Name: 細菌外膜小胞ヘテロジネミティーを分析するサイズ排除クロマトグラフィー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶサイズ排除クロマトグラフィーによる細菌外膜小胞のヘテロジネミティー分析。Aggregatibacter actinomycetemcomitansを用いて核酸・タンパク質を除去し、超速遠心分離より迅速で再現性の高い分離法を確立する。

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この研究は、国立科学財団(1554417)と国立衛生研究所(DE027769)によって資金提供されました。

1. バッファの準備
<ol><li>ELISA洗浄バッファーを調製するには、3.94 g トリスベース、8.77 g NaCl、および1 g の牛血清アルブミン (BSA) を 1 L の脱イオン化 (DI) 水に加えます。500 μL ポリソルベート-20を加えます。HCl または NaOH を使用して pH を 7.2 に調整します。</li>
	<li>ブロッキングバッファを準備するには、3.94 g トリスベース、8.77 g NaCl、および10 g BSAを追加します。500 μL ポリソルベート-20~1 LのDI水を加えます。HCl または NaOH を使用して pH を 7.2 に調整します。</li>
	<li>溶出バッファー (PBS) を調製するには、8.01 g NaCl、2.7 g KCl、1.42 g Na2HPO4、および 0.24 g KH2PO4 から 1 L DI 水を加えます。HCl または NaOH を使用して pH を 7.4 に調整します。 注:このバッファーの10倍の溶液を作り、必要に応じてDI水で希釈することができます。</li>
</ol>2. OMV サンプルの調製
<ol><li>A.アクチノミセテミテミタン細胞を後期指数相(0.7の600 nmでの光学密度)まで増殖させる。ペレット細胞を4°Cで10,000xgで2回遠心分離して10分間ペレット化した。上清を0.45 μmのフィルターでフィルターします。</li>
	<li>50 kDa分子量カットオフフィルターを使用して、細菌を含まない上清を濃縮します。4°Cで105,000 x gの濃縮液を30分間超遠心分離します。</li>
	<li>PBSと超遠心分離機でペレットを再び再懸濁(105,000 x g 4°Cで30分間)2 mLのPBSでペレットを再懸濁します。</li>
</ol>3. S-1000 カラムの梱包
<ol><li>ゲル濾過用のストックボトルをガラスの攪拌棒と混合し、カラムを満たすために必要な体積をガラスボトルに注ぎ、約50%の過剰(約135mL)を加えます。これらのビーズは、彼らが落ち着くまで座って、余分な液体をデカントしてみましょう。溶出バッファー内のビーズを再懸濁し、最終的な溶液が約 70%(体積)ゲル、30% バッファーになるようにします。真空下で溶液を脱ガスします。</li>
	<li>リングスタンドを使用してガラス柱を垂直に取り付け、溶出バッファで充填して柱の壁を濡らします。列に残っているバッファーの約 1 cm が 1 cm しかないまでバッファーをドレインします。</li>
	<li>気泡を作成せずに、慎重に柱にピペットビーズを、上部に列を充填します。このプロセス全体を通して余分なバッファを排出し続けます。列の上部に追加のビードを追加する前に、ビーズを完全に落ち着かせないようにしてください。カラムは、カラムの底面から約2cm下の高さまで梱包する必要があります。</li>
</ol>4. サンプルのロードと分数の収集
<ol><li>真空下で溶出バッファーを脱気します。溶出バッファーの 2 つのカラムボリューム (180 mL) でカラムを洗浄します。</li>
	<li>残りのバッファが列に完全に入るようにします。バッファーがゲル層の上部に到達したら、AMVを含む2mLサンプル(約100〜200 nmol/Lの脂質濃度)をビーズの表面に慎重にピペットし、カラムの上部にあるビーズを乱さないように注意してください。液体がゲル層の上に残っていない場合、サンプルがゲルに完全に入ることを許可します。</li>
	<li>ゲルカラムの上に溶出バッファーを慎重にゆっくりと追加します。これはサンプル希釈を引き起こすので、ゲルの最上層を乱さないで下さい。</li>
	<li>柱の下に単一の 50 mL チューブを配置し、列を開きます。溶出液の最初の20 mLを集める。必要に応じて、列の上部に溶出バッファーを追加して、カラムが乾燥しないように注意してください。</li>
	<li>カラムの下に1.5 mLチューブを一連配置します。カラムを開始し、各チューブに一連の1mLサンプルを集めます。サンプルが収集される間、必要に応じて、引き続き列の上部に溶出バッファーを追加します。96分の一部が収集されるまで繰り返します。列を停止します。 注:サンプルは、長期保存のために-20°C、またはより詳細な分析まで短期保存のために4°Cで保存する必要があります。</li>
	<li>列をクリーニングするには、列を通して 0.1 M NaOH の 1 つの列ボリューム (90 mL) を実行します。2 つの列ボリューム (180 mL) の溶出バッファーを列を通して実行します。</li>
</ol>5. サンプル分析
<ol><li>各画分の脂質濃度を測定するために、各画分のピペット50 μLを96ウェルプレートの単一ウェルに入れ。各ウェルに、2.5 μLの脂溶性染料を加えます。15 sのインキュベート。励起波長515nm、発光波長640nmのプレートリーダーで蛍光強度を測定します。各サンプル中のすべての脂質の割合を計算するには、すべての発光強度を合計し、個々の強度を合計で割ります。</li>
	<li>特定のタンパク質の濃度を測定するために、各画分のピペット100 μLをELISA免疫プレートの単一ウェルに入れた。25°Cで3時間インキュベートする。<ol>
<li>サンプルをデスキャンします。ELISA洗浄バッファーを200 μLずつウェルに加え、デカントを加えます。合計5回の打ち上げに対して4回繰り返します。</li>
		<li>各ウェルに200μLのブロッキングバッファーを加え、25°Cで1時間インキュベートします。 デスキャント。</li>
		<li>100 μLブロッキングバッファーと一次抗体を含むインキュベートプレート (精製抗体の場合は 1:10,000、未精製抗体の場合は 1:10) を 4 °C で一晩で行う。 デスキャント。</li>
		<li>ELISA洗浄バッファーを200 μLずつウェルに加え、デカントを加えます。合計5回の打ち上げに対して4回繰り返します。</li>
