Name: ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶ ヒト多能性幹細胞から3Dレチナルオガノイドを誘導する効率的なプロトコル。エンブリオイドボディのサイズとプラティング密度を定量化することで、網膜細胞の再現性のある分化を実現し、疾患モデリングや細胞治療への応用が可能です。

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この研究は、中国の国家キーR&Dプログラム(2016YFC1101103、 2017YFA0104101)、広州科学技術プロジェクト基金(201803010078)、広東省科学技術プロジェクト(2017B020230003)、中国自然科学財団(81570874、81970842)、孫文大学(PT1001010)の100人の人材プログラム、および主要研究所の基礎研究基金

1. hPSCの文化と拡大
<ol><li>HPSC 文化
	<ol>
<li>細胞外マトリックス(ECM、hESC修飾マトリックス)で6ウェルプレートの2つのウェルをコーティングします。Dulbeccoの修正イーグル培地(DMEM)に8-12 μg/mLのECMを含むECM溶液50 mLを調製します。DMEMの49 mLに、解凍したECMストック溶液(50x)を1 mL加えます。6ウェルプレートの各ウェルにECM溶液1mLを加えます。37°Cおよび5%CO2でインキュベーターに1時間インキュベートする。</li>
		<li>メーカーの指示に従ってhPSCメンテナンス媒体(MM)を準備します。</li>
		<li>室温(RT)で30分間MMを温める前に。</li>
		<li>37°Cの水浴中で30sの水浴中でインキュベーションすることによって液体窒素タンクからhPSC(hiPSCまたはhESC)(約1 x 106)の極低温バイアルを解凍します。</li>
		<li>バイアルを取り出し、75%消毒アルコールスプレーを使用して慎重に消毒します。バイオセーフティキャビネットに入れてください。</li>
		<li>バイアルから15mLチューブにセルサスペンションを移し、5mLピペットを使用してチューブにドロップして5mLの事前温めたMMドロップを加えます。一方、チューブを軽く振ってhPSCをブレンドします。</li>
		<li>チューブを170 x g で5分間遠心します。慎重に1 mLピペットを使用して上清のほとんどを除去し、細胞を失うことを避けるために上清の約50 μLを残します。</li>
		<li>チューブにMMの1mLを加え、1mLピペットで1、2回上下に軽くピペットを加え、ペレットを再懸濁します。 注: hPSC の単一細胞の生存率は低い。3〜5個の細胞を有する小細胞塊は、コロニー内でhPSCを増殖させ続けることが好ましい。</li>
		<li>事前にコーティングされたウェルからECMを取り出し(ステップ1.1.1)、各ウェルに1.5mLのMMを加え、ウェルごとに0.5mLの細胞懸濁液を分配します。</li>
		<li>プレートを軽く振ってhPSCを均一に分配し、37°Cと5%CO2のインキュベーターにプレートを入れます。細胞の付着を促進するために、少なくとも24時間プレートを動かさない。</li>
		<li>合流が約80%に達したときに1日おきにMMを変更し、hPSCを通過させます。</li>
	</ol></li>
	<li>hPSCのパッシング 注: hPSC での未分化状態の保守は、それ以降のアプリケーションにとって非常に重要です。接着条件下では、hPSCは明確に定義された境界を持つコロニーで成長する。hPSCの合流が約80%に達すると、細胞は通過する必要があります。<ol>
<li>顕微鏡で細胞を観察します。マークし、機械的に通過する前に、はっきりと見える分化細胞(<5%)を除去します。</li>
		<li>ステップ 1.1.1 で説明したように、ECM コーティングプレートを準備します。</li>
		<li>前温MMと1xリン酸緩衝剤(PBS)を使用せず、CA2+ およびMg2+ をRTで使用します。</li>
		<li>37 °Cの水浴で0.5 mM EDTA(1x PBS)溶液を予温してください。</li>
		<li>真空吸引システムを用いて培養板から培地を取り出し、各ウェルに1mLのPBSを加えて、1mLピペットを用いて細胞を洗浄し、2回繰り返す。</li>
		<li>37°Cの培養インキュベーターでhPSCを解化するために、1ウェルあたり1 mLのEDTA溶液を加え、5分間5%CO2 を解約します。単一細胞への解離を避けるために推奨インキュベーション時間を超えないでください。</li>
		<li>プレートを取り出し、顕微鏡下で細胞の剥離を確認します。コンフルエントhPSCが緩んで各細胞の境界線が見えますが、細胞板を穏やかに振ると細胞が簡単に外れることができません。</li>
		<li>1 mL ピペットで EDTA 溶液を取り出し、1 mL の MM を加え、解離を止めます。1 mL ピペットで hPSC を 1 回または 2 回静かにピペットし、細胞を再中断します。細胞を収集するために遠心分離機をする必要はありません。 注:EDTAでインキュベーションした後に大部分の細胞がプレートから外れた場合、遠心分離機で細胞を採取することができます。</li>
		<li>事前にコーティングされたウェル(ステップ1.2.2)からECMを取り出し、井戸あたり1.5mLのMMを追加します。</li>
		<li>150~200 μLのセルの塊を各ウェルに移します。一般的に、hPSC は 1:6 の比率で通過できます。例えば、6ウェルプレートの1つのウェルからの細胞を6つの新しい井戸に分配することができる。</li>
		<li>プレートを軽く振ってhPSCを均一に分配し、37°Cで培養器内のhPSCを培養し、プレートに触れることなく、少なくとも24時間培養します。</li>
