Name: ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成するための簡略化された方法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 学ぶ ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成する簡略化された3D培養法。均一な大きさのオルガノイドを大量に作製し、腎臓の発生・疾患モデリングや創薬研究に応用できます。

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この研究は、米国国立衛生研究所R01 DK069403、UC2 DK126122およびP30-DK079307、およびASN Foundation for Kidney Research Ben J. Lipps Research Fellowship ProgramからAPへの資金提供を受けました。

hPSCを用いたすべての実験は、施設のガイドラインに準拠して実施され、適切な個人用保護具を備えたクラスIIバイオセーフティフード内で実施された。すべての試薬は、特に断りのない限り、細胞培養グレードである。全ての培養物を37°C、5%CO2 空気雰囲気下でインキュベートする。アッセイのすべての段階で、胚様体または腎臓オルガノイドを収集、固定、または分析のために調製することができる。このデータの生成に使用されたhPSCラインは、完全に特徴付けられ、公開されています18。
1. 培養プレートの準備
注:hPSCを分割する約1時間前に、幹細胞修飾基底膜マトリックス抽出物(BME)で2 x 100 mm組織培養プレートをコーティングする。プレートを事前にコーティングし、パラフィンフィルムで密封し、メーカーの指示に従って4°Cで保存することができます。
<ol><li>2 x 100 mm組織培養処理プレート(腎臓オルガノイドアッセイ用に1枚、細胞株を維持するために1枚)とクラスIIバイオセーフティフード内の15mL円錐形チューブを調製する。</li>
	<li>15 mLの円錐形チューブに8 mLの冷たい無血清ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)をアリコートし、各プレートの底部を培地で覆うのに十分な量の100 mmプレートに約4 mLを入れます。</li>
	<li>100 μL の BME アリコートを冷凍庫 (-20 °C) から取り出します。2 mL 血清学的ピペットを使用して、15 mL の円錐形チューブから約 1 mL の冷たい DMEM を採取します。気泡ができないように、冷たいDMEMで優しく上下にピペッティングして、BMEアリコートをゆっくりと解凍します。 メモ: BMEアリコートを室温で放置しないでください。すぐに使用してください。</li>
	<li>解凍したDMEM/BMEを、残りのDMEMとともに15mL円錐管に戻します。10 mLの血清学的ピペットで、希釈したBMEを少なくとも8回上下にピペッティングしてBMEを均一に分散させ、気泡を作らないように穏やかに混合します。</li>
	<li>希釈したBMEの4mLをDMEMで各プレートに移し、BMEが均等に分布するようにプレートを静かに旋回させる。コーティングされたプレートを室温で1時間、または37°Cで30分間インキュベートする。 注: 100 mm プレートあたり 50 μL の BME を使用します。他のhPSC培養培地および細胞株の使用は、異なる濃度のBMEを必要とし得る。</li>
</ol>2. hPSCの継代
注:日常的なhPSC培養の場合、70〜80%のコンフルエントで細胞株を継代する。
<ol><li>継代するhPSCプレートから培養液を吸引する。~8 mLのダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)をhPSCプレートに加え、穏やかに旋回させて細胞を洗浄する。</li>
	<li>DBPSを吸引し、2mLの穏やかな細胞解離試薬(GCDR)を100mmプレートに加え、細胞を覆うように上に一滴ずつ落とす。 注:他の解離試薬も使用することができる。それに応じて調整します。</li>
	<li>コロニーが分裂し、細胞が位相コントラスト下で屈折するまで、室温で約6〜8分間インキュベートする(図2A)。 注:タイミングは細胞株によって異なる場合があります。それに応じて調整します。</li>
	<li>インキュベートしながら、50mLの円錐管を調製する。16 mL の hPSC 培地 (100 mm プレートあたり 8 mL) を加え、Rho 関連キナーゼ阻害剤 (ROCKi) を終濃度 5 μM まで加えます。</li>
	<li>BMEコーティングプレートからDMEMを吸引し、各プレートに8mLのhPSC培地とROCKiを加える。</li>
