Name: マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: 学ぼう、クロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いてマグナポルテ・オリザエにおけるヒストン修飾のゲノムワイド分布を解析する方法。植物病理学における病原真菌のエピジェネティック制御メカニズムを解明し、新規標的遺伝子の同定に貢献します。

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この研究は、中国国立自然科学財団(31871638グラント)、北京農業大学特別科学研究プロジェクト(YQ201603)、北京教育委員会の科学プロジェクト(KM201610020005)、BUA(GJB2021005)の高レベル科学研究育成プロジェクトによって支援されました。

1. Mオリザエからのプロトプラストの調製
<ol><li>オートミールトマト寒天(OTA)を準備します。<ol>
<li>オートミールの30〜50gの重量を量り、20分間水(ddH2O)の800 mLでそれを沸騰させます。ガーゼの2層を通してフィルタリングし、濾液を取ります。</li>
		<li>熟したトマトを選び、皮をむきます。ジュースを絞り、2層のガーゼを通して濾過し、濾過されたジュースの150 mLを集めます。</li>
		<li>すべてのトマトジュースと準備したオート麦を十分に混ぜ、ddH2Oを1000 mLまで加えます。</li>
		<li>500 mL の円錐フラスコに OTA 250 mL と 2.5 g の寒天粉末を加え、オートクレーブを 20 分間追加します。25°Cで保管。</li>
	</ol>
</li>
	<li>オートクレーブしたOTAをガラス5cm x 5cmのペトリ皿に25mL注ぎます。これらのペトリ料理の合計10を準備します。OTAがペトリ料理に固まった後、25°Cで料理を逆さまに保管してください。</li>
	<li>殺菌された爪楊枝を使用して 、M.オリザエ (野生型株P131、ノックアウト株 Δmobre2、Δmospp1、Δmoswd2)から菌糸体の小片を掘り出し、準備されたOTA料理に置きます。光条件下で28°Cで4~6日間培養します。 注:汚染を防ぐためにペトリ皿を逆さまにしてください。</li>
	<li>1000 μL の液体コンプリートミディアム(CM)(0.6%酵母エキス、0.3%酵素カゼイン加水分解物、0.3%酸性カゼイン加水分解物、1%グルコース)を1000 μL ピペットを使用してOTAディッシュに添加します。 注:4-6日間OTA料理に催眠術が生えました。</li>
	<li>野生型のひずみとノックアウトの菌株を接種ループで削ります。</li>
	<li>ミセリアの破片を収集し、液体コンプリートミディアム(CM)の250 mLに転送します。</li>
	<li>150 rpmで振る28°Cで36時間の三角形フラスコで真菌の破片を成長させる。</li>
	<li>漏斗を使用して、真菌のヒファをフィルタリングして収集します。</li>
	<li>真菌性ヒファを0.7 M NaCl溶液の500 mLで洗浄します。</li>
	<li>真菌菌糸体を収集し、それを量る。 注:菌糸体は計量前に乾燥する必要はありません。</li>
	<li>菌糸菌の1gあたり溶解酵素透過液の〜1 mLを加えます。<ol>
<li>トリコデルマ・ハルジアナムの溶解酵素を0.7M NaClに溶解させて、20mg/mL溶解酵素透過液を調製します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>150 rpmで振りながら、28°Cで3〜4時間に合わせる場合にヒファエを置きます。</li>
	<li>溶解したヒファエを0.7 M NaCl溶液の50 mLで洗浄します。</li>
	<li>プロトプラストと遠心分離機を2,000 x g および4 °Cで15分間回収します。</li>
	<li>遠心後、上清を慎重に捨てます。プロトプラストを4°Cで0.7 M NaCIバッファーの20 mLに再懸濁します。</li>
</ol>2. 生体内架橋と超音波処理
<ol><li>55 μLのホルムアルデヒドを加え(最終濃度が1%になるまで滴下してホルムアルデヒドを加えて)、架橋用のプロトプラストを含むNaCIバッファーの2mLに添加します。</li>
	<li>プロトプラストを25°Cで10分間インキュベートします。</li>
	<li>各チューブに20μLの10μLのグリシンを加え、未反応のホルムアルデヒドを急がせます。</li>
	<li>25°Cで5分間混合してインキュベートします。</li>
	<li>2,000 x g および 4 °C で 15 分間の遠心分離機。</li>
	<li>遠心後、上清を慎重に捨てます。ペレットを0.7 M NaCI溶液の1 mLに再懸濁します。</li>
	<li>2,000 x g および 4 °C で 10 分間の遠心分離機。</li>
	<li>遠心後、上清を慎重に捨てます。750 μL の RIPA バッファー(50 mM Tris-HCl pH 8、150 mM NaCl、2 mM EDTA pH 8、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、プロテアーゼ阻害剤) でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>20xプロテアーゼ阻害剤の37.5 μLを加えます。</li>
	<li>前のステップから1.5 mL遠心分離管にプロトプラストを移します。</li>
