Name: マウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 54 s
Description: 学ぼうマウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作技術。レンチウイルス感染、siRNA導入、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子改変法を含む詳細な培養・継代プロトコルを解説します。

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組み換えR-spondin1を生産するための細胞株を親切に提供してくれたハンス・クレバーズ教授に感謝します。この研究は、中国国家主要研究開発プログラム(2019YFA0111400)、中国国立自然科学財団(31970779)からH.H.、山東大学青少年学際イノベーション研究グループ(2020QNQQT003)からH.H.への助成金によって支えられました。

すべてのマウス実験は、山東大学基礎医学部動物管理・使用委員会によって承認され、内務省のガイドラインと規制に基づくライセンスに従って実施されました(No.ECSBMSSDU2019-2-079)。
注:このプロトコルは、主に孤立した原発肝細胞から3Dオルガノイドを培養するために使用されます。
1. ネズミ肝細胞オルガノイド文化の確立
注:MatrigelやBMEなどの細胞外マトリックスは、培養オルガノイドの地下マトリックスとして使用されます。細胞外マトリックスを-20°Cに保存し、4°Cまたは氷上で解凍します。実験中は、細胞外マトリックスを氷の上に置いてください。洗浄媒体は、グルタマックス、HEPESおよびペニシリン/ストレプトマイシンを添加した高度なDMEM/F12である。標準インキュベーター(37°C、加湿雰囲気、5%CO2)をオルガノイド培養に使用します。
<ol><li>材料の準備<ol>
<li>実験に必要な器具を準備します:マウス枕、ピンセット、はさみ、チューブ、および2-10 mL /分の流量のポンプのような無菌の外科用器具。</li>
		<li>灌流バッファー、消化バッファーを含む試薬を調製し、肝細胞の分離のためにそれらを無菌にします。新鮮なIV型コラゲレーターーゼ(0.10 mg/mL)とCaCl2 (0.50 M)を加え、37°Cのバッファーを水浴で事前に温めます。</li>
		<li>メーカーの指示に従ってR-spondin 1とすべての化学および成長因子の株式を生産するために条件付き媒体を準備します。 注:条件付きメディアや株式を頻繁に凍結して解凍しないでください。培養液を新鮮に準備し、1ヶ月以内に使用してください。これはオルガノイド形成効率に重要です。</li>
	</ol></li>
	<li>肝臓灌流と消化によるマウス肝細胞分離 注:12週から6ヶ月の間の雄または雌のマウスは、オルガノイド培養に使用された。この範囲内のドナーマウスの年齢からオルガノイド形成効率に明らかな違いは見つからなかった。<ol>
<li>倫理的に承認された方法でマウスを安楽死させる。</li>
		<li>マウスピローにマウスを固定し、70%アルコールで腹部の毛皮と皮膚をきれいにします。腹部を露出し、体の残りの部分の上に肝臓を持ち上げます.肝臓を露出させるために正中切開を行います.</li>
		<li>ポンプに取り付けられたチューブを灌流バッファーで満たします。門脈(静脈の直径の約1/3)を切開し、慎重にカテーテルを入れます。カニューレを挿入するために消化器官を持ち上げます。外科ラインとのネクタイは滑り出して破裂することを避けるために任意である。</li>
		<li>ポンプを開始し、灌流バッファーで5〜7 mL/minの流量で灌流を行います。肝臓が直ちに青白くなった場合は、下の静脈を切って、灌流バッファーが肝臓全体を流れ、血液を追い出すことができます。</li>
		<li>流出がきれいになったら、カニューレを取り外します。所要時間は約5~10分です。</li>
		<li>5 mL/minの速度で、あらかじめ温めた消化バッファーで灌流バッファーを変更します。肝臓が柔らかくなり、うねりになるまでポンプを止めないでください。肝臓が腫れを止めたらカテーテルを取り除く。 注:過度の消化を避け、単一の肝細胞を取得するために適切な消化時間を維持することが非常に重要です。</li>
		<li>肝臓を切り落とし、15mLの冷たい洗浄媒体で満たされた100mmのプレートに入れる。靭帯を小さいはさみで切ります。ピペットの先端または鉗子で肝臓を粉々に裂く。</li>
		<li>ピペットは、バッファーが細胞で飽和するまで細胞を放出するために穏やかに上下します(12〜15回)。70 μmフィルターを通して50 mLチューブにセル懸濁液を注ぎます。</li>
		<li>50xgおよび4°Cで1〜3分間遠心分離機。 上清をデカントします。必要に応じて、洗浄培地で細胞を再懸濁するか、培養培地で細胞を直接再懸濁する。マカチ計で細胞を数えます。</li>
		<li>生細胞染色染色後の細胞カウンターマシンにより、生細胞または死細胞を区別する。 注:それは寒い40%パーコールを使用して肝細胞を浄化するのが最善です。このステップの後、実行可能な肝細胞は、チューブの底になります。</li>
	</ol></li>
	<li>オルガノイドの培養と通路<ol>
<li>上清を取り除き、3:1の比率で細胞外マトリックスと培養培地の混合物で肝細胞を再懸濁する。 注:24ウェルプレートのウェルあたり50〜60 μLの混合物に10,000-20,000個の細胞が推奨されます。迅速に作業し、プロセス全体を通して氷の上に混合物を保つことが重要です。200-500オルガノイドは、この濃度で形成することができる。</li>