		<li>ELISA洗浄バッファーと二次抗体 (1:30,000) を各ウェルに 100 μL 加えます。25°Cで1時間インキュベートする。</li>
		<li>ELISA洗浄バッファーを200 μLずつウェルに加え、デカントを加えます。合計5回の打ち上げに対して4回繰り返します。</li>
		<li>3,3',5'-テトラメチルベンジジン(TMB)ワンステップ溶液の100 μLを加え、15〜30分間、または青色が現れるまでインキュベートします。停止液の50 μLでTMB反応を停止します。</li>
		<li>プレートリーダーで、450 nmの波長で各ウェルの吸光度を読み取ります。</li>
	</ol>
</li>
	<li>全タンパク質濃度を測定するには、UV-vis分光光度計を用いて、各画分の波長280nm(A280)で吸光度を記録します。</li>
</ol>プロトコルの概略を 図 1に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62429/62429fig01.jpg"> 図1: SECの手順の概略図 このカラムには、気泡や不連続性を避けるために、脱気ゲル濾過媒体を慎重に詰め込み、2カラム量の溶出バッファーで洗浄します。次に、サンプルをゲルの上部に慎重にピペット処理し、ゲルパッキングを中断させることなくします。カラムは開いて、サンプルがゲルに完全に入るまで実行されます。この時点で、バッファーはカラムの上部に配置され、溶出液の最初の20 mLが収集されます。次に、一連の1-mL分数が収集される。これらの画分は、脂質およびタンパク質含有量の分析のために96ウェルプレートまたは96ウェル免疫プレートに入れられます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62429/62429fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<ol><li>Kuehn, M. J., Kesty, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+outer+membrane+vesicles+and+the+host-pathogen+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction.</a> Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).</li>
<li>Kulp, A., Kuehn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+functions+and+biogenesis+of+secreted+bacterial+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles.</a> Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).</li>
<li>Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane-like+vesicles+secreted+by+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+are+enriched+in+leukotoxin%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathogenesis%22%5BJournal%5D)">Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin.</a> Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).</li>
<li>Nice, J. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+leukotoxin+is+delivered+to+host+cells+in+an+LFA-1-independent+manner+when+associated+with+outer+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Toxins%22%5BJournal%5D)">Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles.</a> Toxins. 10 (10), 414(2018).</li>
<li>Haurat, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+sorting+of+cargo+proteins+into+bacterial+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).</li>
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<li>Balsalobre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+the+Type+I+secreted+%CE%B1-haemolysin+via+outer+membrane+vesicles+from+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli.</a> Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).</li>
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<li>Rompikuntal, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perinuclear+localization+of+internalized+outer+membrane+vesicles+carrying+active+cytolethal+distending+toxin+from+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans%5BTitle%5D)+AND+%22Infections+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans.</a> Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).</li>