	<li>細胞の準備ができたら(図2.3、 図2Aで説明したように)、GCDRを吸引し、プレートを実験者に向かって約45°傾け、セルリフターで細胞をこすります。 注: 細胞がデタッチしている場合は、GCDR の吸引を省略して続行します。</li>
	<li>プレートを約90°回転させ、もう一度こすり取って残りのセルを持ち上げます。プレートを45°に保ち、10 mL血清学的ピペットを使用して3 mLのhPSC培地で細胞を洗い流します。</li>
	<li>ゆっくりとピペットを上下させて大きな凝集塊を分解し(2〜3回以下)、目的の細胞株に適した比率で細胞を調製したプレート上に播種する。細胞を入れたプレートをインキュベーターに入れ、プレートを図8の動きで静かに動かして細胞を均等に分配します。 注:この実験ではhPSC株を1:5の比率で分割したが、これは他の細胞株および条件によって異なり得る。プレートを一晩中邪魔しないでおきます。</li>
	<li>〜24時間後、細胞に付着がないか調べる。小さな個々のコロニーが付着しているのを探します。使用済みの培地を吸引し、8 mLの新鮮なhPSC培地(ROCKi添加なし)を補充する。</li>
	<li>細胞が〜60%のコンフルエントに達するまで毎日観察および摂食を続け、腎臓オルガノイドアッセイを開始する(通常、継代後48〜72時間に達する)。コロニーは理想的には離散的であり、合流しない(図2B)。 注:細胞の多能性状態を維持するためには、細胞を80%以下のコンフルエンシーに制限することが非常に重要です。コンフルエント培養物、粗い取り扱い、またはより高い継代は、望ましくない自発的分化または腎臓オルガノイド形成の低効率をもたらし得る。</li>
</ol>3. 0日目 - 腎臓オルガノイドアッセイのセットアップ
<ol><li>開始する前に、製剤に従ってE5−ILPおよびステージII培地の両方を調製する(表1 および 表2)。 メモ:メディアは、4°Cで最大14日間保存できます。</li>
	<li>1 つの腎臓オルガノイドアッセイ (1 つの 6 ウェルプレートに 1 つの 100 mm 培養プレートが必要) の場合、50 mL 円錐管に完全な E5-ILP 培地を調製します: 8 μM CHIR99021 (14.4 μL)、3.3 μM ROCKi (6 μL)、0.1 mM β-メルカプトエタノール (32.7 μL) を添加した E5-ILP 18 mL。</li>
	<li>2mLの完全E5-ILP培地を6ウェル超低付着プレートの各ウェルに入れる。</li>
	<li>hPSCを~60%コンフルエント(図2B)で~8mLのDPBSで2回洗浄します。DPBSを吸引し、次いで、100mmプレートあたり2mLのディスパーゼを加え、細胞を覆うように滴下し、37°Cで6分間インキュベートする。 注:6分後、コロニーのエッジはカールし始め(図2C、赤い矢印)、残りのコロニーは付着したままになります。これが6分後に得られない場合は、細胞をさらに30秒間インキュベーターに戻します。他のhPSCメディアおよびマトリックスは、このタイミングと互換性がない場合がある。ラミニンベースのBMEコーティングは、ディスパーゼと互換性がありません。ラミニンベースのBMEが標準的なhPSCマトリックスである場合、セクション1のプレートの1つを、腎臓オルガノイドアッセイに使用するこの方法に記載したBMEでコーティングする。</li>
	<li>細胞3xを約10mLのDPBSで洗浄する。DPBSを吸引し、プレートを〜45°傾け、セルリフターでこすり落とします。 注:Dispaseは無効化されていないため、完全に洗い流す必要があります。洗浄回数を減らさないでください。</li>
	<li>10 mLの血清学的ピペットを使用して、6 mLの完全E5-ILP培地でコロニーを上から洗い流します。ピペットを静かに上下させて、大きなコロニーを分解します(通常は2〜3回で十分です)。</li>
	<li>コロニークラスターを均等に分配するには、1 ウェルあたり 1 mL を 6 ウェルプレートに加えます。37°Cのインキュベーター内に置かれたオービタルシェーカー(設定:オービタル=30、往復=330°、振動=5°-2秒)にプレートを置きます(図2D)。 注:振動機能は、オルガノイドを適切に分布させ、凝集を防ぐために重要です。</li>
</ol>4. 2日目 - 半培地変化による給餌
注:48時間以内に、コロニークラスターは胚様体を形成する。
<ol><li>完全な培地を準備する:1つの6ウェルプレートの場合、15mLの円錐管に12mLのE5-ILP培地+ 8μM CHIR99021を調製する。 注:β-メルカプトエタノールおよびROCKiは必要ありません。</li>
	<li>胚様体をプレートの底部に沈降させ、プレートを〜45°傾けてから、培地を上部からゆっくりと吸引し、ウェルあたり約1mL放置する。 注:この段階での胚様体は急速に凝集する。5分>に落ち着くためにそれらを残さないでください。</li>