		<li>小さな液滴でプレート上の細胞/混合物のドロップを追加し、液滴が一緒に接続するのを防ぎます。プレートを37°Cで細胞インキュベーターにインキュベートし、5〜10分間5%CO2 でプレートを取り出し、細胞外マトリックスが固体になるまで20〜25分間プレートを取り出します。</li>
		<li>培養培地(24ウェルプレートの場合はウェルあたり500μL)をウェルに加え、オルガノイド培養用インキュベーターにプレートを戻します。3~4日ごとに培地を変更します。オルガノイドが十分な大きさになるまで観察します。 注:約400〜500 μmの直径は、肝細胞オルガノイドの通過に適しています。</li>
		<li>以下の詳細なプロセスで細胞外マトリックスからオルガノイドを分離します。ガラスのパスツールピペットを炎に入れ、絞りを狭くします(〜1/2)。機械的にピペットを上下5〜10回、パセパジング中にオルガノイドを小さなオルガノイドに解体する。 注:通過中に、チューブや先端に付着するオルガノイドの損失を避けるために、チップ洗浄バッファー付きのプリ洗浄マイクロピペットの先端とチューブを準備します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. マウス肝細胞オルガノイドの遺伝子操作
<ol><li>肝細胞オルガノイドからの単細胞<ol>
<li>各ウェルに500 μLの冷たい洗浄媒体/細胞回収液を加えます。ピペットは、マイクロピペットで細胞/細胞外マトリックス混合物を破壊し、オルガノイド懸濁液を氷上の15 mL遠心分離管に移します。必要に応じて、チューブを時々上下に回して、混合物を完全に解凍します。</li>
		<li>500-800 x g および4°Cで5分間遠心分離機を使用し、上清を捨てます。ペレットに1mLのトリプシン溶液を加え、それを混合するピペットを加えます。37°Cで5〜10分間インキュベートし、2倍の量の洗浄媒体を加えて消化を止めます。</li>
		<li>800xgと4°Cで5分間遠心分離機を使用し、上清を捨てます。ペレットを培地で再懸濁し、マカチメーターを用いて細胞を数える。</li>
	</ol>
</li>
	<li>siRNA またはプラスミドトランスフェクション 注:直径50μm未満の小さなオルガノイドまたは肝細胞オルガノイドからの単一細胞は、製造業者の指示に従ってトランスフェクション試薬を使用してリポフェクトアミンまたはプラスミドを使用してsiRNAにトランスフェクトをトランスフェクトします。<ol>
<li>siRNAまたはプラスミドをトランスフェクション試薬と混合します。オルガノイドおよびリポフェクタミンRNA/リポプラスミド混合物(RNAiMAXなど)から1-2ウェルに1-2ウェルに単一細胞を加え、遠心分離機を500 x gおよび32°Cで1時間追加します。 遠心分離後、37°Cで4〜5時間インキュベーターにプレートをインキュベートする。</li>
		<li>細胞を収集し、ウェルあたり10,000細胞の濃度で培養培地で細胞外マトリックスに種子を採取します。トランスフェクションの2日後に培地を選択条件に変更します。10日後にオルガノイド形成効率を評価する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>レンチウイルス感染 注:直径50μm未満の小さなオルガノイドや肝細胞オルガノイドの単一細胞は、メーカーの指示に従って感染試薬媒体を使用してレンチウイルスに感染しています。<ol>
<li>オルガノイドからの単細胞懸濁液の250 μLと1.5 mLチューブ内のウイルス粒子の250 μLを混合します。</li>
		<li>混合物と遠心分離機を500 x gおよび32°Cで1時間プレートします。 37°Cで4〜5時間インキュベートする。</li>
		<li>培養培地で細胞および種子を細胞外マトリックスに集めます。トランスフェクションの2日後に培地を選択条件に変更します。10日後にオルガノイド形成効率を評価する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>CRISPR/Cas9による遺伝子工学 注:私たちは、補足資料でこのパフォーマンスのためのビデオを提供します。オルガノイドからの単一細胞はレンチウイルスに感染したか、sgRNAおよびCas9を運ぶプラスミドによってトランスフェクトされた。<ol>
<li>上記の方法に従って培養した肝細胞オルガノイドから単一細胞を消化する。</li>
		<li>メーカーの指示に従ってOpti-MEM培地および感染試薬を使用して、単一細胞をsgRNAに感染させます。</li>
		<li>1.5 mLチューブに150μLの単細胞懸濁液と250μLのウイルス粒子を混ぜ合わせます。</li>
		<li>500 μLの混合物を500 x gおよび32°Cで1時間遠心分離し、37°Cで4〜5時間インキュベートする。</li>
		<li>細胞外マトリックスに細胞懸濁液と種子を収集します。10日後にオルガノイド形成効率を評価する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organogenesis+in+a+dish%3A+modeling+development+and+disease+using+organoid+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Organogenesis in a dish: modeling development and disease using organoid technologies.</a> Science. 345 (6194), 124-125 (2014).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