		<li>ステップ 1.1 で説明したように、1 日おきに MM を変更します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. hPSCからのレチナル分化
注: コロニーが約 80% 合流に達すると (図 1B)、図 1Aでスキーマ化されたプロトコルに従って、レチナルオノイドに分化するように導くことができます。hPSCが高品質で良好な収率を持つことを保証するために、IFCまたはQPCRを使用してOCT4またはNANOGなどの分子マーカーを用いて、多能性を定期的に評価します。分化された細胞がセル全体の5%以上を占める場合は、HPSCを廃棄する必要があります。メーカーの指示に従ってマイコプラズマ検出キットでマイコプラズマ汚染がないか確認します。マイコプラズマはhPSCの分化能力を変えることができるので、マイコプラズマを含まないhPSCのみを使用してください。
<ol><li>メディアおよび試薬の準備
	<ol>
<li>以下を混合して神経誘導培地(NIM)を調製:ダルベックコの修飾イーグル培地/栄養混合物F-12(DMEM/ F-12、1:1)の500 mL、1%N2サプリメントの5 mL、0.5 mLの0.1%ヘパリン(1x PBSで2mg/mL)、および5mLの1%MEM-NEA-アミノ酸(アミノ酸)。</li>
		<li>DMEM/F-12の300 mL、DMEM基本の200 mL、2%B27サプリメントの10 mL、1%抗生物質抗抗菌薬の5 mL、および1%MEM NEAAの5 mLを含むレチナル分化培地(RDM)を準備します。 注: NIM と RDM の両方はフィルタリングされませんが、滅菌テストが実行されます。培地1mLを取り出し、35mm皿に加え、37°Cと5%CO2のインキュベーターで3〜7日間培養します。培地は4°Cで保存することができ、コンポーネントの活性を確保するために2週間以内に使用する必要があります。</li>
		<li>DMSOで10mMブレビスタチン(1,000x)を準備します。DMSOを1,710 μL加えてブレビスタチンを5mg溶解し、10 mMストック溶液(1,000x)、10μL/チューブでアリコートを得、-20°Cで保存します。 注:特に記載がない限り、すべてのメディアおよび試薬は、使用前に30分間RTで温める必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>胚体(EB)形成
	<ol>
<li>0 日目 (D0) で、分化を開始します。6ウェルプレートからhPSCの1つの井戸を取り出し、合流度が80%に成長しました。ステップ 1.2.1 から 1.2.6 に説明されているように、EDTA 解離解液を使用して細胞を収集します。</li>
		<li>EDTA溶液を取り除き、10 μMブレビスタチンを含むMMを1 mL加えて細胞解離を停止し、1 mLピペットで細胞を採取します。セルの束のサイズは、EB の歩留まりに影響を与える重要な要因の 1 つです。およそ、D5〜D7で適切なサイズのEBを生成するために、束当たり5つの細胞が好ましい。 注: これは重要なステップです。EB様凝集体はhPSCの単一細胞から形成されにくいので、細胞を何度もピペットしないでください。</li>
		<li>細胞懸濁液(約2 x106 細胞)を100mm超低い付着ペトリ皿に移し、10μMブレビスタチンを含む9mLのMMを皿に加えます。</li>
		<li>皿を2回軽く振って細胞を均一に分配し、37°Cと5%CO2でインキュベーターに入れます。</li>
		<li>D1では、細胞を少なくとも24時間培養した後、皿を取り出し、顕微鏡で観察する。この時間までに多数の小細胞凝集体が自発的に形成される(図1C)。</li>
		<li>15 mL チューブに 3:1 の比率 (MM の 9 mL と NIM 3 mL) で MM と NIM との混合 12 mL を準備します。</li>
		<li>細胞培養物を10 mLピペットを垂直に15 mL遠心管に移し、10mLの予温混合物を皿に加えます。</li>
		<li>凝集体を収集するために3分間60 x g でチューブを遠心分離し、5 mLピペットを使用して上清を除去し、細胞を失うことを避けるために約500 μLを残します。</li>
		<li>2 mLの混合物をチューブに加え、懸濁液を同じ皿に移します(ステップ2.2.7)。</li>
		<li>皿を軽く振って細胞の凝集体を均一に分配し、皿をインキュベーターに戻します。</li>
		<li>D2では、15 mLチューブに1:1比(MM 6 mL、NIM6 mL)でMMとNIMを用いた新しい混合物を12 mLで調製します。2.2.5から2.2.10のステップを繰り返して、新鮮な調製混合物で細胞培地を変更する。</li>
		<li>D3では、上述のようにNIMの15mLでセル培地を交換する。細胞を懸濁条件下で少なくとも5日間培養する。 注:D1からD3の間に、十分な栄養を提供し、毎日、媒体を交換する必要があります。D3 以降では、NIM は 1 日おきに変更できます。また、豊富な栄養を提供するために、いくつかの料理に分けることができます。</li>
	</ol></li>
	<li>エブをシードする 注:D5からD7では、ECMコーティングされた料理のEBをEBのサイズに応じてプレートする適切なタイムポイントを選択します。およその直径200 μmのEBは、レチナリの分化に適しています。一般に、6ウェルプレートの1つのウェルのhPSCは、約300〜1,000のEBを生成することができます。EB収量の変動はhPSCラインによって変化する。<ol>
<li>D4では、ECMコーティングされた料理をEBの付着文化のために準備します。100mmの各組織培養皿に5mLのECMを加え(表面処理)し、一晩インキュベーターに入れます。</li>