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<li>Stevenson, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunization+with+outer+membrane+vesicles+displaying+conserved+surface+polysaccharide+antigen+elicits+broadly+antimicrobial+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).</li>
<li>Gujrati, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineered+bacterial+outer+membrane+vesicles+as+cell-specific+drug-delivery+vehicles+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy.</a> ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).</li>
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<li>Chen, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+foreign+antigens+by+engineered+outer+membrane+vesicle+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+membrane+vesicles+displaying+engineered+glycotopes+elicit+protective+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).</li>
<li>Singorenko, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+A+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+isolation+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Strategies for isolation of exosomes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).</li>
<li>Benedikter, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafiltration+combined+with+size+exclusion+chromatography+efficiently+isolates+extracellular+vesicles+from+cell+culture+media+for+compositional+and+functional+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies.</a> Science Reports. 7 (1), 15297(2017).</li>
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<li>Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+immunological+characterization+of+the+domain+of+Actinobacillus+actinomycetemcomitans+leukotoxin+that+determines+its+specificity+for+human+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).</li>
<li>Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigallocatechin+gallate+inhibits+leukotoxin+release+by+Aggregatibacter+actinomycetemcomitans+by+promoting+association+with+the+bacterial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Oral+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane.</a> Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).</li>
<li>Klimentová, J., Stulík, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+isolation+and+purification+of+outer+membrane+vesicles+from+gram-negative+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiological+Research%22%5BJournal%5D)">Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria.</a> Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).</li>
<li>Dauros Singorenko, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+membrane+vesicles+from+prokaryotes%3A+a+technical+and+biological+comparison+reveals+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).</li>
<li>Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicle+isolation+methods%3A+rising+impact+of+size-exclusion+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).</li>
</ol>