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<li>Paola, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+brain+organoids+reproducibly+form+cell+diversity+of+the+human+cerebral+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex.</a> Nature. 570, 523-527 (2019).</li>
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<li>Forbes, S. J., Newsome, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration-mechanisms+and+models+to+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Gastroenterol+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration-mechanisms and models to clinical application.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 13 (8), 473-485 (2016).</li>
<li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Expansion+of+Primary+Human+Hepatocytes+with+Efficient+Liver+Repopulation+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">In Vitro Expansion of Primary Human Hepatocytes with Efficient Liver Repopulation Capacity.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 806-819 (2018).</li>
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<li>Hu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Expansion+of+Functional+Mouse+and+Human+Hepatocytes+as+3D+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-Term Expansion of Functional Mouse and Human Hepatocytes as 3D Organoids.</a> Cell. 175 (6), 1591-1606 (2018).</li>
<li>Peng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+Cytokine+TNFalpha+Promotes+the+Long-Term+Expansion+of+Primary+Hepatocytes+in+3D+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Inflammatory Cytokine TNFalpha Promotes the Long-Term Expansion of Primary Hepatocytes in 3D Culture.</a> Cell. 175 (6), 1607-1619 (2018).</li>
<li>Xiang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+functional+maintenance+of+primary+human+hepatocytes+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Long-term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro.</a> Science. 364 (6438), 399-402 (2019).</li>
<li>Huch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+genome-stable+bipotent+stem+cells+from+adult+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver.</a> Cell. 160 (1-2), 299-312 (2015).</li>
<li>Broutier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+establishment+of+self-renewing+human+and+mouse+adult+liver+and+pancreas+3D+organoids+and+their+genetic+manipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocol%22%5BJournal%5D)">Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation.</a> Nature Protocol. 11 (9), 1724-1743 (2016).</li>
</ol>

