Name: HiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: 学ぶHiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の高感度・高速検出法。患者血清サンプルにおける抗体スクリーニングに適したハイスループットアッセイで、COVID-19研究に貢献します。

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シャオホン・ヘ、リカルド・マリウス、ジュリア・ペトリク、ブラッドリー・オースティン、クリスティアーノ・タネーゼ・デ・ソウザの技術支援に感謝し、感謝します。また、グラフィックデザインのためにミナ・ガーレマニに感謝します。また、この研究のために血液サンプルを参加し、寄付したすべての人に感謝したいと思います。DWCは、uOttawaの教員と医学部によって部分的にサポートされています。

注: 以下に説明するプロトコルは、プロトコル コード 20200371-01H に従ってすべての倫理ガイドラインに準拠しています。
1. HiBiT-RBDバイオレポーターの製造と評価
<ol><li>十分な量のHiBiT-RBDバイオレポーターを生産する<ol>
<li>細胞培養の準備<ol>
<li>10%のウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含む完全なDulbeccoの修飾イーグル培地(DMEM)を準備します。その後、37°Cの水浴で媒体を温めます。</li>
			<li>生物学的安全キャビネット(BSC)をオンにし、キャビネット表面を殺菌するために70%v/vエタノールを使用してください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>細胞株を培養する。<ol>
<li>-80°Cまたは液体窒素から細胞株を取り出し、37°Cの水浴で解凍します。 注意:適切な細胞株は培養で維持しやすく、トランスフェクション効率が高く、外因性タンパク質の生産に適しています。ヒト胚性腎臓、HEK293細胞はこのプロトコルに使用した。</li>
			<li>解凍した細胞を完全な培地の少なくとも10 mLと混合し、10cmのペトリ皿に細胞懸濁液をピペットし、プレートを旋回して皿の中の細胞を均一に分配する。37°C、5%CO2、湿度85~95%の細胞培養インキュベーターに皿を入れます。</li>
			<li>合流レベルが80-90%に達するまで顕微鏡下で細胞を観察してください。高い合流度で、培地を取り出し、温かいリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を洗浄し、0.25%トリプシンエチレン酢酸の1mLを加えて細胞を表面から取り外します。 注: HEK293 セルは、かなり簡単に切り離されます。したがって、洗浄ステップは、偶発的な剥離や細胞の損失を防ぐために非常に穏やかに行われるべきです。</li>
			<li>約5分後、顕微鏡下で細胞を見てください。すべての細胞が浮遊している場合は、少なくとも4 mLの培地を加え、細胞懸濁液を新しい滅菌チューブに移します。血球計を使用して細胞を数え、トランスフェクションのために6ウェルプレートの各ウェルに1×106 個の細胞を加えます。 注:24時間後、細胞は80%以上のコンフルエントである必要があります。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ヒビト-RBDプラスミドのトランスフェクション<ol>
<li>適切なトランスフェクション試薬を用いて、1 μgのHiBiT-RBD発現プラスミドを使用してください。室温で10〜15分間インキュベートし、プレートの各ウェルに総体積を加え、滴下します。 メモ:メーカーのトランスフェクションプロトコルに従ってください。この場合、DMEMを用いたトランスフェクション試薬の混合物(指定量)をDMEM中の希釈プラスミド(1μg)に添加した( 材料表参照)。トランスフェクション効率をモニタリングするコントロールとして、プラスミド(例えば緑色蛍光タンパク質[GFP])を含むマーカーを使用する。</li>
			<li>翌日、トランスフェクション混合物を含む培地を完全な培地に交換します。トランスフェクション後48時間のトランスフェクション制御をよく観察します。 注:トランスフェクションが陽性で効率的(80%以上のGFP陽性)であれば、細胞はHiBiT-RBDバイオレポーターを収穫する準備ができているはずです。この構成体には、全上清の代わりに精製タンパク質を得るために使用することができるHis-tagも含まれています。</li>