		<li>D5では、事前にコーティングされた料理からECMを取り出し、各料理に10mLの事前温められたNIMを加えます。</li>
		<li>EBを含む料理を取り出します。顕微鏡下でのエブの品質を確認し、非常に明るく、形が丸いものであることを確認します。EBのサイズは直径約200μmです。15 mLチューブ内のすべてのEBを収集します。5 mL ピペットを使用して、皿から 15 mL チューブに EB を移します。EBを5分間落ち着かせてください。上清の大部分を取り除き、約2mLの培地を残します。</li>
		<li>10 mLのNIMドロップを含むコーティングされた皿に、1 mLピペットで滴下して、そのエブを配ります。密度 2 ~ 3 の密度で、2 ~ cm2の密度で EB をシードします。たとえば、100 mm の皿に約 120 ~ 180 個の EB を追加します。EB数を大まかに判断するには、EB懸濁液をカバースリップに1滴置き、顕微鏡下でEBの数を数えます。 注: エブのめっき密度は、レチン誘導の効率に影響を与える重要な要因の 1 つです。密度は、各hPSCラインによっても調整することができます。</li>
		<li>皿を軽く振って、エブを均一に分配します。37°Cと5%CO2のインキュベーターに入れてください。 注:EBsの付着性を高めるために、少なくとも24時間は食器を動かしないでください。</li>
	</ol></li>
	<li>接着条件下での光学小胞(OV)および網膜色素上皮(RPE)の誘導 注: ECM コーティングされた表面に EB をシードした後、hPSC は OV のような構造を開発でき、これは分化後の D20 で早くも観察できます。このプロトコルでは、特定の成長因子またはシグナル伝達分子は、メディアにN2およびB27サプリメントを添加する以外に、hPSCをレチナル運命に導くために必要とされない。<ol>
<li>D8-D9では、食器を取り出し、顕微鏡下でのエブを観察します。すべての EB が取り付けられ、皿に広がります (図 1D)。10mLの古い培地を含む100mmの皿に新鮮なNIMの10mLを加えます。インキュベーターに戻します。 メモ:古いメディアを削除しないでください。</li>
		<li>D12では、10 mLピペットを使用して、NIMで培地の半分を交換します。培養器に培養物を保管してください。</li>
		<li>D16では、真空吸引システムを使用して、すべてのNIMを皿から取り外します。各皿に20mLのRDMを加えます。RDMで培養を続け、1日おきに培地の半分を交換してください。</li>
		<li>D10-D30の間、顕微鏡で細胞の形態変化を週2回観察し、レチナル分化の効率を評価する。 注: D10 以降、アイ フィールド (EF) ドメインは、付着型の EB の周辺ゾーンで自己組織化されています。OV様構造はD20からD25の間に現れ、皿から徐々に突き出て、そして色素化したRPEに囲まれた光学カップを自己形成する(図1E)。OVは明るく、屈折し、厚いNRリングと容易に認識することができる。</li>
	</ol></li>
	<li>脱離し、分離でOVとRPEを培養し、網膜オルガノイド(ROV)を得る
	<ol>
<li>D28-D35 では、ほとんどの OV が皿に現れます。タングステン針または1 mLシリンジ付きの針を使用して、隣接するRPEと共に形態学的に識別可能なOVを機械的に取り外します。サスペンションでそれらを培養します。 注: OV と RPE の外観と歩留まりは、hPSC ラインによって大きく異なります。これによりOVとRPEを取り外す時点は柔軟です。隣接する RPE を備えた明らかな OV を取り外して、RDM を含む低い添付ファイルカルチャディッシュに移動できます。すべてのOVとRPEが持ち上げられるまで、残りの細胞を培養し続けます。</li>
		<li>R形成用のRDMの15 mLを含む各100 mm低い取り付け培養皿に50-60 OVを入れてください(図1F)。</li>
		<li>ROが十分に丸い形になっているD42まで、RDMを2〜3日ごとに変更します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. レティナルの発達と成熟
注: このプロトコルでは、血清は、長期的な文化のために、ROsの成長と成熟を維持するために必要とされます。
<ol><li>
Rにおけるレチナルラミネートと仕様
	<ol>
<li>1x PBSで100mMタウリン(1,000x)の10mLを調製します。125mgのタウリンを秤量し、10mLの1xPBSに溶解する。0.22 μmのシリンジフィルターで溶液をフィルターします。アリコートは500μL/チューブで、-20°Cで保管してください。</li>
		<li>レチン培養培地1(RC1)を調製する。次のコンポーネントを混ぜます:250 mLのDMEM/F-12、 DMEM基本の175 mL、ウシ胎児血清50mL、2%B27サプリメントの10mL、1%抗生物質抗ミキティック薬の5mL、1%MEM NEAAの5 mL、100 μMタウリンの0.5mL、2 mM L-アラニル-Lグルタミンの5 mL。</li>
		<li>450 mLのDMEM/F-12、50 mLのウシ血清、5 mLの1%N2サプリメント、5 mLの1%抗生物質抗菌薬、0.5 mLの100 μMタウリン、5 mL 1%MEM NEAA、および5 mL Lm-L-L-M-L-m.l.グルトを含むレチナル培地2(RC2)を調製する。 注意: RC1とRC2はフィルタリングされませんが、滅菌試験を受けます。培地を1mL取り出し、35mm皿に加え、37°Cと5%CO2でインキュベーターで3〜7日間培養し、使用前に無菌性を確保します。培地は4°Cで保存することができ、コンポーネントの活性を確保するために2週間以内に使用する必要があります。すべての媒体および試薬は、使用前に30分間RTで予熱する必要があります。</li>