	<li>調製した完全培地(セクション4.1)をウェルあたり2mL加える。プレートをシェーカーに戻します。</li>
</ol>5. 3日目 - ステージII培地への胚様体の移植
<ol><li>50mL円錐管を調製し、DMEM(低グルコース)とする。胚様体をプレートの底に落ち着かせます。プレートを〜45°傾け、上から培地をゆっくりと吸引し、ウェルあたり約1mL放置する。</li>
	<li>10 mLの血清学的ピペットを使用して各ウェルからすべての胚様体を慎重に収集し、50 mLの円錐形チューブに移します。</li>
	<li>各ウェルを洗浄して、残りの胚様体を〜1mLのDMEM(低グルコース)で収集し、それらを同じ50mL円錐管に加える。</li>
	<li>胚様体をチューブの底に落ち着かせて、〜5分間放置する。待機中、6ウェルプレートの各ウェルにステージII培地を2mL加える。200 μmの細胞ストレーナーを使用して、大きな胚様体(>300 μm)を採取します(図2E)。<ol>
<li>新しい50 mL円錐形チューブを使用し、200 μmのセルストレーナーを上に置きます。全ての胚様体のピペットは、10mL血清学的ピペットを用いて、細胞ストレーナーを注意深く覆った。</li>
		<li>追加の約5mLのDMEM(低グルコース)で細胞ストレーナーをすすぎ、細胞ストレーナーに詰まった胚様体を回収する。胚様体が円錐管の底に落ち着くのを許す。</li>
	</ol>
</li>
	<li>胚様体が落ち着いたら、上清を吸引し、〜10mLのDMEM(低グルコース)で洗浄する。</li>
	<li>DMEMを吸引し、胚様体を6mLのステージII培地に再懸濁する。</li>
	<li>胚様体を6ウェル超低付着プレートに戻し、6ウェル間に均等に分配する。</li>
	<li>ステップ 4.2 および 4.3 で説明されているように、1 日おきに半分の中間変更を実行します。 注:3日目以降、胚様体は「金色」で滑らかで球状の外観になります(図2F)。〜6日目から、個々の胚様体における尿細管形成が明らかになり、翌日に亘って数が増加し、14日目までに最適な数および成長に達する(図2G、H)。時折の凝集形成を排除するために、腎臓オルガノイド、または細管のない非常に小さな胚様体を目視で観察した上で、ステップ5.4.1および5.4.2で説明されているように、<200および大型>500μmのオルガノイドを500および200μmのセルストレーナーでふるいにかける。</li>
</ol>6.スピナーフラスコに移して給餌する
注:スピナーフラスコは、多数のオルガノイドを必要とする実験のために、3日目以降いつでも使用することができる。オルガノイドの定期的な移動は、6〜8日目に私たちの研究室で行われます。機器が利用できない場合の代替案については、 ディスカッション セクションを参照してください。
<ol><li>胚様体を45mLのステージII培地を含む125mLスピナーフラスコに移す。マグネチックスターラーの回転数を120rpmに設定し、インキュベーターに入れます(図2I)。</li>
	<li>胚様体または腎臓オルガノイドを養うには、腎臓オルガノイドをスピナーフラスコの底に短時間沈降させます。フラスコの片側アームから蓋を持ち上げ、先端が反対側の内壁に触れた状態で吸引ピペットを内側に置きます。</li>
	<li>吸引ピペットをゆっくりと角度をつけ、培地の約半分を吸引します。20 mL の新鮮なステージ II 培地を同じ開口部からピペッティングして補充します。</li>
</ol>7. 6穴マグネチックスタープレート(6MSP)の設置
メモ: 6MSP 形式は、複数の条件をテストする必要がある場合は、スピナーフラスコの代わりに使用できます。化合物またはネフロトキシン治療のために6MSPを使用してください。これにより、拡散による栄養素の利用可能性を維持しながら、第2段階で使用される培地の量が節約されます。
<ol><li>50 mL 円錐管内の楕円形のマグネチックスターバーを組織培養に適した洗剤で短時間洗浄するか (使用しない場合)、または以前に使用した場合は 1 時間>浸します。</li>
	<li>滅菌DPBSで3倍速で簡単に洗う。</li>
	<li>70%エタノールで1xを5分間、滅菌DPBSで1xを洗浄する。</li>
	<li>付着防止液ですすぎ、滅菌DPBSで1xを洗って吸引します。</li>
	<li>慎重に、長い滅菌鉗子を使用して、胚様体または腎臓オルガノイドを有する6ウェルプレートの各ウェルに1つの磁気攪拌子を置く。</li>
	<li>プレートを6MSPの上に置き、速度を120rpmに設定します(図2J)。腎臓オルガノイドをセクション4.2および4.3に従って半分の培地変化で維持する。 メモ: 磁気スターバーを所定の位置にカチッと収めて回転を開始するには、まず出力レベルを 100 に簡単に設定してから、すべて回転したら、出力レベルを 25 に下げる必要があります。</li>
</ol>