			<li>1.5 mLマイクロチューブで上清を収集します。500 μL の 1x 受動リシス バッファー (PLB) をセルに追加します。インキュベートし、細胞のリシスのための室温で15分間プレートを振ります。 注:上清および溶解液は、少なくとも6ヶ月間、完全性のわずかな損失と-20°Cで保存することができます。Azadら 22によれば、レポーターはpH(4-12)および温度(4-42°C)の広い範囲で安定している。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>ルシファーゼアッセイによる生体レポーターからの発光シグナルの評価<ol>
<li>反応成分の準備<ol>
<li>バイオレポーターの供給源として上清を使用します。 注:上清とライセートの両方がHiBiT-RBDバイオレポーターを含み、アッセイに使用することができます。ただし、上清は以下の注意事項で説明する理由からソースとして推奨されます。</li>
			<li>LgBiTと基板を使用前に1倍に希釈します(ストック濃度は100倍)。 注: LgBiT の詳細については、 資料一覧 を参照してください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>ルシファーゼアッセイ<ol>
<li>上清の50 μLを各ウェルまたはチューブから96ウェルプレートに移し、各ウェルに50 μLの1x LgBiTを加えます。室温で5分間インキュベートします。</li>
			<li>ルミノメーターソフトウェアを開き、1x基板(furimazine)を各ウェルに50 μL追加し、プレートをルミノメーターに入れ、ソフトウェアを実行します。 注:プレートを読み取る直前に基質を追加して、シグナル測定前に活性酵素による基質の消費を防ぎます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>2. 迅速かつ感度の高いアッセイによる抗RBD抗体の検出
<ol><li>HiBiT-RBD抗体検出アッセイ<ol>
<li>プロトコルのセクション1.1に記載されているように、HiBiT-RBDバイオレポーターを準備します。 注 : タンパク質の成熟した糖化バージョンを含む、収集が簡単で、次のアッセイに上澄み物を使用することをお勧めします。さらに、ライセートには、HiBiT-RBD抗体相互作用を妨げる可能性のある他のいくつかのタンパク質があります。</li>
		<li>1.5 mLマイクロチューブで、HiBiT-RBD含有上清の50 μLを1μgの市販SARS-CoV-2-RBD抗体と組み合わせます。20 μLの免疫グロブリン結合タンパク質(プロテインG)を溶液に加えます。PBSを追加して、総体積を300 μLに引き上げる。 注:混合物の総体積は150 μLに減少させることができます。</li>
		<li>チューブシェーカーまたはローテーター上のチューブを30分間インキュベートします。遠心分離機は30× g で、上清を捨て、PBSで洗浄する。このプロセスを3回繰り返して、無料のHiBiT-RBDを削除します。50 μLのPBSで再中断し、96ウェルプレートに移します。</li>
		<li>1x LgBiTの50 μLを加え、5分待ちます。その後、1x NanoLuc基板の50μLを加えます。すぐにルミネス信号をルミノメーターで読み取ります。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 患者血清サンプルからのSARS-CoV-2特異的抗体のハイスループット検出
<ol><li>プロトコルのセクション1.1でハイスループットアッセイのためにHiBiT-RBDバイオレポーターの量を多く準備します。</li>
	<li>20 μL の磁気プロテイン G と HiBiT-RBD 上清の 50 μL を各サンプルに 96 ウェル プレートのウェルに組み合わせます。各ウェルに血清サンプル10μLを加え、PBSを加えて合計体積を150μLに引き上げます。 注:ステップ2.1.2で説明したように、非特異的IgG(陰性対照)とSARS-CoV-2抗体(陽性対照)を1μg/mL濃度で中和する両方を使用してください。さらに、ワクチン接種されたマウスからの血清サンプルも、抗体について評価することができる。この試験では、承認された手順の下で、個人からのインフォームド・コンセントを得て、オタワ病院総合キャンパスから血清サンプルを得た。</li>
	<li>室温でシェーカーで30分間インキュベートします。磁気ワッシャーの上にプレートを置き、タンパク質G抗体複合体を沈殿させます。 注:磁気ワッシャーの特定の構造は、各ウェルの側壁に複合体を沈殿します。</li>
	<li>各ウェルの中央部に溶液を捨て、洗浄用にPBSを加えます。過剰なHiBiT-RBDを除去するために、洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。1x PBS 50 μL と 1x LgBiT の 50 μL を加えます。室温で少なくとも5分間インキュベートする。</li>
	<li>ルミノメーターソフトウェアを準備し、1x基板の50 μLを追加します。プレートをマシンに置き、ソフトウェアを実行し、信号を記録します。血清サンプル、コントロールサンプル、バックグラウンド(空の井戸)からの信号を比較します。</li>
</ol>