		<li>D42 で、培養培地を RDM から RC1 に切り替えます。</li>
		<li>約30°で皿を傾け、ロは30 sのために落ち着きます。10 mL ピペットで古い RDM を取り外し、約 1 mL の培地を残して、ROs を失わないようにします。新鮮なRC1を15mLずつ加えます。</li>
		<li>皿を軽く振って、一様にロを配ります。皿をインキュベーターに戻します。その後、週に2回、培地全体を変更します。</li>
		<li>D50-D90の間に、厚くて明るいNRで丸い形をした長期培養のためのRの高品質を選択します。RC1の20 mLで100mmの低い取り付け皿に30-40のロを入れ、週に2回、培地全体を交換してください。</li>
		<li>ROの長期懸濁液培養では、ピペットを使用したRO-RO再アタッチを回避するために、ROをピペット化します。新しい文化料理に新しい文化料理にロを移すので、料理の表面に付着しないようにします。 注意:サスペンション培養条件下では、ROは丸型で、明るく厚いNRリングが一方の側に多かれ少なかれRPEを取り付けています。ラミネート神経幹細胞は、最初に生成された神経節細胞を初めて発生させた後、感光体細胞、アマリン細胞、および双極細胞と共に、次いで連続して発現する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rのコーンの富を有するヒト感光体成熟
	<ol>
<li>D90の後、光受容体成熟に適したRC1からRC2に媒体を切り替えます。</li>
		<li>手順 3.1.7~3.1.8 の説明に従って、メディアを変更します。 注: このカルチャ条件下では、ROs は、テストされた D300 まで、長期的に成長できます (図 1G)。Rのレチナル細胞は成熟し、ミュラーグリア細胞、ロッド、コーンを含む神経性レチナのすべての細胞サブタイプも取得されます。RAを添加することなく、錐体の感光体もROに富む。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Flaxman, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+causes+of+blindness+and+distance+vision+impairment+1990-2020%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Global+Health%22%5BJournal%5D)">Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), 1221-1234 (2017).</li>
<li>Sayed, N., Liu, C., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+human-induced+pluripotent+stem+cells%3A+From+clinical+trial+in+a+dish+to+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Translation of human-induced pluripotent stem cells: From clinical trial in a dish to precision medicine.</a> Journal of American College of Cardiology. 67 (18), 2161-2176 (2016).</li>
<li>Capowski, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducibility+and+staging+of+3D+human+retinal+organoids+across+multiple+pluripotent+stem+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reproducibility and staging of 3D human retinal organoids across multiple pluripotent stem cell lines.</a> Development. 146 (1), (2019).</li>
<li>Brooks, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+retinal+organoid+differentiation+by+modulating+signaling+pathways+revealed+by+comparative+transcriptome+analyses+with+development+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Improved retinal organoid differentiation by modulating signaling pathways revealed by comparative transcriptome analyses with development in vivo.</a> Stem Cell Reports. 13 (5), 891-905 (2019).</li>
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Xiufeng Zhongは、ヒト多能性幹細胞からのレチナル細胞の生成に関連する特許発明者である。