著者らは、競合を明らかにしていない。

成熟した肝細胞を長期間にわたって培養する能力は、肝臓の基礎科学、薬物毒物学、マラリアや肝炎ウイルスなどの肝刺激性宿主微生物感染症の研究の基本です。明確に定義されたニッチで、ここでのプロトコルは、肝細胞の培養システムを設定します。このプロトコルは、成熟した肝細胞を細胞と細胞の相互作用、ほとんどの肝細胞機能および遺伝子組換えを再現する異質性を持つ3D培養で拡大し、遺伝子機能研究の設計と再生治療への新しい治療手段を可能にする。 
高品質の肝細胞は、肝細胞オルガノイドの確立および遺伝子操作のために非常に重要です。コラゲナーゼ治療の消化時間は非常に重要です。しかし、この方法にはいくつかの制限があります。まず、オルガノイドが長く拡大するのを助ける試験では、よりニッチな要因が示唆されている。第二に、オルガノイドは連続して頻繁に単一細胞になることを好まない。肝細胞由来オルガノイドは、部分的な肝切除術後の成人肝臓の再生反応を再現するように見えるが、静止期の成熟した肝細胞とはまだ異なる。 
肝細胞を拡張するために肝細胞オルガノイドを使用すると、肝...

オルガノイドは、自己更新幹細胞および多系統分化細胞1,2を含む体外(3D)インビトロクラスターです。多くの器官のオルガノイドは、腸、脳、結腸、腎臓、肝臓、膵臓、甲状腺、胃、皮膚、および肺を含む明確に定義されたニッチ因子によって、多能性または成体幹細胞から確立されている3,4,5,6,7.オルガノイドは、発症(胚性または誘発多能性幹細胞、PSCに由来する)または恒常性/再生進行(成人幹細胞、ASCに由来する)のいずれかを模倣することによって、身体細胞機能を再現し、疾患研究と治療の新たな道を開く8,9。
哺乳類の最大の器官として、肝臓は主に貯蔵、代謝および解毒を担当する。肝細胞と胆管球の2種類の上皮細胞型は、肝臓小葉の基本単位を構築する。肝細胞は肝機能の70-80%を担う10。肝臓は顕著な再生能力を有するが、肝細胞特徴の急速な喪失は、調節不全細胞分極化および脱分化による伝統的な単層培養中に起こり、研究者や臨床医が皿の中に「ギャップブリッジング」肝臓モデルを構築する必要性を高める。しかし、最近まで、原発肝細胞からのエクスビボ拡張モデルは十分に確立されていなかった11,12,13,14,15。肝オルガノイドは、胚/誘導多能性幹細胞、肝細胞様細胞への線維芽細胞変換、および組織由来細胞から確立することができる。肝オルガノイドの開発は、薬物スクリーンおよび肝毒性アッセイのためのインビトロモデルの適用を後押しする16,17。
ここでは、マウス原発肝細胞から肝オルガノイドを確立するための詳細なプロトコルについて説明する。このプロトコルを用いることで、2回のコラゲナーゼを用いた肝細胞オルガノイドの インビトロ 培養系を設定しました。これらのオルガノイドは、数ヶ月間の長期拡張のために継代することができる。彼らの生理機能は肝細胞と非常に一致している。さらに、レンチウイルス感染、siRNAの導入、有機体を用いたCRISPR-Cas9工学など、遺伝子操作の実施方法についても詳しく説明しています。肝細胞オルガノイドの伝播は、オルガノイドを使用して肝臓生物学を理解し、パーソナライズされた翻訳医療アプローチを開発する可能性に光を当てた。