<ol><li>Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+coronavirus+2019+%28COVID-19%29+pandemic+outbreak%3A+A+comprehensive+review+of+the+current+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Vacunas%22%5BJournal%5D)">Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature.</a> Vacunas. , (2020).</li>
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<li>Brown, E. E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+critical+determinants+of+ACE2-SARS+CoV-2+RBD+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction.</a> International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268(2021).</li>
<li>Azad, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gain-of-functional+screen+identifies+the+Hippo+pathway+as+a+central+mediator+of+receptor+tyrosine+kinases+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis.</a> Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).</li>
<li>Schwinn, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Mediated+tagging+of+endogenous+proteins+with+a+luminescent+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide.</a> ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).</li>
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</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

SARS-CoV-2に感染する人が増え、世界的なワクチン接種に取り組むには、大規模な血清調査で使用できる敏感で速い血清学的検査が必要です。最近の研究では、分割ナノルシメラーゼベースのバイオレポーターを使用してアッセイを開発できることが示されています。最近、HiBiT-RBDバイオレポーターを開発し、患者血清中のSARS-CoV-2特異的抗体を迅速かつ信頼性の高い方法で検出するためのテストを設計しました(図4C)。
このアッセイには、いくつかの重要なステップがあります。システムの効率はRBDタンパク質発現に依存するため、タンパク質レベルはウェスタンブロッティングによって検証されるべきである。また、RBDに対する市販の抗体や、陰性対照抗体などのポジティブコントロールを用いることが必要である。ナノルシメラーゼタンパク質の添加は、生物発光検出のための陽性制御として使用することが推奨されます。タンパク質製品にはHisタグも含まれており、多数の血清サンプルの精製に使用できます。 
<p class="jove_content"...

最近の新しいコロナウイルスSARS-CoV21の出現により、2012年3月30日時点で2,800,000人以上の死亡者と1億2,800万人の感染が発生しました。SARS-CoV-2臨床療法のための信頼でき、確立された処置の欠如のために、より重要な効果的で強い処置またはワクチン3を開発するために、さらなるウイルス伝達を制限するために多くの努力がなされてきた。現在までに、世界保健機関(WHO4)が報告した試験には、50人以上のCOVID-19ワクチン候補があります。SARS-CoV-2に対する抗体の検出は、COVID-195の回復された患者において、ワクチンの投与時の液性応答の長期安定性を決定するために最も重要である。いくつかの研究は、回復したSARS-CoV-2患者が1年後にRBD結合抗体のほとんどを失う可能性があることを実証した5、6、7、8、9。永続的な免疫をよりよく理解するためにさらなる調査が必要であり、より敏感な抗体検出プラットフォームは、そのような作業をさらに助けることができます。長期抗体応答を示唆する軽度のSARS-CoV-2感染の持続的免疫の報告も興味深く、価値のある研究分野である。迅速かつ正確な検出方法は、集団の免疫に関するより多くの情報を提供するために、個人のセラの抗体を監視するために不可欠です。
他のコロナウイルスと同様に、SARS-CoV-2は突出したスパイク糖タンパク質を使用してアンジオテンシン変換酵素-2(ACE2)に結合し、ウイルス膜と細胞膜の融合につながるイベントのカスケードを開始する6,7。いくつかの研究は最近、スパイクタンパク質のRBDがSARS-CoV28,9,10,11に対する強力かつ特異的な抗体応答を引き出す上で重要な役割を果たすことを証明した。特に、RbD結合抗体の力価と患者の血漿中性SARS-CoV-2中和力との間にPremkumarらによって観察される相関は、RBDがウイルス構造の免疫原性コンパートメントであることと一致する。そのことを念頭に置いて、SARS-CoV-2抗体検出に利用可能な多くの診断テストは、時間とコストを要する、インキュベーションおよび洗浄(酵素結合免疫吸着アッセイ[ELISA])、または感度と精度(横流免疫測定[LFIA])12の長い手順を必要とする。したがって、高感度、高速応答、および比較的低コストのCOVID-19由来抗体検出の定量的かつ迅速な相補血清学的方法は、SARS-CoV-2疫学的サーベイランスのための信頼性の高い血清学的検査の必要性に役立ちます。
総称して、現在の血清学的アッセイの限界は、将来の血清調査における潜在的な診断薬としての生物発光報告システムの調査を促した。生物発光は、自然に発生する酵素/基質反応であり、発光を伴います。ナノルクルシメラーゼは最も小さい(19kDa)でありながら、レニラとホタルルシファーゼ(それぞれ36kDaと61kDa)に比べて最も明るいシステムです13,14。さらに、Nanolucは前述のシステムの中で最も高い信号対雑音比および安定性を有する。ナノルクの高い信号強度は、レポーター融合15の非常に少量の検出をサポートしています。ナノルクバイナリテクノロジー(NanoBiT)は、2つのセグメントで構成されているNanolucシステムの分割版です: 小さなBiT (11アミノ酸;SmBiT)および比較的低親和性相互作用を有する大型BiT(LgBiT)(KD = 190 μM)を有し、発光複合体16を形成する。NanoBiTは、タンパク質相互作用の同定15、17、18、19および細胞シグナル伝達経路11,20,21の様々な研究で広く使用されています。
最近、LgBiT(KD = 0.7 nM)に対する明らかに高い親和性を有する別の小さなペプチド、すなわち、SmBiTの代わりにHiBiTナノグロ系が導入された。Nano-Gloの「付加ミックス読み取り」アッセイの高い親和性と強いシグナルは、HiBiTを適切な定量的で発光性ペプチドタグにします。このアプローチでは、HiBiTタグは、最小限の構造干渉を課す構造を開発することによって標的タンパク質に付加される。HiBiTタンパク質融合は、LgBiTの対応物に積極的に結合し、検出試薬の存在下で検出可能な生物発光を生成する高活性ルシファーゼ酵素を産生する(図1)。同様に、SARS-CoV-2回収された個体のセラ中の中和抗体力素を容易に測定するHiBiT Nano-Gloベースのシステムを開発し、最近HiBiTタグ付きSARS-CoV-2 RBDを開発しました。本論文では、標準的な実験手順と装置を用いてHiBiT-RBDバイオレポーターを製造するためのプロトコルについて述べ、このバイオレポーターをSARS-CoV-2 RBD標的抗体を検出するための迅速かつ効率的なアッセイで使用する方法を示す。

