蛍光色素、ローダミンBを用いて、オス のアエデスアエジプティ 蚊の交配競争力を研究する
2021年5月7日
ここでは、蛍光色素をマーカーとして用いた雄 のAedes aegypti の交配性を研究するためのプロトコルを提示する。雌の蚊は、交尾のためにマークされた男性と無印の両方の雄にさらされます。交配後、それらの精子は、交配パートナーを決定するために蛍光顕微鏡下で検査される。
このプロトコルは、男性の放出ベースの蚊の集団抑制プログラムの前提条件であるオスの蚊の交配競争力を測定します。このフィットネス基準は、品質管理とひずみ評価の一部として評価されます。この方法は、実験時間を90%短縮し、2つの無菌またはウォルバキア感染ライン間の交配競争力を直接比較することを可能にする。
この手順を実行すると、アイリーン・リーとケン・ワイ・マクになります。まず、そのサイズの違いに応じて、プパルの段階でオスとメスの蚊をセックスします。蚊のセットごとに、100個のオスの子犬を、スクロースの餌付けまたはローダミンBスクロースの餌付けのために、事前に標識されたケージに移します。
ケージあたり40〜50の小さなバッチにメスの子犬を入れます。イモソの出現時に、雄の蚊の存在がないかケージを確認してください。0.2%ローダミンBスクロース溶液を調製するには、10%スクロース溶液の100ミリリットルごとに200ミリグラムのローダミンB粉末を溶解する。
すべての粉末が溶解していることを確認するためによく混合します。芯付きの20個の砂糖フィーダーボトルを準備します。10本のフィーダーボトルに10%スクロースの10ミリリットル、他の10フィーダーボトルに0.2%ローダミンBスクロース溶液10ミリリットルを加えます。
準備されたすべての男性ケージに5本のフィーダーボトルを入れ、オスの蚊が交配実験の前に3日間餌を与えるようにします。水銀バーナーランプとステレオ顕微鏡をオンにします。水銀バーナーランプへの光源を10分間安定させます。
次に、赤蛍光タンパク質1に対する蛍光フィルターをセットする。口腔吸引器のガラス管に一度に少数の蚊を吸引する。ガラス管を通して、蛍光ステレオ顕微鏡下でオスの蚊の体を観察します。
実験にはローダミンBでマークされたオスの蚊のみを使用してください。移管セットオスの蚊は、網で固定された12の紙コップに入れ替えます。1杯あたり10匹のスクロースがカップごとにオスの蚊を6杯に供給し、10ローダミンBスクロースはカップ当たりオスの蚊を他の6杯に供給した。
セットBオスの蚊に対してこの手順を繰り返します。交配アッセイ用に12個のケージを設置します。6つのケージのそれぞれに、ローダミンBマークされた10セットAオスの蚊、10の無印のセットBオスの蚊、および10の処女野生型メス蚊が含まれています。
他の6つのケージには、10の無印セットAオスの蚊、10ローダミンBマークセットBオスの蚊、および10バージン野生型メス蚊が含まれます。これらのケージにラベルを付け、2つの交配の組み合わせを明確に区別します。ラベルに従って、男性のそれぞれのカップを交配ケージに入れます。
網を取り出し、カップを軽くタップして、オスをカップから出します。ケージから蚊が逃げないように、慎重に紙コップと網をケージから取り外します。オスの蚊が交配ケージに少なくとも1時間順応するようにします。
経口吸引器を使用して、12の紙コップに処女野生型のメスの蚊を移し、各カップに10匹の蚊を含む。オスの蚊の順応期間の後、すべての交配ケージにメスの1カップを移し、網を取り除きます。カップから残りのメスの蚊を励ますためにカップをそっと揺らし、ケージから慎重に紙コップと網を取り除き、蚊がケージから逃げないようにします。
交配を3時間行い、機械吸引器で各ケージからすべての蚊を取り除くことによって交配実験を終了する。氷上の蚊を少なくとも5分間冷たい麻酔をします。蚊が完全に麻酔ができたら、雌の蚊をそっと拾い、網で固定された別の紙コップに入れます。
それぞれのラベルを交配ケージからカップに移して、紙コップにラベルを付けます。女性の精子を採点するには、ステレオ顕微鏡で解剖する前に、氷上の雌の蚊を少なくとも5分間冷たい麻酔をする。立体顕微鏡でメスの蚊を解剖する。
顕微鏡で精子を調べてください。女性が授精されていない場合、3つの精子はすべて空になり、授精した場合、精子の2〜3つは運動性精子で満たされます。授精された個体の場合、RFP1フィルターを備えた蛍光ステレオ顕微鏡下で検査することにより、精子にローダミンBマーク付き精液が含まれているかどうかを判断します。
もし、ロダミンBでマークされていない精液で精子が満たされている場合、蛍光は認められない。一方、精子にローダミンBが精液と印示されている場合、それはオレンジ色の蛍光を発するであろう。この交配競争力アッセイの目的は、数世代の近親交配の後に男性の交配フィットネスに損失があるかどうかを判断することであった。
交配競技アッセイの三倍量の実験を行い、授精データをここに示す。野生型の雌は、近交系または外十交の男性のいずれかによって授精され、相互マーキングが付いた。結果は、近親交配または外交男性によって授精された女性の割合がローダミンBマーキングの影響を受けないことを示しています。
3つのレプリカントすべてで近親交配男性よりもアウトクロス男性と交配した女性の割合が有意に高く、近親交配が交配フィットネスの損失につながる可能性があることを示している。メスの蚊の余分なケージを準備することが重要です。産前のメスはすべてのデータを無効にするので、オスの蚊によって汚染されたケージからメスの蚊を使用しないでください。
実験室ベースの交配競争力アッセイ以外に、この手順は、昆虫交配生物学、集団ダイナミクス、および分散を研究するためにマーク放出再キャプチャ実験に使用することができます。
概要
この研究は、蚊の個体数管理戦略における重要な考慮事項である、オスのAedes aegypti蚊の交尾競争力を評価するためのプロトコルを提示します。研究者は、ロダミンBを蛍光マーカーとして使用することで、メス蚊に接触した後のマーキングされたオスとマーキングされていないオスの交尾成功率を直接比較することができます。
主要な研究構成要素
研究分野
- 蚊の交尾競争力
- 個体数抑制戦略
- 昆虫の行動と生物学
背景
- 疾病伝播における蚊の役割による効果的な蚊の個体数管理の必要性。
- 無菌昆虫技術プログラムにおける品質管理のためのオスの交尾適性の評価の重要性。
- 実験の正確性と効率を高めるための蛍光マーカーの使用。
使用された方法
- マーキングされたオスとマーキングされていないオスを使用した管理された交尾アッセイ。
- モデル生物としてのAedes aegypti。
- 交尾結果と精子の存在を分析するための蛍光顕微鏡。
主な結果
- 近親交配はオスの交尾適性を低下させます。これは、近親交配されたオスと交配外されたオスの授精率の比較で明らかです。
- 蛍光マーキングは、授精されたメスの割合に影響を与えませんでした。
- 効率的な方法により、交尾競争力の迅速な評価が可能になります。
結論
- この研究は、Aedes aegyptiの交尾成功における遺伝的要因の影響を強調しています。
- この発見は、蚊の制御と個体力学に関する将来の研究に関連しています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Assessing male mating competitiveness is critical for evaluating strain fitness in sterile insect technique programs, directly impacting the success of vector control strategies. This fluorescent dye-based method enables rapid, quantitative comparison of mating fitness between strains, reducing experimental time by 90% and supporting data-driven go/no-go decisions in pipeline advancement. By providing a scalable, reproducible assay for target validation in vector-borne disease intervention, it enhances predictive confidence in preclinical strain selection.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables direct interrogation of mating fitness as a phenotypic endpoint for strain fitness evaluation.