この多段階のレチナル誘導プロトコルでは、hPSCを、レチナル運命を得るためにステップバイステップで導かれ、かつ、積層NRおよびRPEを含むレチナルオルガノイドに自己組織化した。分化の間、hPSCは、EF、OV、RPEから、レチナルラミネート、レチナル細胞、アマクライン細胞、双極細胞、ロッド、円錐光受容体、および円膜のグリア細胞および時間的空間細胞および時間的空間細胞におけるヒトの腎細胞の発達のすべての主要なステップを要約した。 レチンの発達の再現は、疾患のモデル化などの下流のアプリケーションに利益をもたらすだろう。
hPSC3,4,5,6,<sup class...

網膜変性疾患(RD)は、加齢黄斑変性症(AMD)および網膜色素変性症(RP)などの、光受容体細胞の機能不全および死を特徴とし、典型的には、効果的な治療法なしに不可逆的な視力喪失を導く1。これらの疾患の根底にあるメカニズムは、ヒト疾患モデル2の不足のために部分的にはほとんど知られていない。過去数十年にわたり、幹細胞技術を通じて再生医療において大きな進歩が遂げられています。私たち自身を含む多くの研究者は、ヒト胚性幹細胞(hESC)およびヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)を含むヒト多能性幹細胞(hPSC)が、様々な分化アプローチ3、4、5、7、8、9、10を介してあらゆるタイプのレチナル細胞に分化できることを示している。11、疾患のモデリングと細胞療法12、13、14に大きな可能性を提供する。
しかし、hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは非常に複雑で時間がかかり、再現性が低いため、経験豊富で高いスキルを持つ研究者が必要です。複雑で動的な誘導プロセスの間、多くの要因が、15、16、17の組織の収率に影響を与えます。また、異なる誘導方法は、しばしば、サンプル収集とデータ解釈を混乱させる可能性のある、レチンマーカーのタイミングと堅牢な発現でかなり異なる。したがって、ステップバイステップのガイダンスを持つhPSCからのレチナル分化の簡単なプロトコルが必要になります。
ここでは、18,19,20,21の研究に基づき、hPSCから豊富な円錐型感光体を有するレチナルオガノイド(R)を生成するための最適化されたレチナル誘導プロトコルが記載されており、レチノイン酸(RA)のサプリメントを必要としない。このプロトコルは、神経のレティナとRPEを生成するマルチステップ法の記述に焦点を当てています。EB形成は、早期誘導段階の必須部分です。EBsのサイズとめっき密度の両方が定量的に最適化され、これは科学的に、レチン組織の収量を高め、反復性を促進します。誘導の第2部では、光学小胞(OV)は、懸濁液培養におけるアドヒアランス培養およびROV形態において自己組織化する。この部分のタイムコースと効率は、異なるhPSCラインで大きく異なります。Rの細胞の成熟と指定は、主に誘導の中間段階と後期段階で起こります。RAを添加することなく、豊かなコーンとロッドの両方を持つ成熟した感光体を作り出すことができます。
このプロトコルの目的は、経験の浅い研究者が繰り返すために各ステップを定量的に記述し、詳細に記述することです。さまざまなhPSCラインは、このプロトコルにより、錐が豊富なレチナル組織の堅牢な収率と高い再現性を持つROsにうまく誘導されています。このプロトコルを用いたHPSCs由来のROsは 、生体内でのレチナル開発の主なステップを再現し、疾患モデリング、薬物スクリーニング、細胞治療などの下流のアプリケーションを容易にする長期的な生存を可能にします。