<table><tbody><tr><td>5x パッシブ溶解バッファー</td><td>Promega</td><td>E194A</td><td>30 mL</td></tr><tr><td>Bio-Plex ハンドヘルド磁気洗浄機</td><td>Bio-Rad</td><td>171020100</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Dual-Glo ルシフェラーゼアッセイシステム</td><td>Promega</td><td>E2940</td><td>100 mL キット</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F1051</td><td></td></tr><tr><td>HiBiT-RBD プラスミド</td><td></td><td></td><td>gacggatcgggagatcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcaaggcttgaccgaa ttgcatgaagaatctgcgcttctgtacgggccagatatacgc gttgacattgtttctcgtgaggattgattattgattattgattagt aatcaattacgggtcattagttcatagcccat atggagttccgcgttacataacttacggtaa atggccgcctggctgacccccccctccccaaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtattcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcagtacatcagtatcatatgccaagta cgccccctattgaccattgacgtcaatcaatgacggtaaatgg 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tcatgaagcatttattt agaaaataaacaaataggttccgcgcgca catttccccgaaaaagtgccacctgacgtc</td></tr><tr><td>LgBiT</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td></td></tr><tr><td>penicillin Streptomycin</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>Pierce Protein G Magnetic Beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88848</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent</td><td>Signagen</td><td>SL100688.5</td><td></td></tr><tr><td>SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab</td><td>SinoBiological</td><td>40592-MM57</td><td></td></tr><tr><td>Synergy Mx Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td>96-well plate reader luminometer</td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>2520056</td><td>0.25%</td></tr></tbody></table>

hibitベースバイオレポーターを用いたsars-cov-2受容体結合ドメイン抗体の検出

Detection of SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody using a HiBiT-Based Bioreporter

