ヒト多能性幹細胞からの3Dレチナル組織の導出のためのレチナルオガノイド誘導システム

ここでは、ヒトの多能性幹細胞株が再現性と効率の高い人工組織を生成するのに適した最適化されたレチナルオルガノイド誘導システムについて説明します。

hPSCからレチナル細胞への誘導プロセスは複雑で時間がかかります。この最適化されたプロトコルは、高い再現性と無コストで、レチナル組織を生成することができます。このプロトコルの利点は、hPSCからのレチナル誘導の効率と再現性を大幅に高めるために、EBサイズとめっき密度を定量化することです。

この方法では、すべての主要なレチン細胞が順次現れ、レチンの主な段階を再現します。それは、疾患のモデリングと、疾患の変性疾患の細胞治療を促進します。この手順をデモンストレーションすると、博士課程の学生である元元光と、研究室の技術者であるビンビン・シーと一緒です。

DMEMの50 mLに3番目の50回のストック溶液の1 mLを加えることによって、50 mLのECM溶液を調製することから始めます。次に、6ウェルプレートのウェルにこの調製ECM溶液の1mLを加え、摂氏37度と5%の二酸化炭素で1時間インキュベートします。hPSCメンテナンス媒体は、メーカーの指示に従って準備し、室温まで30分間プリウォームします。

液体窒素タンクからhPSCの極低温バイアルを30秒間摂氏37度の水浴でインキュベートして注ぎます。75%のアルコールスプレーを使用して慎重に消毒し、バイオセーフティキャビネットに入れます。バイアルから15ミリメートルのチューブにセルサスペンションを移します。

その後、5 mL ピペットを使用して、5 mL の予温メンテナンスメディアを滴下してチューブに加え、チューブを軽く振ってhPSCをブレンドします。チューブを170回Gで5分間遠心する。慎重に細胞を失うことを避けるために上清の約50マイクロリットルを残して、1 mLピペットを使用して上清のほとんどを除去します。

ペレットを1 mLの維持媒体で再懸濁し、上下にピペット処理します。事前にコーティングされたウェルからECMを取り出し、各井戸に1.5ミリリットルのメンテナンス媒体を加えます。その後、各ウェルに細胞懸濁液の0.5ミリリットルを配布します。

プレートを軽く振ってhPSCを均一に分配します。プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、少なくとも24時間は5%の二酸化炭素を入れて細胞の付着を促進します。毎日培地を交換し、通過hPSCを80%合流で変更します。

Day-0では、6ウェルプレートの1つのウェルから80%合流細胞を除去して分化を開始します。テキスト原稿に記載されているように、EDTA解離解液を有する細胞を収集する。EDTA溶液を取り出し、10マイクロモルフルバスタチンを含む維持培地1mLを加えて細胞解離を停止します。

1 mL ピペットで細胞を収集します。セル懸濁液を100ミリメートル超低いペトリ皿に移し、10マイクロモルフルバスタチンを含むメンテナンス培地の9mLを皿に加えます。皿を2回軽く振って細胞を均一に分配します。

その後、37°Cと5%の二酸化炭素でインキュベーターに入れます。細胞を少なくとも24時間培養した後、顕微鏡下でそれらを観察する。15 mLチューブに9mLのメンテナンス媒体と3mLのNIMを加えます。

細胞培養物を15 mL遠心チューブに移し、あらかじめ温めたNIM混合物を10mL加えます。凝集体を集めるために3分間Gの60倍でチューブを遠心分離する。その後、5 mL ピペットを使用して上清を除去し、約 500 マイクロリットルを残して細胞を失うことを避けます。

チューブに2mLの混合物を加え、サスペンションを同じペトリ皿に戻します。皿を軽く振って、細胞の凝集体を均一に分配します。その後、皿をインキュベーターに戻します。

5日目には、あらかじめコーティングされた料理からECMを取り出し、各料理に10 mLの事前温めたNIMを追加します。Ebsを含む料理を取り出し、顕微鏡の下でEBの品質を確認し、明るく丸いかどうかを確認します。15 mLチューブにすべてのEBを収集し、5分間の決済を許可します。

次に、上清の大部分を取り出し、約2mLの培地を残した。EBを数えた後、10 mLのNIMを含むコーティングされた皿に1平方センチメートルあたり約2〜3 EBの密度でドロップバイドロップします。皿を軽く振ってEJBを均一に分配し、少なくとも24時間保育器に入れます。

タングステン針または1mLシリンジ付きの針を使用して、28日から35日目に隣接する網膜色素上皮と共に、形態学的に識別可能な眼小胞を機械的に取り外します。サスペンションでそれらを培養します。レチナルオルガノイド形成のためのRDMの15 mLを含む各100ミリメートル低い取り付け培養皿に50-60の光学小胞を入れてください。

日-42まで2〜3日ごとに媒体を変更します。レチナル分化を開始するために、hPSCは小さな塊に解き分け、懸濁液中で培養され、1日目からEBを形成した。5日目にECMコーティングされた培養皿にメッキされ、細胞は徐々にEBから移行した。

16日目、誘導培地をRDMに置き換え、神経失調ドメインを形成し、徐々に皿から突き出て、またRPE細胞に囲まれた光学的小胞様構造を形成する細胞を引き起こした。日-28〜35の間に、神経性レチナからなるレチナルオノイドは、RPE球に結合した。片側に、細胞が形成される。

また、ヒトのネイティブな人のレティナの建築的特徴を模倣して、徐々に層に並ぶ神経性の亜型を作り出した。レチナルガングリオン細胞は、まず、神経性前駆細胞から生成され、神経性の腎の基底側に蓄積された。このプロトコルにより、レチナルオルガノイドは、豊かなロッドとコーンの両方を備えた高度に成熟した感光体に発展しました。

感光体細胞は、アマセリン細胞、水平細胞、双極細胞およびミュラーグリア細胞の間に位置し、全ては神経のレチナの中間層に位置していた。このプロトコルの重要なポイントは、Ebsの高品質を作成し、適切な密度でそれらをシードすることです。