarot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics%3A+the+next+step+to+elucidate+the+etiology+of+calcific+aortic+valve+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Genomics: the next step to elucidate the etiology of calcific aortic valve stenosis.</a> Journal of the American College of Cardiology. 51 (14), 1327-1336 (2008).</li>
<li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures%3A+Incidence%2C+sources%2C+effects%2C+detection%2C+elimination%2C+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li>
<li>Richards, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side-specific+endothelial-dependent+regulation+of+aortic+valve+calcification%3A+interplay+of+hemodynamics+and+nitric+oxide+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Side-specific endothelial-dependent regulation of aortic valve calcification: interplay of hemodynamics and nitric oxide signaling.</a> American Journal of Pathology. 182 (5), 1922-1931 (2013).</li>
<li>Bouchareb, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+strain+induces+the+production+of+spheroid+mineralized+microparticles+in+the+aortic+valve+through+a+RhoA%2FROCK-dependent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mechanical strain induces the production of spheroid mineralized microparticles in the aortic valve through a RhoA/ROCK-dependent mechanism.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 67, 49-59 (2014).</li>
<li>Lerman, D. A., Prasad, S., Alotti, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcific+aortic+valve+disease%3A+molecular+mechanisms+and+therapeutic+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22European+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Calcific aortic valve disease: molecular mechanisms and therapeutic approaches.</a> European Cardiology. 10 (2), 108-112 (2015).</li>
<li>Janssen, J. W., Helbing, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenazo+III%3A+an+improvement+of+the+routine+calcium+determination+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Chemistry+and+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Arsenazo III: an improvement of the routine calcium determination in serum.</a> European Journal of Clinical Chemistry and Clinical Biochemistry. 29 (3), 197-201 (1991).</li>
<li>Ortlepp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+serum+calcium+levels+are+associated+with+greater+calcium+hydroxyapatite+deposition+in+native+aortic+valves+of+male+patients+with+severe+calcific+aortic+stenosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Heart+Valve+Disease%22%5BJournal%5D)">Lower serum calcium levels are associated with greater calcium hydroxyapatite deposition in native aortic valves of male patients with severe calcific aortic stenosis.</a> Journal of Heart Valve Disease. 15 (4), 502-508 (2006).</li>
</ol>

本稿では、一次培養のためのマウス弁細胞分離の詳細なプロトコルを紹介する。8週齢のマウスから3つの大動脈弁をプールし、十分な数の細胞を得た。さらに、このプロトコルは、VIC表現型の特性評価と インビトロ 鉱化アッセイを記述する。 この方法は、マチューら7から先に説明したプロトコルから適応した。
大動脈弁の分離の間、細菌またはマイコプラズマの汚染から細胞を保護するために可能な伝染のすべての源を避けるために注意しなければならない。確かに、実験を開始する前にすべての外科ツールをオートクレーブすることが重要です。HEPES溶液は、細菌感染を最小限に抑えるために1%の抗生物質を補充する必要があります。さらに、マイコプラズマは細胞病理学を引き起こし、結果的に細胞培養10において測定されたすべてのパラメータを妨害する。
培養液の量が少ない小培養皿のめっき細胞は、VICの増殖および増殖にとって重要である。組織を落ち...

石灰化大動脈弁疾患(CAVD)は、西洋集団において最も一般的な弁膜心疾患であり、1歳の65歳以上の高齢者の2.5%近くに影響を及ぼす。CAVDは600万人以上のアメリカ人に影響を及ぼし、正常な血流を損なうリーフレットの機械的特性の変化に関連している-1,2.現在、疾患の進行を止めたり、ミネラル退縮を活性化したりする薬理学的治療法はない。CAVDを治療するための唯一の有効な治療法は、手術または経カテーテル大動脈弁置換術3による大動脈弁置換術である。したがって、新しい薬理学的標的を特定するためには、バルブの鉱物化につながる分子メカニズムを調査することが不可欠です。実際、非治療大動脈狭窄症は、左心室機能不全および心不全4のようないくつかの有害な結果を有する。
大動脈弁は、線維症、海綿体、心室症と呼ばれる3層から構成され、NICを主な細胞タイプ5として含んでいる。線維症と心室は血管内皮細胞(VEC)5の層で覆われている。VECは、炎症細胞の透過性とパラクリンシグナルを調節します。増加した機械的ストレスは、VECの完全性に影響を及ぼし、大動脈弁の恒常性を乱し、炎症細胞の浸潤につながる6.走査型電子顕微鏡分析は、ヒト石灰化大動脈弁7において破壊された内皮を示した。
石灰化組織の組織学的分析は、骨芽細胞および破骨細胞の存在を明らかにする。さらに、VICの骨形成分化は、インビトロおよびヒト弁組織8の両方で観察された。このプロセスは、主に、ラント関連転写因子2(Runx2)および骨形態形成タンパク質(BMP)8,9によって調整される。

