Name: 生体膜力プローブ分光法による分子ばね定数解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 学ぶ生体膜力プローブ（BFP）を用いた動的力分光法による分子ばね定数の測定手法。生細胞表面の単一分子結合の力学解析と細胞膜メカニクスの理解に応用されます。

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ギヨーム・トロアデックは、有益な議論、ハードウェアコンサルテーションのためのZihao Wang、シドニー・マニュファクチャリング・ハブ、グレッグ・スアンイン、サイモン・リンガーのラボスタートアップのサポートに感謝します。この研究は、オーストラリア研究評議会ディスカバリープロジェクト(DP200101970 - L.A.J.)、NSW心血管能力構築プログラム(早期キャリア研究者グラント - L.A.J.)、シドニー研究アクセラレータ賞(SOAR - L.A.J.)、ラマシオッティ財団によって支援されました 健康投資助成金(2020HIG76 - L.A.J.)、国民保健医療研究評議会アイデアグラント(APP2003904 - L.A.J.)、シドニー大学工学部スタートアップファンドと主要機器スキーム(L.A.J.)。ライニングアーノルドジュは、オーストラリア研究評議会DECRAフェロー(DE190100609)です。

1. 分析可能な DFS イベントの取得
<ol><li>BFPコントロールとパラメータ設定(図S1A)のソフトウェア(例えば、LabVIEW VI)で実験を開始します。</li>
	<li>BFP モニタ用ソフトウェアで、反復プローブビーズ ターゲット ビーズ/セル タッチを観察します (図 S1B)。</li>
	<li>衝突力と接触時間を調整することにより、最初の50タッチ以内に20%の接着周波数≤を試験し、達成し、それによってDFS接着イベントの≥89%が単一結合12、13、14によって媒介されることを保証する。 注: 各ビーズセル/ビーズペアに対して、200反復的なタッチサイクルを実行します。パブリッシュ可能なデータ品質を得るために、我々は通常、n ≥3ビードビーズまたはビードセルペアを実行します。<ol>
<li>BFP コントロールとパラメータ設定のソフトウェアによってプロンプトが表示され、各ペアの最後までに、Force vs. Time という形式で、データをユーザーが指示したフォルダーに保存します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>BFP 取得プラットフォームを使用して、図 2Aに示すように、ボンド イベントのフォース対時間の生データを収集します (図 S1C)。<ol>
<li>BFP データ解析ソフトウェアを開きます。黄色のフォルダアイコンをクリックし、それらをダブルクリックして、対応する生データファイルを選択します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>プログラムを実行し、上ボタンと下向きボタンをクリックしてイベントを切り替えます。外れ値除外条件 (図 S2) を使用して、無効なイベントを表示します。[強制対時間]形式として書き出すデータ タイプを選択し、[ プロット データをエクスポート ]ボタンをクリックします。</li>
</ol>2. フォース対時間カーブをフォース対変位曲線に変換
<ol><li>リトラクトステージに対応するデータセグメントを、ばね定数分析に関連するスプレッドシート(図2A、四角いマーキー)にエクスポートします。</li>
	<li>スプレッドシート ソフトウェアを使用して、フォースとタイム カーブをプロットします。フォースと変位曲線を取得するには、時間値(図2A、x-軸)を、ピエゾ移動速度(プリセットで4,000 nm/s)で時間値を乗算して、合計変位値(Δxtot)に変換します。</li>
	<li>取得した各変位値から最小の変位値を引いて、最初のデータ点をゼロにします。この水平変換は、リトラクト ステージの上昇勾配や後続のばね定数計算には影響しません。</li>
	<li>特に、BFPは、RBC、Δx RBC(表1)の総変形をΔx、分子結合、Δxモル(表1)、標的細胞Δx細胞(表1)、Eq2として表したシリアルスプリングシステムと考えられている。 <img alt="静的平衡方程式Δxtot=ΔxRBC+Δxmol+Δxcell,数式" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 2"> (Eq. 2)</li>
	<li>図 2Bに示すように、力 (F) と変位 (Δxtot) カーブをプロットします。</li>
</ol>3. ビーズ-セルモードのスプリング・クネスタント解析
<ol><li>フォース対変位曲線では、2 つの異なるスロップを識別でき、それぞれが圧縮フェーズと引張フェーズを表すことができます。回帰直線を各データグループ(図2B)に適合し、より大きな線形適合勾配が圧縮相(図2B、赤色)における総ばね定数を表す(k1(表1)として示される)。そしてより小さい線形フィット勾配は、テンズリール相(図2B、青)でのスプリングの合計定数を表し、k2(表1)と示す。</li>
	<li>ステップ2.2の説明ごとに直列に接続されたばねについては、全ばね定数の逆数を表し、ktot(表1)、RBCのバネ定数逆数の和として、kRBC、kRBC(表1)、分子結合、kモル(表1)、および標的細胞、kセル(表1)を表す。ビーズ細胞モードの圧縮相の間、分子結合は伸張されず、従ってkモルは考慮されない。このシナリオでの kトートの逆数 (1/k1) は次のように表現されます。 <img alt="生物学における細胞動態を表す方程式。運動定数の図:k1、kRBC、kcell。" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 3"> (Eq. 3)。 サンプルデータでは、kRBCが事前に決定されています(デフォルトでは0.25 pN/nm)。kセルは、取得したk1およびk RBCを有するEq. 3から導出することができる(図3B)。</li>
	<li>引張段階の間、リガンドと受容体の対の間に接着が形成される。このシナリオでkトートの逆数を表現する (1/k2) <img alt="速度論研究で使用される、1/k2 = 1/kRBC + 1/kmol + 1/kcellを示す直列抵抗方程式。" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 4"> (Eq. 4) ここで k2 ( 表1) は、引張フェーズ中のばね定数の合計を表します。</li>
	<li>1/ k1を1/ k2から1/k1を引いてkモルを導出する(Eq. 3対Eq. 4を比較する)。</li>
</ol>4. ビーズビーズモードのスプリング定数分析
<ol><li>回帰直線を圧縮相データに合わせて k 1 (図 2B、赤に似ています) を得る。なお、ビーズ・ビードモードでは、標的細胞は目的の受容体でコーティングされたガラスビーズに置き換えられる(図1C)。ビードの変形は無視できるので、1/k細胞項は、それに応じてEq. 3およびEq. 4から除去することができる。圧縮相(1/k1)の逆数kトートは、次のように表現できます。 <img alt="関係を示す方程式:1 / k1 = 1 / kRBC;生化学分析における運動速度定数の鍵" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 5"> (Eq. 5)</li>
	<li>引っ張り相データに回帰直線を合わせてk2を得る(図2B、青に似ている)。引張フェーズの逆数kトート(1/k2) は、次のように表現できます。 <img alt="反応速度方程式、逆速度定数図。速度論解析のためのk2,kRBC,kmol項" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq06.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 6"> (Eq. 6)</li>
	<li>1/ k1を1/k2から減算から kモルを導出する (Eq. 5 対 Eq. 6)。</li>
</ol>