- Operational Value: Reduces assay duration from days to hours by eliminating blood-feeding and egg-hatching steps.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by quantifying competitive mating success between sterile or Wolbachia-infected lines.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, fluorescence-based readouts for mating partner identification in spermathecae.
- Operational Value: Uses sucrose feeding for non-invasive male marking, enabling high-throughput preparation of labeled cohorts.
- Reproducibility: Standardized Rhodamine B concentration (0.2% in 10% sucrose) ensures consistent labeling across experimental replicates.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges laboratory strain evaluation to field release readiness by assessing a key fitness criterion for population suppression.
- Mechanistic De-risking: Detects fitness costs of inbreeding through reduced insemination rates, informing strain maintenance strategies.
- Disease-Relevant System: Uses Aedes aegypti, a vector for dengue, Zika, and chikungunya, aligning with global health priorities.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting strain selection after genetic modification and before field trial planning, by providing a quantitative mating competitiveness metric.
- Discovery Biology: Tests the hypothesis that genetic background influences mating success through competitive male-female interactions.
- Screening: Produces standardized, fluorescent sperm labeling enabling blind scoring of mating outcomes across experimental groups.
- Analytics: Generates proportional insemination data per male strain, facilitating statistical comparison of mating fitness.
- Translational Research: Connects laboratory competitiveness to field efficacy by validating a prerequisite for sterile male release success.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for comparing any two male strains, applicable across vector control programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into mating fitness determinants, reducing ambiguity in strain selection.
- Operational Value: Eliminates dependency on blood feeding and embryology, simplifying workflow and increasing throughput.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by identifying fitness defects early, reducing investment in non-competitive strains.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains based on validated mating competitiveness data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mosquito handling, sex separation at pupal stage, and fluorescence microscopy.
- Necessitates stereo microscope with RFP1 filter set and mercury burner lamp for standardized fluorescence detection.
- Demands cross-team standardization of male marking protocols and female dissection procedures to ensure data consistency.
- Involves adaptation considerations when applying to different mosquito species or strains with varying feeding behaviors.
- Includes practical limitations such as the need to avoid pre-inseminated females and ensure proper cage labeling to prevent cross-contamination.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:41
Preparation of Male and Female Mosquitoes
1:11
Preparation of 0.2% RhB Sucrose Solution and Feeding of Male Mosquitoes
1:52
Checking for RhB Fluorescence in Male Mosquitoes
2:46
Mating Competitiveness Assay
5:36
Results: Assessment of Mating Competitiveness in Male Mosquitoes
6:27
Conclusion