著者は報告する利害の対立はありません。

ここでは、細菌OMV亜集団の単純で、速く、再現性のある分離のためのプロトコルを提供しました。この手法は比較的単純ですが、列内で効率的に分離を行うために、非常に慎重に実行する必要がある手順がいくつかあります。まず、気泡を避けるために、ゲルを慎重かつゆっくりとカラムにロードすることが不可欠です。我々は、カラムをロードする前にゲルを室温で数時間放置することで、ゲルが平衡化し、カラム内の気泡形成を最小限に抑えることを観察した。ゲルを柱にピレットする場合、乱気流を最小限に抑えるために、柱の側面に沿って慎重にパイプする必要があります。読み込み中は常に、決済ゲルの不連続を避けるために、余分なバッファーを列に保持する必要があります。もし、もし不和が起こったら、バッファーとピペットを上下に加え、ゲルを再中断します。
同様に、サンプルを使用して列を読み込むことが非常に重要です。サンプルはカラムを通過するごとに希釈されるため、SECによる分離前に、ロードされたサンプルを十分に濃縮する必要があります。 A.アクシノミセテミタンOCV の場合、脂質の約100〜200nmol/Lを含む1mL...

グラム陰性細菌は、その外膜、いわゆる外膜小胞(Omv)に由来する小胞を増殖を通じて放出する。これらのOmvは、細菌と宿主の間、ならびに細菌細胞間の間の、DNA/RNA、タンパク質、脂質、およびペプチドグリカン1、2を含む多くの重要な生体分子を運ぶことによって、細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たす。特に、細菌病原体におけるOmvの役割は、特定の毒性因子および毒素3、4、5、6、7、8、9、10、11におけるそれらの濃縮のために広範囲に研究されている。
OMVは、親菌および増殖段階に応じて、20〜450nmの大きさの範囲であると報告されており、いくつかの種類の細菌が異種サイズのOPV8、12、13、14を放出し、これはそれらのタンパク質組成および宿主細胞エントリーのメカニズムも異なる。H.ピロリは直径20~450nmの範囲のOmvを放出し、より小さいOmvは大きなOmvよりも均質なタンパク質組成を含む。重要なことに、Omvの2つの集団は、異なるメカニズム12を介してホスト細胞によって内在化されることを観察した。また、アグリガチバクター放線菌症は、小さな(<150nm)のOMVの集団と大きな(>350 nm)のOMVの集団を放出し、OMVには大量の分泌タンパク質毒素、ロイコトキシン(LtxA)15を含むことが実証されました。細胞プロセスにおけるOMVヘテロジニティーの役割は明らかに重要であるが、小胞の異なる集団を分離および分析する際の技術的な困難は、これらの研究を制限している。
細菌の病因におけるそれらの重要性に加えて、Omvはワクチンおよび薬物送達車16、17、18、19、20として含む多くのバイオテクノロジー用途で使用するために提案されている。このようなアプローチでの翻訳的な使用には、小胞のクリーンで単分散の調製が必要です。したがって、効果的かつ効率的な分離方法が必要である。
最も一般的には、密度勾配遠心分離(DGC)は、不均一な大きさの小胞集団を、フラネラおよび分泌タンパク質21を含む細胞の破片から分離するために使用される。この方法は、異機種サイズのOMV亜集団12,13,14を分離するアプローチとしても報告されている。ただし、DGC は時間がかかり、非効率的で、ユーザーからユーザーへの変数が非常に大きく、スケールアップには適していません。対照的に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、Omv21、23、24を浄化するためのスケーラブルで効率的で一貫したアプローチを表します。我々は、ゲル濾過媒体で満たされた長い(50cm)重力流SECカラムが、Omvの亜集団を効率的に精製し、分離するのに十分であることを発見した。具体的には、このアプローチを用いて、A.放基性菌小数体を「大」および「小さい」亜集団に分離し、タンパク質およびDNA汚染を除去しました。精製は4時間未満で完了し、OMV亜集団の完全分離および残骸の除去が達成された。

<table><tbody><tr><td>1ステップ Ultra TMB-ELISA</td><td>Thermo Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Amicon 50 kDa フィルター</td><td>ミリポアシグマ</td><td>UFC905024</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP9704-100</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Immuno Plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td>FM 4-64</td><td>Thermo Scientific</td><td>T13320</td><td>1.5 x 50 cm</td></tr><tr><td>ガラス エコノカラム</td><td>BioRad</td><td>7371552</td><td></td></tr><tr><td>Infinite 200 Pro プレート リーダー</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0395-500G</td><td></td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性無水 (KH2PO4)</td><td>Amresco (VWR)</td><td>0781-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sephacryl S-1000 Superfine</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0476-01</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二塩基性無水(Na2HPO4)</td><td>Amresco(VWR)</td><td>0404-500G</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>VWR</td><td>0497-1KG</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン(R)20</td>ア<td>クロス有機物</td><td>23336-2500</td><td></td></tr></tbody></table>

細菌外膜小胞ヘテロジネミティーを分析するサイズ排除クロマトグラフィー

Size Exclusion Chromatography to Analyze Bacterial Outer Membrane Vesicle Heterogeneity