COVID-19パンデミックの出現は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)の疫学的影響を決定するためのより良い血清学的検出方法の必要性を高めている。SARS-CoV-2感染の増加は、より良い抗体検出アッセイの必要性を高める。現在の抗体検出方法は、速度に対する感度を損なうか、感度は高いが時間がかかります。SARS-CoV-2中和抗体の大部分は、SARS-CoV-2の一次免疫原性コンパートメントの1つである受容体結合ドメイン(RBD)を標的とする。我々は最近、SARS-CoV-2抗体を検出するために、高感度な生物発光タグ付きRBD(NanoLuc HiBiT-RBD)を設計し、開発しました。以下のテキストは、このツールを用いてRBD標的抗体の存在を評価するHiBiT-RBD複合体および高速アッセイを製造する手順を説明する。HiBiT-RBDタンパク質製品の耐久性が広い温度で、1時間以内に完了できる短い実験手順のために、このプロトコルは患者血清サンプル中のSARS-CoV-2抗体を検出するより効率的な代替手段として考えることができます。

このトランスフェクト細胞のHiBit-RBD含有細胞ライセートと上清の両方からのシグナルを記録し(図2)、適切なタンパク源を評価した。HiBiT-RBDとLgBitはコントロールとして別々に使用され、データは両方の部分を組み合わせたときに強い信号と比較して低い背景を示しました。したがって、LgBiTとのHiBiT-RBD相互作用は、基質消化および生物発光活性のための活性酵素を生成するために必要である(図1)。
タンパク質Gの添加は、抗体沈殿を助ける(図3)。このアッセイは、市販のSARS-CoV-2中和抗体からのシグナルをコントロールIgGと比較するために使用した。特異的抗体シグナルは堅牢であり、対照抗体は発光バックグラウンドレベルに近い(図4A)。Mタンパク質の51位に変異を有する組換え腫瘍溶血性小胞炎ウイルス(VSV)</st...

概説されたプロトコルは、HiBiT受容体結合ドメインタンパク質複合体を産生するための手順と、SARS-CoV-2抗体の迅速かつ感度的な検出のためのその応用について説明する。

HiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の検出

The emergence of the COVID-19 pandemic has increased the need for better serological detection methods to determine the epidemiologic impact of severe ...