<table><tbody><tr><td>(&マイナス;)-ブレビスタチン</td><td>シグマ</td><td>B0560-5mg</td><td>ROCK-inhibitor</td></tr><tr><td>1 ml tips</td><td>Kirgen</td><td>KG1313</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>10 ml ピペット</td><td>Sorfa</td><td>3141001</td><td>Pipette</td></tr><tr><td>100 mm 組織培養</td><td>BIOFIL</td><td>TCD000100</td><td>100 mm ペトリ皿</td></tr><tr><td>100 mm 組織培養</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>100 mm ペトリ皿</td></tr><tr><td>15 ml 遠心分離管</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011150</td><td>遠心分離管</td></tr><tr><td>35 mm 組織培養皿</td><td>ファルコン</td><td>353001</td><td>35 mm ペトリ皿</td></tr><tr><td>5 ml ピペット</td><td>Sorfa</td><td>313000</td><td>ピペット</td></tr><tr><td>50 ml 遠心分離管</td><td>BIOFIL</td><td>CFT011500</td><td>遠心分離管</td></tr><tr><td>6 ウェル 組織培養プレート</td><td>Costar</td><td>3516</td><td>培養プレート</td></tr><tr><td>アンチ AP2&alpha;抗体</td><td>DSHB</td><td>3b5</td><td>一次抗体&nbsp;抗体</td></tr><tr><td>ANTIBIOTIC ANTIMYCOTIC 100X</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Antibiotic-Antimycotic</td></tr><tr><td>Anti-ISL1 Antibody</td><td>Boster</td><td>BM4446</td><td>Primary&nbsp;抗体</td></tr><tr><td>抗Ki67抗体</td><td>アブカム</td><td>ab15580</td><td>プライマリー&nbsp;抗体</td></tr><tr><td>抗L/M オプシン抗体</td><td>Dr. jeremy</td><td>/</td><td>Primaryからの贈り物&nbsp;抗体</td></tr><tr><td>抗PAX6抗体</td><td>DSHB</td><td>pax6</td><td>Primary&nbsp;抗体</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31572</td><td>Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-Recoverin Antibody</td><td>Millipore</td><td>ab5585</td><td>Primary&nbsp;抗体</td></tr><tr><td>抗ロドプシン抗体</td><td>Abcam</td><td>ab5417</td><td>Primary&nbsp;抗体</td></tr><tr><td>Anti-sheep 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21436</td><td>Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555</td></tr><tr><td>Anti-SOX9 Antibody</td><td>Abclonal</td><td>A19710</td><td>Primary&nbsp;抗体</td></tr><tr><td>抗VSX2抗体</td><td>Millipore</td><td>ab9016</td><td>Primary&nbsp;抗体</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント W/O VIT A (50X)</td><td>Gibco</td><td>12587010</td><td>Supplement</td></tr><tr><td>Cryotube vial</td><td>Thermo scientific-NUNC</td><td>375418</td><td>1.8 ml</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>同人堂</td><td>D532</td><td>4',6-ジアミディノ-2-フェニルリンドール 二塩酸塩; 複数の供給者</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO) Hybri-max</td><td>Sigma</td><td>D2650-100ML</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>Medium</td></tr><tr><td>DMEM /F12</td><td>Gibco</td><td>C11330500BT</td><td>Medium</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-020</td><td>0.5 M PH 8.0</td></tr><tr><td>FBS</td><td>NATOCOR</td><td>SFBE</td><td>Serum</td></tr><tr><td>Filter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>0.22&mu;m、滅菌 Millex フィルター</td></tr><tr><td>GlutaMax、100X</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td>L-アラニル-L-グルタミン</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma</td><td>H3149</td><td>2 mg/ml in PBS to use</td></tr><tr><td>Matrigel、100x</td><td>Corning</td><td>354277</td><td>Extracellular matrix (ECM)</td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>MEM NEAA</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEM CELL</td><td>85850</td><td>hPSCs 維持培地 (MM)</td></tr><tr><td>N2 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Supplement</td></tr><tr>Ca+,Mg+,PH7.2 なしの<td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 緩衝液</td><td>GNM</td><td>GNM10010</td><td>&plusmn;0.1 0.1M</td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマ</td><td>T0625</td><td>サプリメント</td></tr><tr><td>超低付着培養皿 100mmシャーレ、低アタッチメント</td><td>コーニング</td><td>CLS3262-20EA</td><td>シャー</td></tr></tbody></table>レ