グラム陰性細菌の細胞壁は、内(細胞質)と外膜(OM)で構成され、薄いペプチドグリカン層で分離される。成長を通して、外膜は球状の外膜小胞(Omv)を形成するために出血する。これらのOmvは、ホスト細胞への貨物輸送や細菌細胞との通信など、数多くの細胞機能に関与しています。近年、ワクチンや薬剤送達車としての使用など、Omvの治療可能性が探求され始めている。OmvはOMに由来するが、OMVの脂質およびタンパク質貨物は、しばしばOMのそれとは大きく異なることが長い間評価されてきた。最近では、細菌が複数の種類のOmvを放出できるという証拠が発見され、サイズが宿主細胞による取り込みのメカニズムに影響を与える可能性があるという証拠が存在する。しかし、この分野の研究は、異機種サイズのOPVを効率的に分離する際の困難によって制限されている。密度勾配遠心分離(DGC)は、伝統的にこの目的のために使用されてきました。ただし、この手法は時間がかかり、スケールアップが困難です。一方、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)は、面倒ではなく、Omvの治療的使用に必要な将来のスケールアップに適しています。ここでは、150nm未満から350nm以上の直径の範囲の アグリガチバクター放線菌菌によって産生されるOMVを試験ケースとして使用して、異種サイズの小胞の再現性分離を可能にするSECアプローチについて述べている。我々は、動的光散乱(DLS)によって検証された「大」(350nm)のOmvと「小型」(<150 nm)のAMVの分離を実証する。使いやすさ、再現性(ユーザー間を含む)、およびスケールアップの可能性により、異種サイズの小胞を分離するためのDGCベースの技術よりもSECベースの技術をお勧めします。

図2は、この方法の代表的な結果を示しています。 A.放吉菌菌株 JP2によって産生されるOMVは、まず超遠心化15を用いて培養上清から精製した。我々は以前、この株が、直径約300nmの1つと直径約100nm15の2つの集団を生成することを発見した。これらのOMV集団を分離するために、上述のSECプロトコルを用いてサンプルを精製した。各画分は、脂溶性色素を用いた脂質含有量、および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)またはイムノブロットを用いた毒素(LtxA)含量について分析した。脂質および毒素濃度はパーセンテージとして報告され、ここで「%脂質」は、サンプルの総脂質含量の割合が各画分に何パーセントであるかを示し、「%毒素」は、サンプルの総毒素含有量の割合が各画分に何パーセントであるかを示す。
図2Aは 、3つの異なる精製からの標準偏差を有する平均化された...

細菌性小胞は病因において重要な役割を果たし、有望なバイオテクノロジーの応用を有する。小胞の不均一性は分析と使用を複雑にします。したがって、小胞の様々なサイズを分離する簡単で再現可能な方法が必要です。ここでは、 アグリガチバクター放体菌によって産生される異種小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィーの使用を示す。

The cell wall of Gram-negative bacteria consists of an inner (cytoplasmic) and outer membrane (OM), separated by a thin peptidoglycan layer. Throughout ...