<ol><li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communications. 6, 8715(2015).</li>
<li>Morizane, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nephron+organoids+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+model+kidney+development+and+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury.</a> Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).</li>
<li>Taguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redefining+the+in+vivo+origin+of+metanephric+nephron+progenitors+enables+generation+of+complex+kidney+structures+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Redefining the in vivo origin of metanephric nephron progenitors enables generation of complex kidney structures from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 14 (1), 53-67 (2013).</li>
<li>Przepiorski, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+bioreactor-based+method+to+generate+kidney+organoids+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">A simple bioreactor-based method to generate kidney organoids from pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 11 (2), 470-484 (2018).</li>
<li>Freedman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+kidney+disease+with+CRISPR-mutant+kidney+organoids+derived+from+human+pluripotent+epiblast+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids.</a> Nature Communication. 6, 8715(2015).</li>
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<li>Takasato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+organoids+from+human+iPS+cells+contain+multiple+lineages+and+model+human+nephrogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis.</a> Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).</li>
<li>Taguchi, A., Nishinakamura, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+kidney+organogenesis+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Higher-order kidney organogenesis from pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 21 (6), 730-746 (2017).</li>
<li>Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+pluripotent+stem+cell-derived+kidney+organoids+with+improved+collecting+duct+maturation+and+injury+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling.</a> Cell Reports. 33 (11), 108514(2020).</li>
<li>Howden, S. E., Little, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells+using+defined+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating kidney organoids from human pluripotent stem cells using defined conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 2155, 183-192 (2020).</li>
<li>Tanigawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activin+is+superior+to+BMP7+for+efficient+maintenance+of+human+iPSC-derived+nephron+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Activin is superior to BMP7 for efficient maintenance of human iPSC-derived nephron progenitors.</a> Stem Cell Reports. 13 (2), 322-337 (2019).</li>
<li>Sander, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+large-scale+production+of+kidney+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for large-scale production of kidney organoids from human pluripotent stem cells.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100150(2020).</li>
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<li>Wu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+and+refinement+of+human+PSC-derived+kidney+organoid+differentiation+with+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis and refinement of human PSC-derived kidney organoid differentiation with single-cell transcriptomics.</a> Cell Stem Cell. 23 (6), 869-881 (2018).</li>
<li>Lei, X., Deng, Z., Duan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uniform+embryoid+body+production+and+enhanced+mesendoderm+differentiation+with+murine+embryonic+stem+cells+in+a+rotary+suspension+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Uniform embryoid body production and enhanced mesendoderm differentiation with murine embryonic stem cells in a rotary suspension bioreactor.</a> Methods in Molecular Biology. , Clifton, N.J. (2016).</li>
</ol>