<table><tbody><tr><td>3 mm刃ハサミ</td><td>F.S.T</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>抗アルファ平滑筋 アクチン抗体</td><td>アブカム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アンチマウス、アレクサ フルオア 488 コンジュゲート</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>4412</td><td></td></tr><tr><td>アルセナゾ-III試薬セット</td><td>ポイントサイエンティフィック</td><td>C7529-500</td><td>カルシウムの濃度を測定するキット</td></tr><tr><td>ボンハサミ</td><td>F.S.T</td><td>14184-09</td><td></td></tr><tr><td>水酸化カルシウム</td><td>SIGMA -Aldrich 31219</td><td>31219</td><td></td></tr><tr><td>CD31</td><td>Novusbio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type I&nbsp;(125単位/mg)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Tthermofisher</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>極細ブドウ鉗子</td><td>F.S.T</td><td>11150-10</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco 16000044</td><td></td><td></td></tr><tr><td>細鉗子</td><td>F.S.T Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M solution</td><td>STEMCELLSテクノロジー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-グルタミン 100x</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>マイコザップ</td><td>ランザ</td><td>VZA-2011</td><td>マイコプラズマ除去試薬</td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペネシリン ストレプトマイシン 100x</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム 100 mM</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td></td><td></td>11360070</tr><tr><td>標準パターン鉗子</td><td>&nbsp;F.S.T</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>手術用ハサミ - シャープ-ブラント</td><td>F.S.T</td><td>14008-14</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン 0.05%</td> <td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>ビメンチン</td><td>アブカム</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウス間質弁細胞の分離を用いて大動脈弁の石灰化を 研究

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

大動脈弁細胞の石灰化は大動脈狭窄の特徴であり、弁カスプ線維症に関連している。弁間質細胞(VIC)は、骨芽細胞様細胞への脱分化プログラムの活性化を通じて大動脈狭窄における石灰化プロセスにおいて重要な役割を果たす。マウスVICは大動脈弁細胞の鉱化を駆動するシグナル伝達経路の解明のための良いインビトロツールである。本明細書に記載された方法は、これらの著者によってうまく使用され、新たに単離された細胞を得る方法を説明する。2段階コラゲナーゼ処置を1mg/mLおよび4.5mg/mLで行った。最初のステップは、内皮細胞層を除去し、汚染を避けるために重要です。第2のコラゲナーゼインキュベーションは、組織からプレートへのVICの移行を容易にすることである。また、単離されたマウス弁細胞の表現型特性評価のための免疫蛍光染色法についても議論される。さらに、カルシウム試薬測定手順およびアリザリン赤染色を用いてインビトロで石灰化アッセイを行った。マウスバルブ細胞一次培養の使用は、インビトロで細胞の無機化を阻害する新しい薬理学的標的を試験するために不可欠です。

マウス大動脈弁は通常直径1mmであるため、異なる実験手順のために100万個の生存細胞を収集するために少なくとも3つのバルブをプールする必要があります。VIC 分離プロセスの異なる手順を図1と図 2に示します。バルブ組織を手動で削ることが困難であるため、渦を除去して渦を除去することによって生じるせん断応力を使用することが好ましい。実際、CD31免疫蛍光染色結果は、内皮細胞の汚染の欠如を示した(図3D)。また、マウスVICは、バルブセルの主要マーカーであるビメンチンおよびα-SMAを発現する(図3B、C)。
インビトロでの細胞の鉱物化 カルシウム試薬キットを使用してカルシウム濃度を測定しました。石灰化培地で処理した細胞は、非処...