	<li>超音波処理(25%W、出力3 s、5 s、4°C)を超音波処理を約10分間超音波処理器で直ちに行います。このステップの目的は、最良の条件を決定するために一定期間架橋ライセートを超音波処理することです。 注:このステップで-80°Cで凍結することができます。</li>
	<li>超音波処理の最適条件が既に決定されている場合は、次の手順に進みます。</li>
	<li>必要に応じて、アガロースゲル分析用に5μLのプロトプラスト(未シェレドDNA)を除去します。</li>
	<li>8分間超音波ホモジナイザー(25%W、出力3s、ストップ5 s、4°C)で超音波処理によってクロマチンを剪断します。</li>
	<li>サンプルが超音波破断された後、サンプルの一部を「入力」として取り出します。入力はChIP実験を行うものではなく、サンプルが超音波処理された後に放出されるすべてのDNAおよびタンパク質を含む。</li>
	<li>超音波処理の後、DNA断片の長さを分析するために1%アガロースゲル電気泳動を実行します。 注:アガロースゲル電気泳動の結果は、DNA断片の長さが200-500 bpであることを示しています(図4)。</li>
	<li>タンパク質の分解を防ぐために、超音波チューブを氷の上に置きます。</li>
	<li>遠心分離機 10,000 x g および 4 °C で 10 分間</li>
	<li>遠心分離後、遠心分離された上清を新しい1.5mL遠心管に移し、後で使用するために-80°Cで保管してください。この工程で得られたクロマチン溶液は、後続のIPに使用することができる。</li>
	<li>IP実験を行う前に、1x RIPAバッファでクロマチンサンプルを1:10の比率に希釈します(例えば、10 μLのクロマチンサンプルを1×RIPAバッファの1μLに加えます)。</li>
</ol>3. 架橋タンパク質/DNAのIP
<ol><li>ピペット50 μLの超常磁性タンパク質ビーズを2 mL遠心分離チューブに入る。チューブを磁気スタンドに置きます。磁気ビーズを沈殿させましょう。上清を取り除く。</li>
	<li>1x RIPAバッファー(氷上で予冷)の1 mLをチューブに加え、超常磁性タンパク質ビーズを洗浄します。洗浄後、チューブを磁気スタンドに置き、上清を取り除きます。各チューブに1x RIPAバッファ100μLを加えます。</li>
	<li>300 μLのチョルマチンサンプル(2 x 107 細胞を使用)、100 μLの超常磁性タンパク質ビーズ、4 μLのH3K4me3抗体をチューブに加えます。</li>
	<li>陰性コントロールとしてマウス IgG を使用したサンプルを使用します。 注:このプロトコルで使用されるマウスIgGは0.01 Mリン酸バッファーと0.15 M NaClを含み、20°C以下の凍結状態を保ちます( 材料表を参照)。</li>
	<li>よく混合した後、回転式シェーカーの上にサンプルを置き、4°C、30 x gで一晩インキュベート。 注:免疫沈降(IP)のインキュベーション時間を短縮することができるかもしれません。インキュベーション時間は異なる因子(例えば、抗体、遺伝子標的、細胞タイプなど)に依存し、経験的に試験する必要があります。</li>
</ol>4. IP製品の収集とリンス
<ol><li>磁石スタンドに置いて超常磁性タンパク質ビーズをペレットにする。吸引し、上清を捨てる。</li>
	<li>1x RIPAバッファーの1 mLでビーズを再懸濁して、超常磁性タンパク質ビーズ抗体/クロマチン複合体を洗浄します。</li>
	<li>ロータリーシェーカーでチューブを5分間リンスし、上清を30xgで取り除 きます。</li>
	<li>低塩免疫複合洗浄バッファー(0.1%SDS、1%トリトンX-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl pH 8.1、および150 mM NaCl)を1 mL添加します。</li>
	<li>ロータリーシェーカーでチューブを5分間すすいで、上清を取り除きます。</li>
	<li>遠心管に高塩免疫複合洗浄バッファー(0.1%SDS、1%トリトンX-100、2 mM EDTA、20 mM Tris-HCl pH 8.1、および500 mM NaCl)を1 mL加えます。</li>
	<li>ロータリーシェーカーにチューブを5分間置き、上清を取り除きます。</li>
	<li>遠心分離管に1 mLのLiCl(0.25 M LiCl、1%NP-40、1%デオキシコール酸、1 mM EDTA、および10 mM Tris-HCl pH 8.1)を用いてリンスします。</li>
	<li>ロータリーシェーカーにチューブを5分間置き、上清を取り除きます。</li>
	<li>試験管を0.25 M LiCIバッファーの1 mLで再びすすいで、ピペットで上清を取り除き、上清を捨てます。</li>
	<li>TE バッファーを 1 mL 追加します (10 mM トリス-HCl pH 8.1, 1 mM EDTA)。</li>
	<li>30 x g で 5 分間回転式シェーカーにチューブを置 きます。</li>
	<li>1 mL TE バッファーでチューブを再度洗い、ピペットで上清を取り除きます。</li>
	<li>ビーズを収集します。</li>
</ol>5. タンパク質/DNA複合体の溶出
<ol><li>溶出バッファー(20% SDSの10 μL、1 M NaHCO3の20 μL、滅菌蒸留H2 Oの170 μL)を全てのIPおよび入力チューブに準備します。</li>
	<li>各遠心チューブに溶出バッファーの100 μLを追加します。</li>
	<li>65°Cで15分間溶出。</li>