サイズ排除クロマトグラフィーは、異種サイズの細菌小胞の亜集団を分離し、細菌の上清から核酸やタンパク質を除去するのに有用なアプローチです。サイズ排除クロマトグラフィーは、密度勾配超遠心分離を含む他の分離技術よりも安価で、速く、より再現性が高い。我々は、A.actinoceteomitomitans小胞を使用してこのアプローチの可能性を実証したが、我々はそれが同様に他の異種サイズの細菌小胞集団にも適用することができることを期待している。すべてのバッファーとビーズ溶液を適切に脱気し、気泡を導入することなく溶液をゆっくりとピペット化し、ビーズが乾燥することなく均質にパックするほど迅速に行ってください。まず、ガラス棒を使用してゲル濾過媒体のストックボトルを混合し、カラムに約50%の過剰を充填するために必要な体積をガラス瓶に注ぎます。ビーズが沈着し、余分な液体をデカントできるようにします。溶出バッファー内のビーズを約 70%ゲルおよび 30%緩衝液の最終溶液に再懸濁し、真空下で溶液を脱気します。柱を垂直位置のリングスタンドに取り付け、約1センチメートルしか残らなくなるまで緩衝材を排出する前に、壁を濡らす溶出バッファでカラムを埋めます。その後、ゲルビーズを慎重にピペットでカラムに入れ、余分なバッファーを排出すると同時に、カラムがカラムリザーバーの底から約2センチメートル下の高さまで詰まるまでビーズが沈降するのを防ぎます。サンプルをロードする前に、真空下で溶出バッファーを脱気します。溶出バッファーの約 2 倍のカラム体積でカラムを洗浄します。バッファーがゲル層の上部に到達したら、表面を乱すことなくゲル層の上に1リットル当たり100〜200ナノモルのナノモルサンプルを慎重に2ミリリットル加え、サンプルをゲルに入れます。ゲル層を乱さずに緩やかに溶出バッファーをカラムに加え、カラムの下に50ミリリットルのチューブを置きます。カラムが乾燥するのを防ぐために、同時にカラムの上部に溶出バッファーを追加します。溶出物を20ミリリットル回収した後、カラムの下に1.5ミリリットルのチューブのラックを置きます。各チューブに合計96個の1ミリリットル分を集める。サンプルを収集しながら、連続的にカラムに溶出バッファーを追加します。カラムをクリーニングするには、1カラムの水酸化ナトリウムモルを1列ずつ実行し、その後に2列の溶出バッファーを使用します。脂質濃度を測定するために、各分画のピペット50マイクロリットルを96ウェルプレートに入した。各ウェルに2.5マイクロリットルの脂溶性染料を加えます。15秒後、蛍光強度を測定する。目的のタンパク質の濃度を測定するには、ELISA免疫プレートの個々のウェルに各画分の100マイクロリットルを追加します。摂氏25度で3時間後、プレートの内容物をデカントします。洗浄ごとに200マイクロリットルのELISA洗浄バッファーでプレートを5回洗浄し、洗浄後にプレートをデカンタンします。25°Cで1時間のインキュベーションのために各井戸に200マイクロリットルのブロッキングバッファーを追加します。インキュベーションの終わりに、プレートをデカントし、摂氏4度で一晩インキュベーションのためのブロッキングバッファーに一次抗体の100マイクロリットルを追加します。翌日、プレートをデカントし、実証したようにELISA洗浄バッファーでプレートを5回洗浄します。最後の洗浄後、ELISA洗浄バッファーに100マイクロリットルの二次抗体を加え、摂氏25度で1時間インキュベーションします。インキュベーションの最後に、実例のようにプレートを洗浄し、室温で15〜30分間インキュベーションするために各ウェルに100マイクロリットルのTMB溶液を加えます。青い色が現れたとき、各ウェルに50マイクロリットルの止止め液を加え、450ナノメートルで吸光度を測定します。A.アクチノミセテミタンの培養上清のサイズ排除カラム精製が実証された後、この株によって産生される大小の外膜小胞に対応する2つの異なる脂質ピークが観察された。サンプル画分のELISA分析は、毒素が主に大きな外膜小胞のサブ集団に関連していることを明らかにした。免疫ブロット分析は、同様であるが、より騒がしい結果を与え、このアプローチはELISAよりも感度が低いことを示した。観察されるように、このクロマトグラフィー技術は、外膜小胞の調製物からかなりの量の遊離タンパク質を除去することができる。しかし、全タンパク質濃度が特定のタンパク質の濃度と必ずしも相関しないことに注意することが重要です。気泡を避け、カラムが乾燥するのを防ぐために、柱の梱包と走行中に非常に注意することが重要です。動的光散乱、粒子追跡、および二頭鏡検査は、分離された外膜小胞のサイズおよび他の特性を決定するために、以下のサイズ排除クロマトグラフィーを行うことができる。

size-exclusion-chromatography-to-analyze-bacterial-outer-membrane

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

出典: ワトソン、DC、 et.al。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。 (2021年)このビデオは、遺伝子組み換え細菌の外膜に由来する細胞外小胞(EV)の単離と濃縮を示しています。このプロセスには、細菌を培養して EV...

細菌からの外膜由来細胞外小胞の単離と濃縮

出典: ワトソン、DC 他。大腸菌と他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離と精製 J. Vis. 経験。...