この記事では、2段階コラゲターゼ法によるマウス大動脈弁細胞の単離について説明します。孤立したマウス弁細胞は、この インビトロ 石灰化アッセイのような異なるアッセイを行う場合や、大動脈弁鉱化につながる分子経路を調べるために重要です。

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

単離されたマウス弁細胞の使用は、トランスジェニックマウスからの遺伝子組み換え細胞の使用における弁石灰化につながるシグナル伝達経路を調査するために不可欠である。2段階の消化は、迅速かつ効率的な方法です。このプロトコルの最も困難な部分は、8週間マウスからの大動脈弁の分離です。大動脈弁をよりよく視覚化するために、古いマウスで練習する方が良いです。実験を開始する前に、70%エタノールですべての手術器具とワークスペースを洗浄し、滅菌し、手術器具を30分間オートクレーブします。最初のセットアップが準備ができたら、エタノールを使用して8週齢の安楽死マウスの胸部および腹部領域を洗浄することから始める。はさみを使用して、腹部とマウスの胸部を開き、左心房と左心室の間を小さな外科用ハサミで切る。冷たいPBSの10ミリリットルを浸透させることによって心臓から血液を除去し、心臓を切断し、上昇大オルタの3ミリメートルを維持する。体型顕微鏡では、心室の中央で心臓を水平に切断し、左心室を大動脈に向かって切断し、大動脈弁を慎重に解剖することによって大動脈弁を解剖する。小さな35ミリメートルのティッシュ培養皿に一緒にバルブをプールします。抗生物質を補った5ミリリットルの10ミリモルコールドHEPESで75ミリリットルの細胞培養皿で単離されたバルブを洗浄し、連続揺れで摂氏37度で30分間コラゲラーゼタイプ1の5ミリリットルでインキュベートします。インキュベーション後、チューブを150倍Gで5分間遠心分離し、10ミリモルHEPESの2ミリリットルで1回、30秒間高速で渦巻き状でペレットを洗浄します。チューブから35ミリメートルの培養皿に結果の懸濁液を収集し、慎重に新鮮なチューブに組織断片を転送するために薄いピンセットを使用しています。その後、35分間連続撹拌下で37°Cでコラゲレーターーゼタイプ1の5ミリリットルで15ミリリットルのチューブにペレットをインキュベートします。1ミリリットルのピペットと遠心分離機を150倍Gで摂氏4度で5分間再懸濁して細胞を分離する。分離したペレットを完全なDMEMの2ミリリットルに再懸濁し、摂氏4度で5分間Gの150倍の遠心分離を行い、細胞を2回洗浄します。めっきの場合は、ペレットを完全な培地の1ミリリットルに再懸濁し、最小量の培地で6つのウェル細胞培養皿の1つのウェルに加えます。プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素で乱さないようにしてください。3日間のインキュベーションの後、顕微鏡下で細胞を観察することによって組織の破片に近い成長を確認する。1,000個の細胞が見える場合は、オートクレーブされたピンセットで組織の破片を慎重に取り除き、培地を変更します。70%の合流度に達した後に細胞をトリプシン化し、75ミリリットルの組織培養皿に移す。アッセイを開始する前に、バイオセーフティフードを70%エタノールで洗浄し、DMEM培地を摂氏37度に温めます。次に、完全なDMEMで6つのウェルプレートに条件ごとに100,000個の細胞をシードし、摂氏37度で培養します。24時間後、上清培地を石灰化培地に交換し、37°Cで7日間細胞をインキュベートし、3日目に培地を交換します。7日後、アルセナゾIII試薬を用いて、650ナノメートルで吸光度を記録することにより、96ウェルプレート中のカルシウム濃度を測定します。代表的な分析では、培養3~5日後に免疫蛍光染色で各種バルブ細胞の型が同定された。マウスVICの発現ビメンチンおよびαSMAは、バルブ細胞の有意なマーカーである。さらに、CD31免疫蛍光染色は、VIC培養における内皮細胞からの汚染がないことを確認した。リン酸リッチな石灰化培地を用いてVICを培養すると、細胞内の石灰化を刺激し、カルシウム節に対する赤陽性染色でさらに確認した。プロトコルは異なったマウスからの3から5つの弁のプールに基づいている。ごみの交尾と3つの異なる生物学的複製の使用は、発見を検証するために重要です。マウス弁細胞の使用は、トランスジェニックマウスから細胞を単離することによって大動脈狭窄につながる分子経路を理解するために不可欠である。このプロトコルは、以前石灰化大動脈弁の鉱物回帰における受容体への経路の影響を調べるのに使用されてきた。