<table><tbody><tr><td>Perfusion Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sangon Bitech</td><td>A600077-0100</td><td>3.50 g/L</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100188-0500</td><td>9.00 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sangon Bitech</td><td>A100395-0500</td><td>4.00 g/L</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;12H2O</td><td>サンゴン ビテック</td><td>A501727-0500</td><td>1.51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>サンゴン ビテック</td><td>A501218-0001</td><td>80.0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;2H2O</td><td>サンゴン ビテック</td><td>A610404-0500</td><td>0.78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>サンゴン ビテック</td><td>A500873-0500</td><td>3.50 g/L</td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>サンゴン ビテック</td><td>A100882-0025</td><td>0.06 g/</td></tr><tr><td>L<ストロング>消化バッファー</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl<サブ>2</サブ></td><td>サンゴン ビテック</td><td>A501330-0005</td><td>0.50 M</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IV</td><td>Σ</td><td>C1639</td><td>0.10 mg/mL</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>サンゴン ビテック</td><td>C621110-0010</td><td>23.80 g/L</td></tr><tr><td>KCl</td><td>サンゴン ビテック</td><td>A100395-0500</td><td>4.00 g/L</td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot;12H2O</td><td>サンゴン ビテック</td><td>A501727-0500</td><td>1.51 g/L</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>サンゴン ビテック</td><td>A501218-0001</td><td>80.0 g/L</td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot;2H2O</td><td>Sangon Bitech</td><td>A610404-0500</td><td>0.78 g/L</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sangon Bitech</td><td>A500873-0500</td><td>3.50 g</td></tr><tr><td>/LTip-wash Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>10091148</td> 4 <td>°C;C</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C14190500BT0</td><td>4 °C で保存されます。C</td></tr><tr><td>Wash Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>4 °C;C</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp;A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Culture Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>ストック濃度 500 & マイクロ;M、最終 濃度2 &micro;M</td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Invitrogen</td><td>12634-010</td><td>4°C;C</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント 50x、マイナス ビタミン A</td><td>Gibco</td><td>1704-044</td><td>50 X</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Tocris</td><td>4423</td><td>ストック濃度 30 mM、最終 濃度 3 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330032</td><td>4 °C で保存されます。C</td></tr><tr><td>Gastrin I</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td>ストック濃度 100 mM, final concentration 10 nM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td>100 X</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td>100 X</td></tr><tr><td>Matrigel martix</td><td>BD</td><td>356231</td><td>-20 °C で保存されています。C</td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td>ストック濃度 500 mM、最終 濃度 1 mM</td></tr><tr><td>ニクチンアミド</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td>ストック濃度 1 M、最終濃度 3 mM</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>サンゴン ビテック</td><td>&nbsp;A600135-0025</td><td>100 X</td></tr><tr><td>組換えヒト EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>ストック濃度 100 & マイクロ;g/ml、最終濃度 50 ng/ml</td></tr><tr><td>組換えヒト FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>ストック濃度 100 & マイクロ;g/ml、最終濃度 100 ng/ml</td></tr><tr><td>組換えヒト HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>ストック濃度 100 & マイクロ;g / ml、最終濃度25 ng / ml</td></tr><tr><td>組換えヒトTGF-&α;</td><td>Peprotech</td><td>100-16A</td><td>ストック濃度 100 & マイクロ;g / ml、最終濃度100 ng / ml</td></tr><tr><td>組換えヒトTNF-&α;</td><td>Origene</td><td>TP750007-1000</td><td>原液濃度 100 & マイクロ;g/ml、最終濃度 100 ng/ml</td></tr><tr><td>Rho キナーゼ阻害剤 Y-27632</td><td>Abmole Bioscience</td><td>Y-27632 二塩酸塩</td><td>ストック濃度 10 mM、最終濃度 10 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>Rspondin-1錯覚培地</td><td></td><td></td><td>Hu Labで作製した安定細胞株 最終濃度 15%。</td></tr><tr><td>その他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro;m</td><td>フィルターMillipore</td><td>SCGPT01RE</td><td></td></tr><tr><td>16 #シリコーンチューブ</td><td>LangerPump</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24井戸、サスペンション</td><td>Greiner bio-one</td><td>GN662102-100EA</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;Cウォーターバス</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70&micro;m</td>フィルターBD352350<td></td><td></td><td></td></tr>ア<tr><td>キュターゼ</td><td>幹細胞</td><td>AT-104</td>は<td>4°Cで保存されています。C</td></tr><tr><td>Anti-CTNNB1</td><td>BD</td><td>610154</td><td>Mouse</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>CST</td><td>5174S</td><td>Rabbit</td></tr><tr><td>Anti-HDAC7</td><td>Abcam</td><td>ab50212</td><td>Mouse</td></tr><tr><td>Anti-KI67</td><td>Abcam</td><td>ab15580</td><td>Rabbit</td></tr><tr><td>Biological Safety Cabinet</td><td>ESCO</td><td>CCL-170B-8</td><td></td></tr><tr><td>Cell Recovery Solution</td><td>Corning</td><td>354253</td><td>stored4°Cで。C</td></tr><tr><td>遠心分離機 5430</td><td>エッペンドルフ</td><td>542700097</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>ESCO</td><td>AC2-4S1</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sangon Bitech</td><td>&nbsp;A100231</td><td>RT</td></tr><tr><td>EVOS FL Color Imaging Systems</td><td>Invitrogen</td><td>AME4300</td><td></td></tr><tr><td>Hdac3 siRNA</td><td>Guangzhou RiboBio Co., Ltd.</td> で保存されています。<td></td><td>siG2003180909192555-20°Cで保存されます。C</td></tr><tr><td>Hdac7レンチウイルス</td><td>ShanghaiGenePharmaCo.、Ltd</td><td>LV2020-2364</td>は<td>-80°Cで保存されています。C</td></tr><tr><td>Hitrans G A</td><td>上海Genechem Co.,Ltd.</td><td>REVG004</td><td>ウイルス感染効率の向上</td></tr><tr><td>Image Pro Plus software</td><td>Media Cybernetics, Bethesda, MD, USA</td><td>version 6.0</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamin RNAiMAX Transfection Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>13778150</td><td>ウイルス感染効率の向上</td></tr><tr><td>生細胞色素</td><td>Luna</td><td>F23001</td><td>を 4 °C で保存。C</td></tr><tr><td>低速卓上遠心分離機</td><td>cence</td><td>TD5A-WS/TD5AWS</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofactor-&alpha; 2b Device</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>4 °C で保存されています。C</td></tr><tr><td>パスツールピペット</td><td>Sangon Bitech</td><td>F621006-0001</td><td></td></tr><tr><td>蠕動ポンプ</td><td>LangerPump</td><td>BT100-2J</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 膜</td><td>ミリポア</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr>-80 °Cで保存されたメタノール<td>PX458</td><td>Addgene</td><td>48138</td> で活性化<td>します。C</td></tr><tr><td>冷蔵遠心分離機</td><td>Thermo Scientific Heraeus</td><td>Labofuge 400</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>MCE</td><td>HY-100218A</td><td>ストック濃度 10 mM、最終濃度 4 & マイクロ;M</td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>Gibico</td><td>25200072</td><td>4 °C で保存されます。C</td></tr><tr><td>Wee1 siRNA</td><td>広州リボバイオ株式会社</td><td></td><td>siG2003180909205971-20°Cで保存されます。ハ</td></tr></tbody></table>

マウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作

Establishment and Genetic Manipulation of Murine Hepatocyte Organoids

肝臓は哺乳類の中で最大の器官です。これは、グルコース貯蔵、タンパク質分泌、代謝および解毒において重要な役割を果たしています。肝機能の大部分の実行者として、原発性肝細胞は増殖能力が限られている。そのためには、肝臓生理学的および病理学的研究のための ex vivo 肝細胞拡張モデルの確立が必要です。ここでは、コラゲナーゼ灌流の2段階でマウス肝細胞を単離し、細胞と細胞の相互作用と身体機能を再現する「ミニ肝臓」として3Dオルガノイド培養を確立した。オルガノイドは、前駆細胞および成熟した肝細胞を含む不均一な細胞集団で構成される。マウス肝細胞または胎児肝細胞を2~3週間以内に分離して培養し、オルガノイドを形成するプロセスを詳細に紹介し、機械的に上下にピペットを通過させる方法を示す。また、shRNA/異所構造のレンチウイルス感染、siRNAトランスフェクション、CRISPR-Cas9エンジニアリング用にオルガノイドを単一細胞に消化する方法についても紹介します。オルガノイドは、肝臓生物学と病態生物学をモデル化することにより、薬物スクリーン、疾患モデリング、および基礎的な肝臓研究に使用することができます。

女性のアルブ・クレからの肝細胞オルガノイド;Rosa26-GFPマウス(8週間)は、播種の5日後に観察された(図1A)。このオルガノイドはKi67陽性染色で増殖している(図1B)。肝細胞オルガノイドにおける代表的な遺伝子の発現を、siRNAトランスフェクションまたはレンチウイルス感染のいずれかによる干渉発現をqRT-PCRおよびウェスタンブロットで調べた。結果は 図2A および 2Bに示されている。 図2C は、RSL-3およびCRISPR/Cas9ゲノムライブラリー画面による14日間の治療後の肝オルガノイドからの選択結果を示す。この結果は、これらのオルガノイドを体外に拡大し、遺伝的に操作できることを示唆している。
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マウス肝細胞から長期 の外ビトロ 3Dオルガノイド培養システムが確立された。これらのオルガノイドは、shRNA/異所構造、siRNAトランスフェクションおよびCRISPR-Cas9エンジニアリングのレンチウイルス感染によって継代され、遺伝的に操作することができる。

The liver is the largest organ in mammals. It plays an important role in glucose storage, protein secretion, metabolism and detoxification. As the ...