著者に開示するものは何もありません。

以前の研究では、初期プロトコールステップが中間中胚葉分化5、19、20にとって重要であることが示されており、したがって、この段階で厳格な培地組成物を実施することが不可欠である。プロトコールの第1段階から血清、アルブミン、タンパク質非含有ハイブリドーマ培地IIなどの未定義成分を除去することは、アッセイ21間の一貫した分化効率を改善するのに役立ち得る。
腎臓細胞の代謝状態は、その機能にとって重要であり、グルコースの変化は代謝状態の変化をもたらし得る22。以前の研究では、高レベルのグルコース(最大25mM)が内皮細胞の機能不全を誘発し、腎臓細胞の成長および酸化能力を変化させることができることが記載されている22,23,24<sup clas...

近年、ヒト多能性幹細胞を腎臓オルガノイドに分化させるための多くのプロトコールが開発されている1、2、3、4、5。腎臓オルガノイドは、新しい再生医療アプローチの研究、腎臓関連疾患のモデル化、毒性試験の実施、治療薬開発を支援するための重要なツールを提供してきました。その幅広い適用性にもかかわらず、腎臓オルガノイドは、成熟の欠如、インビトロでの限られた長期培養能力、およびヒト腎臓に見られるいくつかの細胞型の不足などの限界を有する6,7,8。最近の研究は、オルガノイド成熟のレベルを改善し、培養期間を延長し、既存のプロトコル9、10、11、12を修正することによって腎臓細胞集団の複雑さを拡大することに焦点を当てている。我々の確立されたプロトコル5,13のこの現在の反復において、我々は、プロトコルの第1段階における培地成分を、インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン(ITSE)、脂質、ポリビニルアルコール(E5-ILP)およびCHIR99021を添加した無血清ベース培地に改変した(図1)。これらの変更により、完全に定義された無血清の低タンパク質培地が提供され、以前の培地組成物5,13よりも成分が少なく、追加の成長因子が存在しません。その結果、第1段階培地は、以前に公開されたバージョンよりも調製に労力がかからず、バッチ間の変動性を低減する可能性があります5。これまでの研究では、インスリンとトランスフェリンの両方が無血清培養において重要であることが示されている14,15が、高レベルのインスリンは中胚葉分化を阻害し得る16。我々は、元のプロトコールで提供されたように低いインスリンレベルを維持し、アッセイの第2段階でKOSR(インスリンを含む)のレベルをさらに低下させた。腎臓オルガノイド形成のための他のプロトコールに沿って、より低いレベルのKOSRは、腎臓組織の増殖と分化との間のバランスを維持するのに有益である17。また、ステージII培地13におけるグルコース濃度を低下させた。
我々の方法は、腎臓オルガノイドの懸濁アッセイのためのセットアップを記載し、元の刊行物5、13に記載されているように、初期〜60%コンフルエントhPSC 100mm培養プレートから最大〜1,000個のオルガノイドを生じる。このプロトコルは、複数の100 mmまたは150 mmプレートから始めて簡単にスケールアップして、オルガノイド数をさらに増やすことができます。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21-985-023</td><td></td></tr><tr><td>付着防止リンス液</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7010</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72054</td><td>10 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Corning&nbsp;使い捨てスピナーフラスコ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-201-152</td><td></td></tr><tr><td>コーニング超低アタッチメント 6ウェルプレート</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>コーニング低速スターラー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-495-03</td><td>スピナーフラスコ培養用マルチプレートマグネチックスターラー</td></tr><tr><td>ディスパーズ</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7923</td><td>アリコートとフリーズ</td></tr><tr><td>DMEM、低グルコース、ピルビン酸、グルタミン不使用、フェノールレッド不</td>使用 <td>サーモフィッシャー</td><td>11054020</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x、カルシウム不使用、マグネシウム不使用</td><td>サーモフィッシャー</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>卵/楕円形攪拌バー</td><td>2mag</td><td>PI20106</td><td></td></tr><tr><td>エクセルタ汎用ピンセット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>17-456-103</td><td>細胞培養フード内で無菌状態を保つ</td></tr><tr><td>EZBio シングルユース培地ボトル、250mL</td><td>Foxx Life Sciences</td><td>138-3211-FLS</td><td>PVA 10%</td></tr><tr><td>Falcon Standard Tissue Culture Dishes (100 mm)</td><td>Thermo Fisher</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp;滅菌吸引ピペット 2mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>14-955-135</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;セルリフター - セルリフター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド&nbsp;多機能3Dローテーター</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>88-861-047</td><td>オービタルシェー</td></tr><tr><td>カーGeltrexLDEVフリー還元成長因子基底膜マトリックス</td><td>サーモフィッシャー</td><td></td> <td>A1413302BME。氷の上でアリコートして凍らせます。別の適切なマトリックスの代替品は、マトリゲルまたはカルトレックスです。</td></tr><tr><td>穏やかな細胞解離試薬</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td>GCDR</strong</td></tr><tr><td>>GlutaMAX Supplement</td><td>サーモフィッシャー</td><td>35-050-061</td><td>L-グルタミンサプリメント。</td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15-630-080</td><td></td></tr><tr><td>インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>51-500-056</td><td><ストロング>イッツェ</ストロング</td></tr><tr><td>>ノックアウト&nbsp;血清の補充 - 多種</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A3181502</td><td>KOSR.分注および凍結</td></tr><tr><td>脂質混合物 1, Chemically Defined</td><td>Millipore-Sigma</td><td>L0288-100ML</td><td></td></tr><tr><td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution</td><td>Thermo Fisher</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 500mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>MilliporeSigma&nbsp;Stericup Quick Release-GP Sterile Vacuum Filtration System 250mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S2GPU02RE</td><td></td></tr><tr><td>MIXcontrol MTP / Variomag TELEcontrol MTP Control Unit</td><td>2mag</td><td>VMF 90250 U</td><td></td></tr><tr><td>MIXdrive 6 MTP / Variomag TELEdrive 6 MTP Microplate Stirring Drive</td><td>2mag</td><td>VMF 40600</td><td>6MSP</strong</td></tr><tr><td>>MP Biomedicals&nbsp; 7X 洗浄液</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td>MP0976670A4Tissue cultureに適した洗剤 水に5%溶液を作る</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>hPSC medium.TeSR-E8、NutriStem XF、mTeSR Plus 培地もテストされており、適切な代替品です。&nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc 50 mL 円錐形、滅菌遠心分離管</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-565-270</td><td></td></tr><tr><td>Nunc 15mL 円錐形滅菌遠心分離管</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>12-565-268</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>プラズモシン</td><td>Invivogen</td><td>ant-mpt</td><td>Anti-mycoplasma reagent. Aliquot およびフリーズ</td></tr><tr><td>pluriStrainer&reg; 200 &micro;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0776417</td><td>セルストレーナー</td></tr><tr><td>pluriStrainer&reg; 500 &micro;m</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC0822591</td><td>セルストレーナー</td></tr><tr><td>ポリ(ビニルアルコール)87-90%加水分解&nbsp;(PVA)</td><td>ミリポアシグマ</td><td>P8136-250G</td><td>10%をDPBSで98°Cで攪拌し、溶解するまで、138-3211-FLS</td></tr><tr><td>で作る ROCK阻害剤Y-27632 (ROCKi)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72304</td><td>10 mM DPBS</td></tr><tr><td>滅菌使い捨て血清ピペット&nbsp; - 10mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ディスポーザブル血清ピペット - 25mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ディスポーザブル血清ピペット - 5 mL</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-678-12D</td><td></td></tr><tr><td>TeSR-E5</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5916</td><td>セラムフリー、低タンパク質ベース培地 E5-ILP</td></tr><tr><td>Variomag distriBOX 2 ディストリビューター</td><td>2mag</td><td>VMF 90512</td> 複数の<td>MIXdriveを使用する場合</td></tr></tbody></table>

ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成するための簡略化された方法

A Simplified Method for Generating Kidney Organoids from Human Pluripotent Stem Cells

hPSCから生成された腎臓オルガノイドは、腎組織の無限の供給源を提供してきた。ヒト腎臓オルガノイドは、腎臓病や傷害の研究、細胞ベースの治療法の開発、新しい治療法の試験のための非常に貴重なツールです。このような用途には、多数の均一なオルガノイドと再現性の高いアッセイが必要です。私たちは、オルガノイドの全体的な健康状態を改善するために、以前に発表された腎臓オルガノイドプロトコルに基づいて構築しました。この単純で堅牢な3Dプロトコルは、脂質、インスリン-トランスフェリン-セレン-エタノールアミンサプリメント、ポリビニルアルコールを含む最小成分培地でGSK3阻害剤(CHIR99021)で3日間均一な胚様体を形成し、その後ノックアウト血清置換(KOSR)含有培地で培養することを含む。さらに、攪拌アッセイは、胚様体の凝集を減少させ、均一なサイズを維持することを可能にし、これはオルガノイド間の変動性を低減するために重要である。全体として、このプロトコルは、大量の腎臓オルガノイドを生成するための迅速、効率的、かつ費用対効果の高い方法を提供する。

私たちのプロトコルのこの最新バージョンでは、腎臓オルガノイドの分化は、定義された低タンパク質培地で開始されます。アッセイは完全に懸濁状態で行われ、尿細管形成の開始のためのhPSCs分化および組織化の先天的能力に依存する。100mm〜60%コンフルエントなhPSC培養プレートに由来する単一のアッセイは、我々の以前の刊行物5に示されているように、日常的に500〜1,000個の腎臓オルガノイドを生じる。このような多数のオルガノイドが生成されるため、このプロトコルは化合物試験に適しています。私たちは日常的に化合物試験に6ウェルフォーマットを使用していますが、このプロトコルは第2段階(3日目以降)で他のマルチウェルフォーマットに簡単に拡張でき、よりスループットの高い化合物テストが可能です。パラフィン切片の免疫蛍光は、オルガノイド、すなわち肝細胞核因子-1β(HNF1B)およびロータス・テトラゴノロブス・レクチン(LTL)を発現する腎尿細管(図3A-HNF1B、LTL)、およびV-maf筋腱膜神経症線維肉腫癌遺伝子ホモログB(MAFB)およびネフリン(NPHS1)を発現するポドサイトクラスター(図3A...

ここでは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)から腎臓オルガノイドを生成するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、2週間以内に腎臓オルガノイドを生成する。得られた腎臓オルガノイドは、大規模なスピナーフラスコまたはマルチウェル磁気攪拌プレートで培養して、薬物試験アプローチを並行させることができます。

Kidney organoids generated from hPSCs have provided an unlimited source of renal tissue. Human kidney organoids are an invaluable tool for studying kidney ...