	<li>10,000 x g および4 °Cで1分間の遠心分離機を、上清を新しい遠心管に集めます。</li>
	<li>ステップ 5.2 ~ 5.4 を繰り返し、溶出を組み合わせます。190 μL の溶出バッファーを入力DNAの 10 μL に加えます。(総体積= 200 μL)。</li>
</ol>6. タンパク質/DNA複合体の逆架橋
<ol><li>5 M NaClの8 μLを全てのチューブに加え、65°Cで4~5時間または一晩インキュベートしてDNA-タンパク質の架橋を逆にします。 注: このステップの後、サンプルを -20 °C に保存し、必要に応じて次の日にプロトコルを続行します。</li>
	<li>RNase Aを1 μL加え、37°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>各チューブに4μLのプロテイナーゼK(H2Oに溶解して20mg/mLで溶解し、-20°Cで保存)を加え、45°Cで1〜2時間インキュベートします。</li>
</ol>7. DNAの精製と回収
<ol><li>550 μL のフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール混合物(25:24:1の比率)を遠心分離管に加えます。</li>
	<li>混合物を1分間徹底的に渦液にする。</li>
	<li>10,000 x g で15分間遠心分離機を使用し、上清を吸引します。</li>
	<li>抽出した上清を前工程から新しい1.5 mL遠心管に移します。</li>
	<li>1/10量の3 M酢酸ナトリウム溶液、2.5容量の絶対エタノール、3 μLのグリコーゲン(20 mg/mL)をチューブに加えます。</li>
	<li>サンプルを一晩-20°Cの冷蔵庫に入れて沈殿させます。</li>
	<li>遠心分離機 15分間、10,000 x g および 4 °C.</li>
	<li>遠心後に上清を捨てます。ペレットを1mLの75%エタノール(新鮮な調製が必要)で3回10,000xgで洗浄します。</li>
	<li>洗浄した沈殿物を清潔なベンチに置き、アルコールを乾燥させます。</li>
	<li>50μLの無菌脱イオン化H2Oを加え、沈殿を十分に溶解する。</li>
	<li>シーケンシングアダプターをDNAフラグメントにリゲートし、ハイスループットシーケンシングプラットフォームを使用してDNAを配列します。</li>
</ol>8. DNA修復とソレクサ図書館の建設
<ol><li>DNAエンドリペアキット(1-34 μL DNA、10倍のエンドリペアバッファーの5 μL、各dNTP2.5 mMの5 μL、10 mM ATPの5 μL、エンドリペア酵素1μL、およびH2Oを使用して、反応体積を49μLに調整する)を使用して、DNA末端を修復して鈍末DNAを生成します。</li>
	<li>PCR精製キットまたはフェノール:クロロホルム抽出を使用してDNAを精製します。1x TE pH 7.4の30 μLでDNAをエルテまたは再中断します。</li>
	<li>3'末端に「A」を加えます(ステップ2から30μL、H2Oの2μL、10x Taqバッファの5 μL、1 mM dATPの10 μL、および3 μLのTaq DNAポリメラーゼを含む)。0.2 mL PCR遠心分離チューブに試薬を加え、よく混合し、72°CのPCRマシンで10分間反応させます。</li>
	<li>10 μLのDNA、9.9 μLのH2O、T4 DNAリガーゼバッファーの2.5 μL、アダプタオリゴミックスの0.1 μL、T4 DNAリガーゼの2.5 μLを混合してリンカーライゲーションを行います。0.2 mL PCR遠心チューブに試薬を加え、よく混ぜます。16°Cで4時間インキュベートします。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従って PCR 精製キットを使用して DNA を精製します。溶出バッファーの 20-25 μL とエルルート.</li>
	<li>DNAライブラリーが確立される前に、精製されたDNAの濃度を特定し、その後のシーケンシング実験での使用を確認します。</li>
	<li>蛍光計を使用してDNA濃度を検出します。氷の上で試料を溶かし、1000 x g と4°Cで30sの遠心分離機を十分に混ぜます。 次に、適切な量のサンプルを取り、波長260nmの蛍光計で測定します。</li>
	<li>シーケンシング用のイルミナシーケンシングプラットフォームに、適格な品質と濃度のDNAサンプルを配置します。</li>
	<li>シーケンシングの前に、PCRプライマー、PE1.0およびPE2.0、および2x高忠実度マスターミックス(DNA 10.5 μL、2倍の高忠実度マスターミックスの12.5 μL、PCRプライマーPE1.0の1 μL、PCRプライマーPE2.0の1 μL)を使用してDNAを増幅します。0.2 mL PCR遠心チューブに試薬を加え、よく混ぜます。</li>
	<li>PCR マシンで PCR 反応を実行します: 95 °C 2 分間の予分化;その後、10 sのための95°C変性の35サイクル、15 sのための60°Cで焼鈍、5 sのための72°Cで延長;72°Cで5分間の最終延長。最後に、4°Cで反応をインキュベートする。</li>
	<li>DNAをクラスター生成に使用し、イルミナヒセク2000でシーケンシングを行います。 注: このプロトコルでは、クラスタ生成にイルミナ フロー セルが使用されていました。合成によるシーケンシングは、メーカーの指示に従ってイルミナゲノムアナライザーで行われました。</li>
</ol>