私の研究室ではCOVID-19の研究に取り組んでおり、最近ではSARS-CoV-2抗体を迅速かつ正確に検出できる新しいアッセイを開発しました。このプロトコルは、現在のパンデミックを考えると重要である患者血清サンプル中の抗SARS-CoV-2抗体を検出するための高スループットアッセイを概説する。現在の血清学的アッセイの大部分は、感度の速度を犠牲にしたり、その逆を行ったりします。私たちのデータは、アッセイが敏感であり、迅速な応答時間を持っていることを示しています。十分な量の高いHiBiT-RBDバイオレポーターを製造するために、細胞培養の準備から始める。まず、10%のウシ胎児血清と1%ペニシリンとストレプトマイシンを含む完全なDulbeccoの改変ワシ培地を調製する。その後、37°Cの水浴でメディアを温めます。生物学的安全キャビネットをオンにし、キャビネット表面を殺菌するために70%エタノールを使用してください。細胞株を培養するには、マイナス80度または液体窒素から取り出し、37度の水浴で解凍します。解凍した細胞を完全な培地の少なくとも10ミリリットルと混合する。細胞懸濁液を15センチメートルのペトリ皿にピペットし、プレートを旋回して細胞を均一に分配する。37°C、5%の二酸化炭素、および85〜95%の湿度で細胞培養インキュベーターに皿を置きます。合流レベルが80〜90%に達するまで顕微鏡下で細胞を観察し、高い合流度で培地を取り除き、温かいPBSで細胞を洗い、0.25%トリプシンEDTAの3〜5ミリリットルを加えて細胞を表面から取り外します。約5分後、顕微鏡で細胞を見てください。すべての細胞が浮遊している場合は、少なくとも4ミリリットルの培地を加え、細胞懸濁液を新しい滅菌チューブに移します。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、トランスフェクションのために6ウェルプレートの各ウェルに100万個の細胞を追加します。HiBiT-RBDプラスミドのトランスフェクションを行う場合は、適切なトランスフェクション試薬を用いて、1マイクログラムのHiBiT-RBD発現プラスミドを使用してください。室温で10〜15分間インキュベートし、プレートの各ウェルに合計体積を滴下します。翌日、トランスフェクション混合物を含む培地を完全な培地に交換します。トランスフェクション後48時間でトランスフェクションコントロールをよく観察します。1.5ミリリットルマイクロチューブで上清を収集します。1X受動リシスバッファーまたは PLB の 500 マイクロリットルを細胞に加え、細胞のリシスのために室温でプレートを 15 分間インキュベートして振ります。次に、ルシファーゼアッセイを用いて生体レポーターからの発光シグナルを評価し、まず、反応成分を調製し、その上清をバイオレポーターの供給源として使用する。大きなBiTと基板を使用前に1倍に希釈してください。各ウェルまたはチューブから上澄み液の50マイクロリットルを96ウェルプレートに移し、1X大BiTの50マイクロリットルを各ウェルに加えます。室温で5分間インキュベートします。ルミノメーターソフトウェアを開き、各ウェルに1X基板の50マイクロリットルを追加し、照明計にプレートを配置し、ソフトウェアを実行します。HiBiT-RBD抗体検出アッセイを実行するために、前述のようにHiBiT-RBDバイオレポーターを調製し、上澄み物を含むHiBiT-RBDの50マイクロリットルを1.5ミリリットルマイクロチューブで市販SARS-CoV-2 RBD抗体の1マイクログラムと組み合わせます。20マイクロリットルの免疫グロブリン結合タンパク質またはプロテインGを溶液に加えます。PBSを加えて、総容積を300マイクロリットルにする。チューブシェーカーまたはローテーター上のチューブを30分間インキュベートします。遠心分離機は12,000Gで30秒間。その後、上清を捨て、PBSで洗います。このプロセスを3回繰り返して、無料のHiBiT-RBDを削除します。細胞をPBSの50マイクロリットルで再懸濁し、96ウェルプレートに移します。1X大BiTの50マイクロリットルを加え、5分間待ちます。その後、1X NanoLuc基板の50マイクロリットルを加えます。すぐにルミネッセンス信号をルミノメーターで読み取ります。ハイスループットアッセイのためにHiBiT-RBDバイオレポーターを大量に準備し、各サンプルの96ウェルプレートの各ウェルに20マイクロリットルの磁気プロテインGとHiBiT-RBD上清の50マイクロリットルを組み合わせます。各ウェルに血清サンプル10マイクロリットルを加え、PBSを加えて合計体積を150マイクロリットルにします。室温でシェーカーで30分間インキュベートします。次に、プレートを磁気ワッシャーの上に置き、プロテインG抗体複合体を沈殿させます。各ウェルの中央部に溶液を捨て、洗浄用のPBSを加えます。過剰なHiBiT-RBDを除去するために、洗浄工程を少なくとも3回繰り返します。1X PBSの50マイクロリットルと1X大BiTの50マイクロリットルを加え、室温で少なくとも5分間インキュベートします。ルミノメーターソフトウェアを準備します。その後、50マイクロリットルの1X基板を加えます。マシンにプレートを置き、ソフトウェアを実行し、信号を記録します。空のウェルからの血清サンプル、コントロールサンプル、バックグラウンド信号からの信号を比較します。細胞のライセートを含むHiBiT-RBDとトランスフェクト細胞の上清の両方からのシグナルを記録し、適切なタンパク質源を評価した。データは、両方の部分を組み合わせたときに強い信号に比べて低い背景を示しました。プロテインGの添加は、抗体沈殿を助ける。このアッセイは、市販のSARS-CoV-2中和抗体からのシグナルをコントロールIgGと比較するために使用した。特異的抗体シグナルは堅牢で、対照抗体は発光バックグラウンドレベルに近かった。組換えは、外因性RBDを発現するMタンパク質の51位に変異を有する腫瘍溶質性小胞炎ウイルスまたはVSVを減弱し、マウスにワクチンを接種するために使用した。ワクチン接種されたマウスから採取された血清は、コントロールVSVを注射されたマウスのシグナルと比較して、堅牢なシグナルを産生した。このプロトコルは患者血清サンプルのSARS-CoV-2抗体の検出に使用することができる。タンパク質Gでのインキュベーション後の洗浄ステップは、バックグラウンドを減らすために重要です。また、信号損失を避けるために、できるだけ早く基板を追加することが重要です。いくつかの追加の最適化ステップにより、同じアッセイを使用して血液サンプルを分析することができ、患者の血液サンプル中の抗SARS-CoV-2抗体を決定する有効な方法となり得る。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

定量的な、高スループット、リアルタイム、及びSiO上にラベルフリー生体分子の検出（DNA、タンパク質など）...