isolation-mouse-interstitial-valve-cells-to-study-calcification

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、心臓弁内皮細胞（VEC）の純粋な集団を分離して培養する方法を提供する。...

弁内皮細胞の単離

このビデオでは、2段階のコラゲナーゼ手順を使用して成体マウスの心臓から大動脈弁間質細胞を分離し、その後、少量の増殖培地で培養する方法を示します。...

マウス弁間質細胞の単離:マウス大動脈弁からVICを単離および培養するための酵素的方法

このビデオは、大動脈弁間質細胞の石灰化をin...

大動脈弁間質細胞のカルシウム濃度を測定するための石灰化アッセイ

心臓弁内皮細胞(VEC)を分離する能力は、弁の発生、維持、および疾患のメカニズムを理解するために重要です。...

ネズミ弁内皮細胞の単離

血管石灰化は、ヒトの心血管疾患の重要な予測因子であり、その一因となります。このプロトコルは、培養された初代血管平滑筋細胞の石灰化を誘導する方法、および近赤外蛍光イメージングを使用して動物大動脈の石灰化とマクロファージ負荷を定量化する方法について説明しています。...

血管平滑筋細胞と大動脈石灰化と炎症のイメージングの石灰化

このプロトコルでは、分離、カルチャ、および石灰化弁のラット由来間質細胞の石灰性大動脈弁疾患 (CAVD) の高い生理生体外モデルをについて説明します。このモデルラットの搾取は、CAVD...

初代ラットの分離と性状バルブ間質細胞: 大動脈弁石灰化を研究するための新しいモデル

マウスモデルは、不整脈形成の重要なメカニズムを研究することを可能にする。そのためには、パッチクランプ測定を行うために高品質の心筋細胞が必要です。ここでは、カルシウム一過性物質とL型カルシウム電流を同時に測定できる逆行性酵素ベースのランゲンドルフ灌流を介してマウス心房筋細胞と心室筋細胞を分離する方法について説明します。...

Ca2+過渡現象とL型カルシウム電流の同時測定のための高品質マウス心房および心室筋細胞の分離

本研究では、石灰化大動脈弁の新鮮なサンプルからのTリンパ球分離のプロセスと、フローサイトメトリー分析を用いた適応性白血球サブセットの特性評価のためのT細胞クローニングの分析ステップについて述べた。...

照射されたバフィーコートからのフィーダー細胞を用いたTリンパ球の分離と培養による大動脈弁石灰化の調査

このプロトコルは、外科的大動脈弁置換術中または死体組織から抽出されたヒト大動脈弁の収集、およびその後の患者特異的一次弁内皮細胞および間質細胞の分離、拡張、および特性評価について説明しています。細胞生存率と表現型特異性を確保するために必要なプロセスに関する重要な詳細が含まれています。...

in vitro疾患モデリングのためのヒト初代弁細胞の単離

本論文では、マウス大動脈を単離し、石灰化した細胞外小胞を抽出して石灰化の可能性を観察することにより、血管石灰化を取得および評価するための方法論を提示します。...

in vitro および in vivo モデルを用いた細胞外小胞媒介血管石灰化の解析

学ぶマウス大動脈弁細胞の2段階コラゲナーゼ分離法。石灰化の分子メカニズムを解明し、大動脈弁狭窄症の治療標的探索に貢献する重要な手法です。

マウス間質弁細胞の分離を用いて大動脈弁の石灰化を研究

さらに動画を探す

マウス間質弁細胞の分離を用いて大動脈弁の石灰化を 研究

さらに動画を探す

マウス間質弁細胞の分離を用いて大動脈弁の石灰化を研究