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<li>Dean, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genome+sequence+of+the+rice+blast+fungus+Magnaporthe+grisea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea.</a> Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).</li>
<li>Allis, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+nomenclature+for+chromatin-modifying+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">New nomenclature for chromatin-modifying enzymes.</a> Cell. 131 (4), 633-636 (2007).</li>
<li>Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+COMPASS+family+of+histone+H3K4+methylases%3A+mechanisms+of+regulation+in+development+and+disease+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The COMPASS family of histone H3K4 methylases: mechanisms of regulation in development and disease pathogenesis.</a> Annual Review of Biochemistry. 81, 65-95 (2012).</li>
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</ol>

著者らは、競合する利益は存在しないと宣言している。

近年、ChIP-seqは、特定のヒストンによって改変されたTFまたは濃縮部位の結合部位を決定するためのゲノム解析法として広く用いられている。従来のChIP-seqテクノロジーと比較すると、新しいChIP-seq技術は高感度で柔軟性に優れています。核酸の非特異的なハイブリダイゼーションによって生じるノイズ信号など、負の影響を受けることなく高解像度で得られます。これは一般的な遺伝子発現解析ですが、多くの計算方法が検証されており、ノイズと変動性の観点からChIP-seqデータの複雑さが、この問題を克服することは特に困難です。データ分析の面では、ChIP-seq実験で生成された大量のデータの管理と分析も、まだ十分に対処されていない課題です。 
ChIP-seq 実験には、いくつかの重要なステップがあります。まず、プロトプラストの調製は非常に重要です。高品質のプロトプラストを収集できるように、崩壊時間を制御する必要があります。超音波も非常に重要であり、超音波時間が制御されるべきであり、長すぎるか短すぎる動作しません。第二に、添加される抗体の量は、タンパク質に結合するより多くのDNA断片の濃縮...