サイズ排除クロマトグラフィーを用いた細菌の細胞外小胞の単離 

このビデオでは、外膜小胞または細菌由来のOMVの不均一な集団を分離する技術(サイズ排除クロマトグラフィー)を実演します。これらの小胞はナノサイズの球状構造であり、サイズ排除クロマトグラフィーによってそのサイズに基づいて大小の亜集団に分離されます。...

サイズ排除クロマトグラフィーに基づく細菌細胞外小胞の分離:グラム陰性細菌外膜小胞の不均一集団をそのサイズに基づいて分離する技術

このビデオでは、界面活性剤可溶化後の大腸菌における緑色蛍光タンパク質(GFP)融合膜タンパク質の安定性をスクリーニングするための蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー技術を示しています。サイズ排除プロファイルで対称的なピークを示し、遊離GFPがほとんどまたはまったくないタンパク質は、分解と凝集が最小限に抑えられた精製タンパク質を示しており、その後、構造機能解析のために選択できます。...

蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー:界面活性剤の可溶化に伴う蛍光膜タンパク質の完全性を同定する技術

このビデオでは、結核菌(Mtb)の培養濾液から細菌の細胞外小胞(EV)を精製するためのサイズ排除クロマトグラフィー(SEC)技術を示しています。この手法では、多孔質樹脂充填カラムを使用して、EVの精製画分を取得します。多孔質粒子は、より小さなタンパク質が細孔に侵入するのを選択的に許可し、溶出を遅らせます。同時に、EVはサイズが大きいため、毛穴に入るのが排除され、最初に溶出されます。...

マイコバクテリア細胞外小胞を精製するためのサイズ排除クロマトグラフィー技術

細菌は、生理活性のある生体分子を運ぶナノメートルサイズの細胞外小胞(EV)を分泌します。EVの研究は、それらの生合成、微生物-微生物および宿主-微生物の相互作用および疾患における役割、ならびにそれらの潜在的な治療用途を理解することに焦点を当てています。EV研究の標準化を促進するために、さまざまな細菌からEVをスケーラブルに分離するためのワークフローが提示されます。...

大腸菌およびその他の細菌からの細胞外小胞のスケーラブルな単離および精製(英語)

本プロトコールは、シアノバクテリア培養物からの細胞外小胞の単離、濃縮、および特性評価に関する詳細な説明を提供する。異なるスケールの培養物から小胞を精製するためのアプローチ、方法論間のトレードオフ、およびフィールドサンプルを扱うための考慮事項についても議論する。...

シアノバクテリア細胞外小胞の単離と特性評価

ここでのプロトコルは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、細胞外小胞を馴化細胞培養培地から適切に分離できることを示しています。...

馴化細胞培養培地から細胞外小胞を分離するためのサイズ排除クロマトグラフィー(英語)

このプロトコールは、サイズ排除クロマトグラフィー、培養上清から 結核菌 群細胞外小胞を富化するための容易で再現性のある技術を記載する。...

結核 菌サイズ排除クロマトグラフィーによる細胞外小胞濃縮

細胞外小胞は生物医学的応用に大きな期待を寄せていますが、現在の単離法は時間がかかり、臨床使用には実用的ではありません。本研究では、大量の生体液から細胞外小胞を最小限のステップで連続的に直接単離できるマイクロ流体デバイスを紹介します。...

二股A4Fマイクロ流体デバイスを用いた大量サンプルからの細胞外小胞のシングルステップ分離(英語)

このプロトコルは、酵素的消化およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、マウスの骨格筋および骨髄から小さな細胞外小胞を分離し、構造的に複雑で収量の少ない組織から小胞富集部分を再現可能にして下流の分子解析を可能にします。...

サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

学ぶサイズ排除クロマトグラフィーによる細菌外膜小胞のヘテロジネミティー分析。Aggregatibacter actinomycetemcomitansを用いて核酸・タンパク質を除去し、超速遠心分離より迅速で再現性の高い分離法を確立する。

細菌外膜小胞ヘテロジネミティーを分析するサイズ排除クロマトグラフィー

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