ヒト多能性幹細胞からの3dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

Retinal Organoid Induction System for Derivation of 3D Retinal Tissues from Human Pluripotent Stem Cells

レチンバル性疾患は、効果的な治療を伴わない不可逆的失明の主な原因である。多能性幹細胞は、あらゆるタイプのレチナル細胞(ミニレチナル組織)に分化する可能性を秘めており、これらの疾患を有する患者に対して大きな約束をし、疾患モデリングや薬物スクリーニングにおいて多くの機会を得ています。しかし、hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは複雑で時間がかかります。ここでは、多様なヒト多能性幹細胞に適した、高い再現性と効率を持つレチナル組織を生成するための最適化されたレチナル誘導プロトコルについて述べます。このプロトコルは、レチノイン酸を添加することなく実行され、これは錐体の光受容体の濃縮に利益をもたらします。このプロトコルの利点は、レチン誘導の効率と再現性を大幅に向上させるEBサイズとめっき密度の定量化です。この方法では、すべての主要なレチン細胞が順次現れ、レチンの主な段階を再現します。疾患のモデル化や細胞治療などの下流のアプリケーションを容易にします。

このプロトコルのレチナル誘導プロセスは、ヒト胎児の胎児の発育を模倣する。レチナリの分化を開始するために、hPSCを小さな塊に解き分け、懸濁液中で培養して、EBの形成を誘導した。D1では、均一な細胞凝集体またはEBが形成される(図1C)。培養培地は徐々にNIMに移行した。D5では、ECMコーティングされた文化料理にEBをメッキしました。細胞は徐々にエブから移行します(図1D)。D10から、眼球は付着性のEBsの周辺ゾーンで自己組織化した。D16では、誘導媒体をRDMに置き換えた。その後、NRドメインが徐々に形成され、皿から突き出て、RPE細胞に囲まれた自己形成OV様構造が形成された(図1E)。D28-D35の間に、隣接するRPEと共にOVは鋭い針で持ち上げられ、懸濁液で培養された。懸濁培養条件下では、一方の側に多かれ少なかれRPE球を付けた神経性レチナ(NR)を含むR(NR)を含む自己形成し、FBSが培...

ここでは、ヒトの多能性幹細胞株が再現性と効率の高い人工組織を生成するのに適した最適化されたレチナルオルガノイド誘導システムについて説明します。

ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

Retinal degenerative diseases are the main causes of irreversible blindness without effective treatment. Pluripotent stem cells that have the potential to ...

hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは複雑で時間がかかります。この最適化されたプロトコルは、高い再現性と無コストで、レチナル組織を生成することができます。このプロトコルの利点は、hPSCからのレチナル誘導の効率と再現性を大幅に高めるために、EBサイズとめっき密度を定量化することです。この方法では、すべての主要なレチン細胞が順次現れ、レチンの主な段階を再現します。それは、疾患のモデリングと、疾患の変性疾患の細胞治療を促進します。この手順をデモンストレーションすると、博士課程の学生である元元光と、研究室の技術者であるビンビン・シーと一緒です。DMEMの50 mLに3番目の50回のストック溶液の1 mLを加えることによって、50 mLのECM溶液を調製することから始めます。次に、6ウェルプレートのウェルにこの調製ECM溶液の1mLを加え、摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間インキュベートします。hPSCメンテナンス媒体は、メーカーの指示に従って準備し、室温まで30分間プリウォームします。液体窒素タンクからhPSCの極低温バイアルを30秒間摂氏37度の水浴でインキュベートして注ぎます。75%のアルコールスプレーを使用して慎重に消毒し、バイオセーフティキャビネットに入れます。バイアルから15ミリメートルのチューブにセルサスペンションを移します。その後、5 mL ピペットを使用して、5 mL の予温メンテナンスメディアを滴下してチューブに加え、チューブを軽く振ってhPSCをブレンドします。チューブを170回Gで5分間遠心する。慎重に細胞を失うことを避けるために上清の約50マイクロリットルを残して、1 mLピペットを使用して上清のほとんどを除去します。ペレットを1 mLの維持媒体で再懸濁し、上下にピペット処理します。事前にコーティングされたウェルからECMを取り出し、各井戸に1.5ミリリットルのメンテナンス媒体を加えます。その後、各ウェルに細胞懸濁液の0.5ミリリットルを配布します。プレートを軽く振ってhPSCを均一に分配します。プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、少なくとも24時間は5%の二酸化炭素を入れて細胞の付着を促進します。毎日培地を交換し、通過hPSCを80%合流で変更します。Day-0では、6ウェルプレートの1つのウェルから80%合流細胞を除去して分化を開始します。テキスト原稿に記載されているように、EDTA解離解液を有する細胞を収集する。EDTA溶液を取り出し、10マイクロモルフルバスタチンを含む維持培地1mLを加えて細胞解離を停止します。1 mL ピペットで細胞を収集します。セル懸濁液を100ミリメートル超低いペトリ皿に移し、10マイクロモルフルバスタチンを含むメンテナンス培地の9mLを皿に加えます。皿を2回軽く振って細胞を均一に分配します。その後、37°Cと5%の二酸化炭素でインキュベーターに入れます。細胞を少なくとも24時間培養した後、顕微鏡下でそれらを観察する。15 mLチューブに9mLのメンテナンス媒体と3mLのNIMを加えます。細胞培養物を15 mL遠心チューブに移し、あらかじめ温めたNIM混合物を10mL加えます。凝集体を集めるために3分間Gの60倍でチューブを遠心分離する。その後、5 mL ピペットを使用して上清を除去し、約 500 マイクロリットルを残して細胞を失うことを避けます。チューブに2mLの混合物を加え、サスペンションを同じペトリ皿に戻します。皿を軽く振って、細胞の凝集体を均一に分配します。その後、皿をインキュベーターに戻します。5日目には、あらかじめコーティングされた料理からECMを取り出し、各料理に10 mLの事前温めたNIMを追加します。Ebsを含む料理を取り出し、顕微鏡の下でEBの品質を確認し、明るく丸いかどうかを確認します。15 mLチューブにすべてのEBを収集し、5分間の決済を許可します。次に、上清の大部分を取り出し、約2mLの培地を残した。EBを数えた後、10 mLのNIMを含むコーティングされた皿に1平方センチメートルあたり約2〜3 EBの密度でドロップバイドロップします。皿を軽く振ってEJBを均一に分配し、少なくとも24時間保育器に入れます。タングステン針または1mLシリンジ付きの針を使用して、28日から35日目に隣接する網膜色素上皮と共に、形態学的に識別可能な眼小胞を機械的に取り外します。サスペンションでそれらを培養します。レチナルオルガノイド形成のためのRDMの15 mLを含む各100ミリメートル低い取り付け培養皿に50-60の光学小胞を入れてください。日-42まで2〜3日ごとに媒体を変更します。レチナル分化を開始するために、hPSCは小さな塊に解き分け、懸濁液中で培養され、1日目からEBを形成した。5日目にECMコーティングされた培養皿にメッキされ、細胞は徐々にEBから移行した。16日目、誘導培地をRDMに置き換え、神経失調ドメインを形成し、徐々に皿から突き出て、またRPE細胞に囲まれた光学的小胞様構造を形成する細胞を引き起こした。日-28〜35の間に、神経性レチナからなるレチナルオノイドは、RPE球に結合した。片側に、細胞が形成される。また、ヒトのネイティブな人のレティナの建築的特徴を模倣して、徐々に層に並ぶ神経性の亜型を作り出した。レチナルガングリオン細胞は、まず、神経性前駆細胞から生成され、神経性の腎の基底側に蓄積された。このプロトコルにより、レチナルオルガノイドは、豊かなロッドとコーンの両方を備えた高度に成熟した感光体に発展しました。感光体細胞は、アマセリン細胞、水平細胞、双極細胞およびミュラーグリア細胞の間に位置し、全ては神経のレチナの中間層に位置していた。このプロトコルの重要なポイントは、Ebsの高品質を作成し、適切な密度でそれらをシードすることです。