エピジェネティクスは、遺伝子の塩基配列を変化させることなく遺伝子発現の遺伝性変化を指す遺伝子研究の一分野です。エピジェネティックな調節が真核細胞の増殖と発達において重要な役割を果たしていることを示す研究が増えているが、折りたたみと組み立ての動的過程を通じて遺伝子発現を制御し、影響を与えるクロマチンを含む1,2.クロマチンリモデリングおよび共有ヒストン修飾は、クロマチンポリマーの変動を通じてクロマチンの機能および構造に影響を及ぼし、それにより遺伝子発現3、4、5、6を調節する機能を達成する。ヒストンの翻訳後修飾には、アセチル化、リン酸化、メチル化、モノユビキチン化、相総化、およびADPリボシル化7、8、9が含まれる。ヒストンH3K4メチル化、特にトリメチル化は、真核生物10,11における転写複製、再結合、修復、およびRNA処理に関連する転写開始部位にマッピングされている。
ChIP-seq技術は2007年に導入され、転写制御およびエピジェネティック機構12,13のゲノム全体解析の実験基準となっている。この方法は、ゲノムワイドスケールで、DNA結合タンパク質のDNAセグメントを含むヒストンまたは転写因子相互作用情報を得るのに適している。目的のタンパク質に架橋されたDNA配列は、クロマチン複合体の一部として共沈殿します。新世代シーケンシング技術は、36-100bpのDNAを配列するためにも使用され、その後、対応する標的ゲノムと一致する。
植物病原性真菌では、最近、ヒストンメチル化修飾が病原性の過程で標的遺伝子をどのように調節するかを研究し始めている。いくつかの以前の研究は、ヒストンメチラーゼ関連遺伝子の調節が主に遺伝子サイレンシングおよび二次代謝産物(SM)の産生を触媒することに反映されることを証明した。MoSet1は、MオリザエのH3K4メチラーゼです。この遺伝子のノックアウトは、H3K4me3改変14の完全な欠失をもたらす。野生型株と比較して、変異体における遺伝子MoCEL7Cの発現は、CMC誘発状態および非誘導状態(グルコースまたはセロビオース)において阻害され、MoCEL7Cの発現は15増加した。Fusarium graminearumでは、KMT6はH3K27me3のメチル化修飾を触媒し、真菌の正常な発達を調節し、SM遺伝子クラスター16、17、18、19を含む「暗号ゲノム」を調節するのに役立つ。2013年、コノリーは、H3K9およびH3K27メチル化が、標的遺伝子20の阻害を調節する二次代謝産物およびエフェクター因子を通じて真菌の病原性プロセスを調節すると報告した。アスペルギルスにおいて、ヒストンH3K4me2およびH3K4me3の改変は、遺伝子活性化に関連しており、SM遺伝子クラスター21のクロマチンレベル調節を制御する上で重要な役割を果たす。M.オリザエにおいて、Tig1(酵母および哺乳動物におけるTig1に相同性)はHADC(ヒストンデアセチラーゼ)22である。Tig1遺伝子のノックアウトは、ヌル突然変異体における病原性および胞胞体産生能力の完全な喪失をもたらす。感染性ヒphphae22を産生できない過酸素環境に対してより敏感である。
M.oryzae.によって引き起こされる米の爆発は、世界で最も深刻な米の病気の一つです19.その代表的な感染過程のために、M.oryzaeは多くの重要な病原性真菌の感染過程に類似している。容易に分子遺伝学的操作を行うことができるので、真菌は真菌と植物の相互作用を研究するためのモデル生物23となっている。M.オリザエの感染過程のすべてのステップを遮断すると、感染が失敗する可能性があります。感染過程における形態変化は、ゲノム機能全体と遺伝子転写によって厳密に調節される。中でも、ヒストンメチル化などのエピジェネティック修飾は、機能性遺伝子24,25の転写調節に不可欠な役割を果たす。しかし、これまでのところ、M.オリザエにおける病原性遺伝子の転写におけるヒストンメチル化およびヒストンアセチル化などのエピジェネティック修飾の分子機構に関する研究はほとんど行われていない。したがって、これらの病原性遺伝子の上流および下流の調節ネットワークを研究しながら、稲芽菌のエピジェネティックな調節機構をさらに開発することは、米爆風予防および制御戦略の開発に役立つ。
特にエピジェネティクスにおけるChIP-seqなどの機能性ゲノミクスの開発により、このハイスループットデータ取得法により染色体の研究が加速されました。ChIP-seq実験技術を用いて 、M.オリザエ および他の糸状菌におけるヒストンメチル化(H3K4me3、H3K27me3、H3K9me3など)のゲノム全体の分布を同定することができる。したがって、この方法は、エピジェネティック修飾が植物病理における真菌病因の間に候補標的遺伝子を調節する方法の基礎となる分子メカニズムを解明するのに役立つ。