干渉反射イメージングセンサー（IRIS）を用いた生体分子の検出

このビデオは、ルシフェラーゼタグ付きタンパク質の定量に使用されるルシフェラーゼアッセイを示しています。このアッセイでは、目的のタンパク質と結合した小さなフラグメントと結合する大きなフラグメントで構成される人工的なルシフェラーゼ酵素を使用します。結合したサブユニットは活性酵素を形成し、基質の存在下で発光シグナルを放出します。次に、この信号をルミノメーターを使用して定量化します。...

ルシフェラーゼアッセイ:人工ナノルシフェラーゼシステムベースのバイオレポーターを使用して発光シグナルを測定するハイスループットアッセイ

このビデオでは、SARS-CoV-2中和抗体を検出するためのHiBit-RBDバイオレポーターシステムベースのアッセイを示しています。このシステムは、RBDドメインにHiBiTが融合した生物発光レポーターシステムを使用して、ウイルスのRBDドメインを標的とします。...

Bioreporter Assay:生物発光レポーターシステムを用いたSARS-CoV-2抗体検出のための高感度技術

ここで説明するプロトコルは、スパイク糖タンパク質に擬似的に結合した強化された緑色蛍光タンパク質標識付き小胞性口内炎ウイルスによる感染を阻害する回復血清サンプルの能力を評価することによって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する中和抗体を測定するための迅速かつ効果的な方法を概説する。...

疑似ウイルス感染のハイスループット蛍光イメージングを用いたSARS-CoV-2中和抗体の検出

SARS-CoV-2の中和IgGおよびIgM抗体を同時に測定できる多重血清および抗体中和アッセイの開発には、2レポーターの読み出しを提供するビーズベースの多重化アッセイのフロー分析システムが使用されました。...

多重化ビードベースの流れ分析システムのための高速多重デュアルレポーターIgGおよびIgM SARS-CoV-2中和アッセイ

このプロトコルでは、組換えSARS-CoV-2スパイクにコンジュゲートした量子ドットは、細胞ベースのアッセイを可能にし、原形質膜でのhACE2へのスパイク結合およびその後の細胞質への結合タンパク質のエンドサイトーシスをモニターする。...

HEK293T細胞における結合およびエンドサイトーシスを追跡するための量子ドット共役SARS-CoV-2スパイク三量体のハイスループット共焦点イメージング

この記事では、SARS-CoV-2感染またはワクチン接種に対する免疫応答から生じる2つの免疫グロブリンアイソタイプ(IgA、IgM、またはIgGのいずれか)の抗体価の動的変化を同時にモニタリングするための便利な方法について説明します。この「マルチアナライトCovid-19免疫応答パネル」は、「デュアルチャネル」機能を備えたフローベースのマルチプレックスリーダーを使用して読み取られるコード化されたミクロスフェア上に構築された3つの間接イムノアッセイを採用しています。...

Covid-19の多検体免疫ビーズアッセイを使用した血清変換の動的モニタリング

本プロトコルは、HA、S糖タンパク質、関連するハイブリッド型グリカン、および高マンノースオリゴ糖へのCV-N結合を調べるためのSPR結合アッセイのための新しいツールについて説明しています。SPRは、これらのグリカンに二量体または単量体CV-Nのいずれかを結合するためのKD...

表面プラズモン共鳴 による 抗ウイルス剤のエンジニアリング

ここでは、デュアルレポーターフローサイトメトリーシステムを使用して、アンジオテンシン変換酵素-2結合磁気マイクロスフェアによって捕捉された無傷の重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)ウイルス粒子上の2つのユニークなスパイクタンパク質エピトープを同時に検出する、新たに開発されたマルチプレックス蛍光免疫測定法について説明します。...

マルチプレックスデュアルレポーター法によるウイルス粒子上の表面タンパク質エピトープのプロファイリング

ここでは、無細胞合成生物学の原理と、ヒトおよび動物の血清における抗体応答のカスタマイズ可能な検出のためのドットブロット技術に基づいて最近開発されたイムノアッセイプラットフォームについて説明します。...

ヒトおよび動物の血清中の抗体応答を検出するための実用的で適応性の高いイムノアッセイプラットフォームとしての無細胞ドットブロット

学ぶHiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の高感度・高速検出法。患者血清サンプルにおける抗体スクリーニングに適したハイスループットアッセイで、COVID-19研究に貢献します。

HiBiTベースバイオレポーターを用いたSARS-CoV-2受容体結合ドメイン抗体の検出

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