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多能性幹細胞から特殊な網膜細胞の生産は、網膜疾患の幹細胞を用いた治療法の開発のターニング...

Xeno 無料の定義された、人間の世代の iPSC 由来網膜細胞モデル フィーダー フリー培養条件

ここでは、成熟ヒト網膜オルガノイドを生成し、それらを光受容体毒性アッセイに利用して、加齢性網膜変性疾患黄斑毛細血管拡張症2型(MacTel)の医薬品候補を特定するための段階的なプロトコルを紹介します。...

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健常および網膜疾患特異的ヒト誘起多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの作製

本プロトコルは、高い再現性と効率で網膜オルガノイドの接着と融合を減少させる最適化された3D神経網膜誘導システムについて説明しています。...

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ミクログリアは、網膜に特異的に存在した免疫細胞であり、さまざまな網膜変性疾患において重要な役割を果たしています。網膜オルガノイドとミクログリアの共培養モデルを作成することで、網膜疾患の病因と発症の進行の理解を深めることができます。...

ミクログリアによる網膜オルガノイドの組み立て

このプロトコールは、光学的透明化と免疫標識を組み合わせて、ホールマウント網膜オルガノイドの全容積共焦点イメージングを実現します。3D構造を保持し、主要なニューロン経路の詳細な視覚化を可能にし、網膜の成熟、空間構成、および疾患モデリングや個別化医療への応用の可能性の研究を改善します。...

細胞分解能によるホールマウントRetinal Organoidの可視化

本稿では、消費税角膜に単純化した技術を説明し、人間の死体ドナーの眼の世界から網膜組織を骨抜きにする。ここで説明する手法は眼球の他の組織を損なうことなく移植、外科的または研究目的のために使用されて消費税質の良い組織に役立ちます。...

の簡略化手法<em&gt;その場</em人間の眼球から角膜と網膜組織の空洞化の&gt;切除

のいずれかを使用して人間の歯髄幹細胞（hDPSCs）の単離および特性を説明する方法...

単離、特徴付けと二つの異なる方法を使用して永久歯に由来するヒト歯髄幹細胞の分化の比較

私たちは、網膜剥離のトランスクリプトーム解析のために網膜切除から網膜のサンプルを使用していました。我々は外科ブロックと実験室間のRNA保全を可能に手順を開発しました。我々は精製されたRNAはマイクロアレイ解析に適していることを保証するために、塩化セシウム遠心法によってRNAを精製するための標準化されたプロトコル。...

ジャーナルを用いたヒト網膜手術標本のトランスクリプトーム解析

学ぶ ヒト多能性幹細胞から3Dレチナルオガノイドを誘導する効率的なプロトコル。エンブリオイドボディのサイズとプラティング密度を定量化することで、網膜細胞の再現性のある分化を実現し、疾患モデリングや細胞治療への応用が可能です。

ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

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