<table><tbody><tr><td>酸性カゼイン加水分解物</td><td>WAKO</td><td>65072-00-6</td><td>中型構成</td></tr><tr><td>の寒天粉末</td><td>科学者</td><td>9002-18-0</td><td>中型構成</td></tr><tr><td>のデオキシコール酸</td><td>MedChemExpress</td><td>83-44-3</td><td>タンパク質および溶解</td></tr><tr><td>DNA エンドリペアキット</td><td>NovoBiotec</td><td>ER81050</td><td>酵素的または機械的せん断</td></tr><tr><td>によって損傷した DNA または cDNA の修復Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>no.100.02D</td><td>結合ターゲット</td></tr><tr><td>EBバッファー</td><td>JIMEI</td><td>JC2174</td><td>メンブレンおよび液体</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9912</td><td>プロテアーゼ阻害剤</td></tr><tr><td>酵素カゼイン加水分解物</td><td>Sigma</td><td>91079-40-2</td><td>中型グル</td></tr><tr><td>コース</td><td>Σ</td><td>50-99-7</td><td>中型グリ</td></tr><tr><td>コーゲン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9510</td><td>沈殿物作用</td></tr><tr><td>H3K4me3抗体</td><td>アブカム</td><td>ab8580</td><td>H3K4me3タンパク質に対する免疫応答</td></tr><tr><td>イルミナ イルミナ ゲノム解析</td>装置 <td>イル</td><td>ミナ Hiseq 2000</td><td>大型構成</td></tr><tr><td>イルミナ PCRプライマー</td><td>イルミナ</td><td>CleanPlex</td><td>ランダムユニバーサルプライマー</td></tr><tr><td>イソアミルアルコール</td><td>化学書</td><td>30899-19-5</td><td>精製DNA</td></tr><tr><td>LiCl</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9480</td><td>特異的除去 RNA</td></tr><tr><td>溶解酵素</td><td>シグマ</td><td>L1412-10G</td><td>細胞溶解バッファー</td></tr><tr><td>マウスIgG</td><td>イェイセン</td><td>36111ES10</td><td>動物正常免疫グロブリン</td></tr><tr><td>NaCl溶液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>7647-14-5</td><td>中型構成</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Seebio</td><td>SH30173.08*</td><td>タンパク質複合体溶離液の調製</td></tr><tr><td>NP-40</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td>細胞溶解を促進する細胞溶解物</td></tr><tr><td>PCR 精製キット</td><td>Qiagen</td><td>28004</td><td>精製手順は、DNAサンプルからプライマーを除去し</td></tr>ます <tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td><td>ThermoFisher</td><td>A32965</td><td>タンパク質活性を低下させるタンパク質阻害剤</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2546</td><td>DNA抽出試薬</td></tr><tr><td>Qubit 4.0</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33226</td><td>中型構成</td></tr><tr><td>RIPA バッファー</td><td>ThermoFisher</td><td>9806S</td><td>細胞溶解バッファー</td></tr><tr><td>RNase A</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2271</td><td>精製</td></tr><tr><td>DNA SDS</td><td>ThermoFisher</td><td>AM9820</td><td>電荷差を隠す</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム溶液</td><td>ThermoFisher</td><td>R1181</td><td>酢酸バッファー</td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>サーモフィッシャー</td><td>89904</td><td>プロテアーゼ分解</td></tr><tr><td>の阻害 T4 DNAリガーゼ</td><td>サーモフィッシャーEL0011</td><td></td><td>ATPを補酵素として、DNAリガーゼ</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ緩衝液</td><td>サーモフィッシャーB69</td><td></td><td>DNAリガーゼ緩衝液</td></tr><tr><td>トリス-HCl</td><td>サーモフィッシャー1185-53-1</td><td></td><td>緩衝剤作用</td></tr><tr><td>トリトンX-100</td><td>サーモフィッシャー</td><td>HFH10</td><td>は、膜タンパク質を安定な</td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>OXOID</td><td>LP0021</td>中<td>型構成</td></tr>に保ちます</tbody></table>

マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析

Genome-wide Analysis of Histone Modifications Distribution using the Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Method in Magnaporthe oryzae

クロマチン免疫沈降シーケンシング(ChIP-seq)は、転写因子(TF)、クロマチン調節因子、ヒストン修飾の全ゲノム位置をマッピングし、TF結合パターンおよびヒストンポスト修飾を明らかにするための全ゲノムを検出するための強力で広く使用されている分子技術です。ヒストンメチル化などのクロマチン修飾作用は、特定の遺伝子調節配列に採用されることが多く、クロマチン構造の局所的な変化を引き起こし、特定の転写効果を生じる。米の爆発は、世界中の米に壊滅的な真菌病であり、真菌と植物の相互作用を研究するためのモデルシステムです。しかし、ヒストン修飾が Magnaporthe oryzae の毒性遺伝子をどのように調節するかの分子メカニズムは依然として不可解である。より多くの研究者は、ヒストンエピジェネティック修飾が標的遺伝子をどのように調節するかを研究するためにChIP-seqを使用する必要があります。また、動物や植物のタンパク質とDNAの相互作用を研究するために広く使用されていますが、植物病理学の分野ではあまり使用されておらず、十分に開発されていません。本論文では 、M.オリザ エの機能性標的遺伝子に結合するヒストンメチル化(H3K4me3など)のゲノム全体分布を同定するための、ChIP-seqの実験過程と操作方法について述べた。ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。

図1に、ChIP-seq メソッドの全体のフローチャートを示します。ChIP-seq実験は、野生型株P131におけるH3K4me3に対する抗体と、m.オリザエにおけるヒストンH3K4me3分布の全ゲノムワイドプロファイルを検証するために、mobre2、mospp1、およびmoswd2遺伝子を欠いていた3つのヌル変異株に対する抗体を用いて行った。野生型株のプロトプラスト、Δモブレ2、Δmospp1、およびΔmoswd2は、25%Wで超音波処理し、出力3s、ストップ5s、4°Cで調製した。 また、クロマチンをH3K4me3抗体及びダイナビーズタンパク質A/Gで免疫精製した。続いて、シーケンシングライブラリを構築するフェノールクロロホルム法を用いてDNA断片を抽出し、ハイスループットシーケンシングプラットフォーム上でシングルエンドで配列決定した。
野生型の代表的な結果は、Δre2、Δ<e...

ここでは、M.オリザエおよび他の糸状菌の病因における新しい標的遺伝子を同定することができるヒストン修飾のゲノム全体の分布を分析するプロトコルを提示する。

Chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) is a powerful and widely used molecular technique for mapping whole genome locations of transcription ...