この方法は、細胞培養実験用に備え付けられた任意の実験室で行うことができる。この方法を用いることで、腎の発達や疾患経路の理解を深めることができます。これは、腎臓オルガノイドを生成するための他のものと比較して比較的簡単で安価な方法である。この技術の最大の課題は、高品質のヒト多能性幹細胞培養を維持することです。細胞が80%未満のコンフルエンシーに維持され、定期的に分裂することが重要です。ヒト多能性幹細胞培養を初めて使用する研究者は、分化に進む前に幹細胞株に慣れておく必要があります。腎臓オルガノイドアッセイを開始するには、2ミリリットルの完全E5-ILP培地を6ウェル超低付着プレートの各ウェルに加えます。ヒト多能性幹細胞(hPSC)を100ミリメートルの組織培養処理プレートで、60%コンフルエントに達するまで培養する。hPSCを約8ミリリットルのDPBで2回洗浄する。DPBSを吸引し、次に細胞を覆うために2ミリリットルのディスパーゼを滴下し、摂氏37度で6分間インキュベートする。約10ミリリットルのDPBSで細胞を3回洗浄する。DPBSを吸引し、プレートを45度傾け、セルリフターでセルをこすり落とします。10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して、6ミリリットルの完全E5-ILP培地でコロニーを上から洗い流します。その後、ピペットを垂直に保持し、上下に緩やかにピペッティングすることにより大きなコロニーを分裂させ、培養プレートの側面に触れないように注意する。6ウェルプレートにウェルあたり1ミリリットルを加えてコロニークラスターを均等に分配し、プレートを摂氏37度のインキュベーター内のオービタルシェーカーに置きます。あるいは、オービタルシェーカーが利用できない場合、細胞を静的に培養することができる。2日目に、胚様体をプレートの底に落ち着かせた後、プレートを45度傾け、上からゆっくりと培地を吸引し、ウェルあたり1ミリリットルを残します。ウェルあたり2ミリリットルの調製された完全培地を加え、プレートをシェーカーに戻す。3日目に、前述のように培地を吸引した後、10ミリリットルの血清学的ピペットを使用して各ウェルからすべての胚様体を慎重に収集し、50ミリリットルの円錐管に移す。残りの胚様体を採取するには、1ミリリットルの低グルコースDMEMで各ウェルをすすぎ、それらを同じ50ミリリットルの円錐形チューブに加える。胚様体がチューブの底部に沈降するのを待っている間に、6ウェルプレートの各ウェルに2ミリリットルのステージII培地を加える。次に、新しい50ミリリットルの円錐形のチューブの上に200マイクロメートルのセルストレーナーを置き、すべての胚様体をセルストレーナーの上に慎重にピペッティングすることによって、大きな胚様体をふるいにかけます。さらに5ミリリットルのDMEMでセルストレーナーをすすぎ、ストレーナーに詰まった胚様体を採取します。後の段階では、まず500マイクロメートルのストレーナーを使用して非常に大きな胚様体をふるいにかけ、次に濾液を200マイクロメートルのストレーナーに通して、細管のない非常に小さな胚様体をふるいにかけます。200マイクロメートルのストレーナーを新しい50ミリリットルのチューブに反転させ、DPBSでストレーナーを洗浄することによって、200〜500マイクロメートルの正しいサイズの胚様体を収集します。こすり傷の後、胚様体を円錐管の底に沈降させ、上清を吸引し、約10ミリリットルのDMEMで洗浄する。次いで、胚様体を6ミリリットルのステージII培地に再懸濁する。胚様体を6ウェル超低付着プレートに戻し、ウェル間で均等に分配する。オルガノイドのほとんどはピペットの上部に集まるので、最後に約0.5ミリリットルを残してから、各ウェル内の培地に先端を優しく触れ、オルガノイドがウェルに流れ込むようにします。胚様体を、45ミリリットルのステージII培地を含む125ミリリットルのスピナーフラスコに移す。マグネチックスターリング速度を120rpmに設定し、フラスコをインキュベーターに入れた。胚様体または腎臓オルガノイドに餌を与えるには、スピナーフラスコの底に短時間落ち着かせてから、フラスコの片側アームから蓋を持ち上げ、先端が反対側の内壁に触れた状態で吸引ピペットを内部に置きます。ピペットをゆっくりと傾け、培地の約半分を吸引します。20ミリリットルの新鮮なステージII培地を同じ開口部からピペッティングして補充します。長い滅菌鉗子を使用して、胚様体または腎臓オルガノイドを含む6ウェルプレートの各ウェルに1つの磁気攪拌子を慎重に配置します。プレートを6輪マグネチックスタープレートの上に置き、速度を120rpmに設定した。マグネチックスターバーを所定の位置にカチッと収めて回転を開始するには、まず出力レベルを100に設定します。すべてのバーが回転し始めたら、パワーレベルを25に下げます。以前に実証したように培地の半分を変えることによって腎臓オルガノイドを維持する。14日目の腎臓オルガノイドのパラフィン切片の免疫蛍光は、肝細胞核因子-1βおよびLotus tetragonolobus lectinを発現する腎尿細管などのネフロンセグメント、ならびにV-maf筋腱膜神経症性線維肉腫癌遺伝子ホモログBおよびネフリンを発現する有蹄細胞クラスターの存在を示す。このプロトコールにおける改変は、培養26日目に血小板および内皮細胞接着分子-1による染色によって確認されるように、内皮細胞の拡大を支持することができる。ヒト多能性幹細胞は、適切な時間ディスパーゼで処理し、その後、すべての痕跡を除去するために十分に洗浄する必要がある。ディスパーゼが完全に除去されない場合、細胞死および胚様体のクラスタリングにつながる可能性がある。この方法は、先天性腎臓病の発症、ならびに様々な腎臓傷害経路およびインビトロでの治療介入の可能性を調べるのに役立った。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、人工多能性幹細胞から、定義された化学的条件下での細胞分化を通じてヒト腎臓足細胞を誘導するプロトコルについて説明します。生成された有足細胞は、腎毒性試験や疾患モデリングに使用できます。...