肝臓は哺乳類の中で最大の器官です。代謝と解毒において非常に重要な役割を果たしています。.肝臓は、インビトロで顕著な再生能力を持っていますが、それはまだ肝細胞のインビトロを培養するために長期的には非常に大きな課題です。ここでは、成熟した肝細胞から肝細胞オルガノイドを確立する。これは、形態と機能における肝細胞の主な特徴を保持します。本ビデオでは、これらのオルガノイドの培養と通過の仕方と、これらのオルガノイドの遺伝子改変を詳細に行う方法について紹介します。まず、肝臓灌流と消化。すべての領域と器具を準備し、それらを無菌にします。マウスを洗って表皮と皮膚を開き、肝臓のポーチオーブンを見つけようとします。それに針を注入し、これをキャプチャします。肝臓が青白くなるまで、毎分5ミリリットルの速度で灌流を行います。灌流バッファーにそれらを変更, 慎重に置きます, 肝臓を見て, それが柔らかくなるまで.通常、それは3〜5分かかります, その後、肝臓をカットし、プレートに入れて、ハサミで小片にカット.頻繁にそれを上下にペップ。通常、単一の細胞にそれらを作るために10〜15分かかります。そして、10〜15分でそれを上下にペップし、フィッターを通してそれらを供給します。それらを単一のセルにします。50ミリリットルチューブ内のすべての細胞を収集し、速度で遠心分離し、プレートごとにすべての収集します。常に冷たい氷の中でそれらを維持してみてください。単一セルの懸濁液を作り、セルカウンターでそれらを数えます。通常、肝細胞は幸せであれば、生き生きとした蛍光を有する。第二に、細胞を座ってオルガノイド培養を行います。我々は、すべての細胞の懸濁液を収集し、特定の点心融合を有する細胞を数え、その後、混合する。メトロゲルス。およびコードメディア。通常、我々は、媒体とメトロゲルで、1〜2または1〜3の比率で取る。慎重に混合した後、グラデーションプレートに座ります。我々は通常、24プレートウェルで100マイクロリットルを追加します。37度の温度でインキュベーターに入れます。20分後、下の下を逆にして、メディアに戻します。2、3日のカウンターで、私たちは通常、オルガノイドが出てくるのを見ます。これは私たちのオルガノイドの典型的なイメージです。我々は通常、我々は通路を行うか、いくつかの遺伝子組み換え方法を行う場合は、オルガノイドからの単一の細胞が必要な我々はコート洗浄緩衝液とカウンタープレートからすべてのオルガノイドを収集します。上清を落とし、コートウォッシュバッファでプレートに入れ、それらを混ぜるので、それを上下にペップします。そして、我々は通常、洗浄テープバッファですべての先端を事前に洗浄します。すべてのオルガノイドの先端を避けるために、そして、氷の上またはそれなしで新しいバッチで、我々はセントロフュージョンによってすべてのオルガノイドを収集します。私たちはそれらを扱う、すべてのメトロゲルを削除するための説得力のある放射があります。氷上でのインキュベーションの20〜30分後にすべてのメトロゲルが除去されます。私たちは、すべてのきれいなオルガノイドを収集し、単一の細胞にそれらを作るためにトリプシンを追加します。トリプシンを添加した後、オルガノイドをインキュベーターに取り入れ.肝オルガノイドが単一細胞になるには5~10分かかります。我々は、三Latinを停止するために、より多くの洗浄バッファーを追加します。そして、彼らに向かって上下にそれをペップ。オプションプロセスの場合は、もう一度洗ってすべてのトリプシンを取り除くことができます。セントロフュージョンで洗浄した後、細胞カウンターの下で数えることができます。次に、これらの肝細胞オルガノイドのトランザクションまたはトランスフェクションを行う方法を示します。まず、あなたが何をするかのチューブにラベルを付け、次にメーカーの指示に従って視力トランスフェクションを行います。あなたは必要です, INI MaXを飼いならすリポイル事実の摂政.を追加します。コントロールと特定の遺伝子siRNA、およびメーカーの指示に従って、最適でそれらをインキュベートします。そして、細胞濃度に応じて、RAN Maxを追加し、それらを徹底的に混合します。その後、我々はまた、別々に最適でRANの最大値を追加し、氷の上に置きます。5分後、我々は別のsiRNA、特異的遺伝子RANiおよびII対照を別々に別々に別々のRAN最大混合物をペップアップし、それらを徹底的に混合する。再び氷の上に置き、その後、我々はすべてのオルガノイド、遅い中心注入を収集し、すべての上清をドロップし、我々はこの細胞プレートにRNAi max、siRNA混合物を追加し、徹底的にそれをペップ。簡単に言えば、細胞とRNAi maxおよびsiRNA混合物の標識を、37度で4〜5時間の間、ジェントリフィケーションとインキュベートした。最後の部分, これらの肝細胞オルガノイドもレンチウイルスに感染する可能性があります。.同様のメッセージをsiRNAトランスフェクションとして行った。コントロールとsiRNAウイルスチューブは十分に準備され、そして最適はメーカーの指示に従って加えられた。その後、ポリグリーンのような感染領域で、我々はメーカーの指示の憲法に従って、異なるレンティウイルスを追加します。オルガノイド培養物と1.5ミリリットルのエペンドルフチューブの様々な粒子で単一細胞懸濁液を組み合わせ、よく、それらを混ぜて、この混合物をプレートし、32度で1時間濃縮します。濃縮融合は500 G.で行われ、37度で4〜5時間のインキュベーションの後、細胞懸濁液を回収し、メトロゲルに着席する。そして、再び保育器にそれらを入れてください。形成効率または他の機能解析に関する器官は、7〜10日後に行われ得る。ここに私たちの代表的な結果があります。図1Aでは、マウスからALB-クレローザ26-GFPまたはRFP肝細胞オルガノイドを見ることができました。図1Bでは、染色におけるKi67陽性シグナルが見え、肝細胞オルガノイドが増殖していることを示しています。図2Aと2Bは、私たちの遺伝子の干渉発現の代表的な遺伝子発現です。肝細胞オルガノイドの遺伝子操作後、干渉効果は非常に効率的である。図2Cは、私たちのマウスオルガノイドのコネリット技術で遺伝子操作した後に見ることができます。結論として、我々の結果は、肝細胞オルガノイドが体外で拡大され、遺伝的に操作できることを示した。要約すると,このビデオでは肝細胞を得るために肝臓灌流と消化を行う方法を示します。肝細胞を捕獲し、肝細胞オルガノイドを通過する方法.また、これらのオルガノイドの遺伝子の改変を行うsiRNAおよびベクタートランスフェクションまたはレンチウイルス感染を行う方法を示した。また、オルガノイドには2つの不足があります。まず、肝細胞を純粋にするためにコア当たりまたは毛皮コアを使用しませんでした。そして第二に、私はより多くの成長因子とシグナリングが成長するオルガノイドの時間を改善しようとするべきだと思います。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルでは、マウス肝外胆管内 3 次元におけるシステムの運用について説明します。これらの肝オルガノイド cholangiocyte 生物を勉強する文化で維持できます。胆道 organoids...