この方法は、植物病理における真菌病態の間のエピジェネティック修飾を介して候補標的遺伝子の調節の基礎となる分子メカニズムを解明するのに役立つ。クロマチン免疫沈降シーケンシング技術は、全ゲノム中のヒストンや転写因子と相互作用するDNAセグメントを効率的に検出できます。他の方法と比較して、効率と解像度を向上させることができます。100マイクロリットルのピペットを使用して、オートミールトマトアガープレートに100マイクロリットルの液体完全培地を加えます。接種ループを使用して、野生型株のミセリアとノックアウト株を削ります。ミセリアの破片を収集し、液体完全培地の250ミリリットルにそれらを転送します。0.7モル塩化ナトリウム溶液の500ミリリットルで真菌ヒファを洗浄します。その後、真菌菌菌を収集し、それを計量します。真菌菌糸体の1グラムあたり約1ミリリットルの溶解酵素透過液を加えます。150 RPMで振って3〜4時間、28°Cでシラミのハイファを置きます。シラミのヒファエを0.7モル塩化ナトリウム溶液50ミリリットルで洗います。サンプルを遠心分離し、上清を慎重に捨てます。プロトプラストを0.7モル塩化ナトリウム溶液の20ミリリットルで再懸濁する。37%ホルムアルデヒドの55マイクロリットルを加えて、最終的な濃度が1%になるまで架橋用のプロトプラストを含む塩化ナトリウム緩衝液2ミリリットルに滴下し、未反応のホルムアルデヒドをクエンチし、各チューブに10倍のグリシンの20マイクロリットルを加える。遠心後に上清を慎重に捨てます。0.7モル塩化ナトリウム溶液の1ミリリットルにペレットを再懸濁します。遠心分離後に上澄み液を慎重に捨て、750マイクロリットルのRIPAバッファーにペレットを再び懸濁します。プロテアーゼ阻害剤の37.5マイクロリットルを20倍加えます。超音波ホモジナイザーを使用して8分間超音波処理によってクロマチンを剪断。サンプルが超音波破断された後、サンプルが超音波処理された後に放出される全てのDNAおよびタンパク質を含む入力としてサンプルの一部を取り出す。DNA断片の長さを分析するには、超音波処理後に1%アガロースゲル電気泳動を実行します。遠心分離後、遠心分離された上清を1.5ミリリットルの遠心管に移し、後で使用するためにマイナス80°Cで保存します。IP実験を行う前に、各クロマチンサンプルを1~10の割合に希釈し、RIPAバッファーを1倍にします。ピペット50マイクロリットルの超常磁性タンパク質ビーズを2ミリリットル遠心管に入る。チューブを磁気スタンドに置き、磁気ビーズを沈殿させる。その後、上清を取り除く。プリ冷却したRIPAバッファーを1ミリリットルずつチューブに加え、超常磁性タンパク質ビーズを3回洗浄します。チューブを磁気スタンドに置き、上清を取り外します。各チューブに100マイクロリットルのRIPAバッファを加えます。クロマチンサンプル30マイクロリットル、超常磁性タンパク質ビーズ100マイクロリットル、H3K4me3抗体4マイクロリットルをチューブに加え、よく混合します。サンプルをロータリーシェーカーに置き、30倍のG.ウォッシュで摂氏4度で一晩インキュベートし、1ミリリットルのRIPAバッファーの1ミリリットルでビーズを再懸濁して超常磁性タンパク質ビーズ抗体とクロマチン複合体を洗浄します。低塩免疫複合体洗浄バッファーの1ミリリットルでサンプルを洗浄し、その後、高塩免疫複合体洗浄バッファーの1ミリリットルで洗浄します。1ミリリットルの塩化リチウムバッファーでビーズをすすいで上清を取り除きます。次に、TE バッファーの 1 ミリリットルをチューブに追加します。TEバッファーの1ミリリットルでチューブをもう一度置き、ピペットで上清を取り除きます。各遠心チューブに溶出バッファーの100マイクロリットルを追加します。摂氏65度で15分間溶出します。4°Cで10,000倍Gで1分間遠心分離機を、新しい遠心管に上清を集めます。すべてのチューブに5つの塩化モルナトリウムの8マイクロリットルを加え、65°Cで4〜5時間または一晩インキュベートしてDNAタンパク質のクロスリンクを逆転させます。Rnase Aを1マイクロリットル加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。各チューブに4マイクロリットルのプロテイナーゼKを加え、摂氏45度で1~2時間インキュベートします。遠心管にフェナルクロロホルムとイソアミルアルコール混合物の550マイクロリットルを加えます。遠心分離機を10,000倍Gで15分間、上清を吸引する。1/10モル酢酸ナトリウム溶液、2.5容量の絶対エタノール、3マイクロリットルのグリコーゲンをチューブに加えます。サンプルを降水のために一晩マイナス20°Cの冷蔵庫に入れます。翌日、チューブを遠心分離し、上清を捨てます。ペレットを1ミリリットルで3回洗浄し、10,000倍のG.50マイクロリットルの無菌脱イオン水を加えて沈殿物を十分に溶解させます。DNAエンド修復キットを使用して鈍いエンドDNAを生成するためにDNA末端を修復し、テキスト原稿に記載されている指示。3つの素端にアデニンベースを追加するには、DNA30マイクロリットル、水2マイクロリットル、10倍のTaqバッファの5マイクロリットル、1ミリモルdATPの10マイクロリットル、Taq DNAポリメラーゼの3マイクロリットルを0.2マイクロリットルPCR遠心チューブに加えます。それらを混合し、10分間摂氏72度のPCRマシンで反応します。10マイクロリットルのDNA、9.9マイクロリットルの水、2.5マイクロリットルのT4 DNAリガーゼバッファー、0.1マイクロリットルのアダプターオリゴミックス、および2.5マイクロリットルのT4 DNAリガーゼを0.2マイクロリットルPCR遠心分離管に混合してリンカーライゲーションを行います。チューブを摂氏16度で4時間インキュベートします。PCRプライマーを使用してDNAを増幅するには、10.5マイクロリットルのDNA、12.5マイクロリットルの2倍の高忠実度マスターミックスを加えます。PCRプライマーPE 1.0の1マイクロリットルとPCRプライマーPE 2.0の1マイクロリットルを0.2マイクロリットルPCR遠心分離管に混合し、よく混ぜます。Mobre2、mospp1およびmoswd2の欠失変異体のH3K4me3シグナルは、その機能的標的領域で有意に減少した。野生型株P131と比較して、モブレ2、mospp1およびmoswd2欠失変異体における富化H3K4me3クロマチン免疫沈降シーケンシング読み取りのシグナルは大きく減少した。この手順に従って、チップオンチップとチップqPCRを実行することができます。それらは一般に、タンパク質の下流標的遺伝子をスクリーニングし、既知のゲノム結合部位におけるタンパク質DNA相互作用を研究するために使用される。