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このプロトコルは、脳細胞の多様性と細胞組織の多くの特徴を維持しながら、外因性成長因子または基下膜マトリックスを用いることなく、単純化された低コストの方法で脳オルガノイドを生成する手段として生成された。...

ヒト胚性幹細胞から脳オルガノイドを生成するための静的自己指向法

この研究は、臓器の発達を研究するための2つの方法、培養胚器官およびオルガノイドの血管化を可能にする鳥類胚からの絨毛球膜(CAM)の改善された異種移植セットアップと、新しい固定z方向を説明する。高解像時間経過共焦点イメージングを可能にする改変実験条件を有する臓器培養法。...

血管化、拡張開発、および顕微鏡イメージングの改善のための腎オルガノイドおよびオルガノイド培養の最適化

ここで提示されるのは、高効率(&gt;90%)を有する誘導多能性幹細胞からのヒト腎臓ポドサイトの誘導のための化学的に定義されたプロトコルであり、遺伝子操作または亜集団選択とは無関係である。このプロトコルは、26日以内に望ましい細胞タイプを生成し、腎毒性試験および疾患モデリングに有用であり得る。...

化学的に定義された条件下でのヒト人工多能性幹細胞からの成熟した腎臓ポドサイトの誘導分化

ヒト腎臓結管状尿細管培養は、腎臓生理学と疾患を研究するための貴重な インビトロ...

組織と尿からのヒト腎臓結管状突起の生成

ここでは、自己組織化によってヒト多能性幹細胞を用いて、発達的に関連するヒト心臓オルガノイド(hH)を効率的に作成するためのプロトコルについて述べた。このプロトコルは、発達的手がかりの逐次活性化に依存し、非常に複雑で機能的に関連するヒト心臓組織を生成する。...

多能性幹細胞由来の自己組織化ヒト心臓オルガノイドの生成

ここでは、ヒト人工多能性幹細胞から分化した遺伝的に一致する上皮細胞と血管内皮細胞を統合することにより、腎臓糸球体濾過バリアの構造と機能を要約するパーソナライズされた臓器チップシステムを設計するためのプロトコルを紹介します。このバイオエンジニアリングシステムは、腎臓精密医療および関連アプリケーションを進歩させることができます。...

ヒト人工多能性幹細胞から改変された同質遺伝子腎臓糸球体チップ

ここでは、ニワトリ胚のセロミック腔への腎臓オルガノイドの移植のための詳細なプロトコルを提示します。この方法は、8日以内にオルガノイドの血管新生と成熟の促進を誘発し、これらのプロセスを効率的に研究するために使用できます。...

ニワトリ胚の脳内移植による腎オルガノイドの効率的な血管新生

このプロトコルは懸濁液培養条件を使用して誘導された多能性幹細胞(iPS細胞)から腎臓オルガノイドを生産するための包括的で効率的な方法を提示します。この研究の主な重点は、初期細胞密度とWNTアゴニスト濃度の決定にあり、それによって腎臓オルガノイド研究に関心のある研究者に利益をもたらします。...

人工多能性幹細胞からの懸濁液中の腎臓オルガノイドの生成

このプロトコールは、ヒト多能性幹細胞を使用して血管オルガノイドを生成する方法を示します。...

ヒト人工多能性幹細胞からの血管オルガノイド作製

学ぶ ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成する簡略化された3D培養法。均一な大きさのオルガノイドを大量に作製し、腎臓の発生・疾患モデリングや創薬研究に応用できます。

ヒト多能性幹細胞から腎臓オルガノイドを生成するための簡略化された方法

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