マウス肝外胆管からオルガノイドの生成

このプロトコールでは、迅速で再現性の高い内胚葉性肝オルガノイド(eHEPO)の生成について説明します。このプロトコルにより、eHEPOは2週間以内に産生され、その差別化と機能を失うことなく長期(1年以上)に拡大することができます。...

機能的肝内胚葉オルガノイドの作製

このプロトコルは、初代マウスおよびヒト組織に由来する涙腺オルガノイドを確立、維持、遺伝子改変、分化、機能的に特徴付け、および移植する方法を説明しています。...

マウスおよびヒト涙腺オルガノイドの樹立、維持、分化、遺伝子操作、移植

肝細胞がん(HCC)オルガノイド形成に関する既存のプロトコルを包括的に概観し、改良し、オルガノイド培養のすべての段階を網羅しています。このシステムは、潜在的な治療標的の特定と医薬品候補の有効性の評価のための貴重なモデルとして機能します。...

ヒト肝細胞癌患者由来オルガノイドモデルの開発と最適化による標的同定と創薬

オルガノイドは、臓器開発、創薬、疾患研究のための個別化組織モデリングに革命をもたらします。オルガノイド工学は、複雑な合成組織の作成へと進歩しています。その目的は、形態形成、アッサンブロイド技術、およびバイオマトリックスを統合して、組織工学を進歩させることです。このプロトコルは、肝臓の器官形成をモデル化し、合成組織構築のガイドラインを確立するのに役立ちます。...

ヒト細胞株を用いた肝臓器官形成のモデリング、アッサンブロイドの構築、合成組織の設計のためのin vitro培養技術

患者の腫瘍から生成されたオルガノイドをマウスの肝臓に同所的に注入します。非腫瘍性肝組織の切除は、腫瘍が位置する肝臓組織に再生環境をもたらします。...

肝臓再生が腫瘍増殖に及ぼす影響を調査するための肝細胞癌患者由来オルガノイド異種移植モデル

このプロトコールでは、ラットモデルにおける最適化された2ステップコラゲナーゼ肝灌流技術を示し、3Dオルガノイドの in vitro...

ラットの肝臓灌流と初代肝細胞の単離:最先端の3Dオルガノイド培養に不可欠な古い手順(英語)

このビデオでは、新しい文化、最大24時間までのニワトリ胚が卵の外側に培養される方法を示しています。このメソッドは1つが、マウスのE7 - 9に相当する期間を早期に開発を（14 SOMの原条。）勉強することができます。この技術のアプリケーションでは、in...

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このビデオでは、in situハイブリダイゼーション2色全体のマウント、2つの異なる遺伝子の空間的および時間的発現パターンは、若いニワトリ胚で可視化することができる方法を示しています。このメソッドは当​​初、Davidウィルキンソン、ドミンゴスエンリケ、フィルインガムとデビッドイシュ-...

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成人心筋細胞は動物の心臓から分離し、数日間培養することができる主要な細胞である。この培養期間内にアデノウイルス遺伝子導入は、遺伝的に符号化されたバイオセンサー（GEBs）または蛍光融合タンパク質を発現させることができる。両方のアプローチは、共焦点顕微鏡による細胞の調査を許可する。...

共焦点イメージングのための成人心筋細胞の単離と遺伝子操作

学ぼうマウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作技術。レンチウイルス感染、siRNA導入、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子改変法を含む詳細な培養・継代プロトコルを解説します。

マウス肝細胞オルガノイドの確立と遺伝子操作

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