genome-wide-analysis-histone-modifications-distribution-using

Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

ここでは、ヒストン結合ドメインが異なるタンパク質アイソフォームのゲノムワイド位置解析のためのクロマチン免疫沈降（ChIP）の手順を提示している。我々はKDM5A/JARID1A/RBP2ヒストン脱メチル化酵素の標的を同定するためのChIP -...

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

特定の植物遺伝子上にヒストン修飾を検出するために信頼性の高い有用なアプローチが説明されています。アプローチは、クロマチン免疫沈降（ChIP）とリアルタイム定量PCRを兼ね備えています。それは、多様な生理学的プロセスにおいて役割を持つ特定の遺伝子のヒストン修飾の検出を可能にする。...

植物の葉におけるヒストン修飾の検出

当社ベイジアン変化点（BCP）のアルゴリズムは変化点隠れマルコフモデルを経由してモデリングの最先端の進歩に基づいて構築され、クロマチン免疫沈降シーケンス（ChIPseq）データ解析に適用します。...

多様ChIPseqデータ型のゲノムワイドな解析のための新規ベイジアン変化点アルゴリズム

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

クロマチン免疫沈降は、DNAは、インビボでのシロイヌナズナのタンパク質の結合部位を同定するための強力な技術です。この手順は、クロマチン架橋および断片化、目的のタンパク質に対する選択的な抗体を用いた免疫沈降、および結合したDNAの定量PCR分析を含みます。私たちは、シロイヌナズナ植物用に最適化され、単純なChIPアッセイを説明します。...

シロイヌナズナタンパク質-DNA相互作用の同定のための免疫沈降アッセイクロマチン<em&gt;インビボ</em

このプロトコルは、質量分析（MS）を用いて、ヒストンの翻訳後修飾を特徴付けるための完全に統合されたワークフローの概要を説明します。ワークフローは、ナノ流液体クロマトグラフィーおよびデータ分析のための命令を使用して、細胞培養物または組織、ヒストン誘導体、消化、MS分析から、ヒストンの精製を含みます。 3日 - プロトコルは2以内に完了するために設計されています。...

ヒストンの抽出からデータ解析まで：ボトムアップ質量分析法を用いてヒストンの翻訳後修飾の解析のための完全なワークフロー

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クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

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学ぼう、クロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いてマグナポルテ・オリザエにおけるヒストン修飾のゲノムワイド分布を解析する方法。植物病理学における病原真菌のエピジェネティック制御メカニズムを解明し、新規標的遺伝子の同定に貢献します。

マグナペアテオリザエにおけるクロマチン免疫沈降シーケンシング法を用いたヒストン修飾分布のゲノム解析

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