<ol><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+Biomembrane+Force+Probe%3A+Concurrent+Quantitation+of+Receptor-ligand+Kinetics+and+Binding-induced+Intracellular+Signaling+on+a+Single+Cell%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Fluorescence Biomembrane Force Probe: Concurrent Quantitation of Receptor-ligand Kinetics and Binding-induced Intracellular Signaling on a Single Cell.</a> The Journal of Visualized Experiments. (102), e52975(2015).</li>
<li>Su, Q. P., Ju, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+nanotools+for+single-molecule+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Reviews%22%5BJournal%5D)">Biophysical nanotools for single-molecule dynamics.</a> Biophysics Reviews. 10 (5), 1349-1357 (2018).</li>
<li>Ju, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Force+Spectroscopy+Analysis+on+the+Redox+States+of+Protein+Disulphide+Bonds%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dynamic Force Spectroscopy Analysis on the Redox States of Protein Disulphide Bonds.</a> Methods in Molecular Biology. 1967, 115-131 (2019).</li>
<li>An, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-stable+Biomembrane+Force+Probe+for+Accurately+Determining+Slow+Dissociation+Kinetics+of+PD-1+Blockade+Antibodies+on+Single+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Ultra-stable Biomembrane Force Probe for Accurately Determining Slow Dissociation Kinetics of PD-1 Blockade Antibodies on Single Living Cells.</a> Nano Letters. 20 (7), 5133-5140 (2020).</li>
<li>Chen, Y., Ju, L., Rushdi, M., Ge, C., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+cell+mechanosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated cell mechanosensing.</a> Molecular Biology of the Cell. 28 (23), 3134-3155 (2017).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Rushdi, M. N., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Dimensional+Analysis+of+Cross-Junctional+Molecular+Interaction+by+Force+Probes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Two-Dimensional Analysis of Cross-Junctional Molecular Interaction by Force Probes.</a> Methods in Molecular Biology. 1584, 231-258 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+force+technique+to+probe+molecular+adhesion+and+structural+linkages+at+biological+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive force technique to probe molecular adhesion and structural linkages at biological interfaces.</a> Biophysical Journal. 68 (6), 2580-2587 (1995).</li>
<li>Ju, L., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarks+of+Biomembrane+Force+Probe+Spring+Constant+Models%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Benchmarks of Biomembrane Force Probe Spring Constant Models.</a> Biophysical Journal. 113 (12), 2842-2845 (2017).</li>
<li>Evans, E., Ritchie, K., Merkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+Force+Technique+to+Probe+Molecular+Adhesion+and+Structural+Linkages+at+Biological+Interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Sensitive Force Technique to Probe Molecular Adhesion and Structural Linkages at Biological Interfaces.</a> Biophysical Journal. 68, 2580(1995).</li>
<li>Fiore, V. F., Ju, L., Chen, Y., Zhu, C., Barker, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+catch+of+a+Thy-1-alpha5beta1%2Bsyndecan-4+trimolecular+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Dynamic catch of a Thy-1-alpha5beta1+syndecan-4 trimolecular complex.</a> Nature Communications. 5, 4886(2014).</li>
<li>Passam, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechano-redox+control+of+integrin+de-adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Mechano-redox control of integrin de-adhesion.</a> Elife. 7, (2018).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrin+alphaIIbbeta3+intermediate+affinity+state+mediates+biomechanical+platelet+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">An integrin alphaIIbbeta3 intermediate affinity state mediates biomechanical platelet aggregation.</a> Nature Materials. 18 (7), 760-769 (2019).</li>
<li>Chen, Y., Lee, H., Tong, H., Schwartz, M., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Force+regulated+conformational+change+of+integrin+%CE%B1V%CE%B23%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Force regulated conformational change of integrin αVβ3.</a> Matrix Biology. 60, 70-85 (2017).</li>
<li>Liu, B., Chen, W., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+force+spectroscopy+on+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular force spectroscopy on cells.</a> Annual Review of Physical Chemistry. 66, 427-451 (2015).</li>
<li>Piper, J. W., Swerlick, R. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+force+dependence+of+two-dimensional+receptor-ligand+binding+affinity+by+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Determining force dependence of two-dimensional receptor-ligand binding affinity by centrifugation.</a> Biophysical Journal. 74 (1), 492-513 (1998).</li>
<li>Ju, L., Dong, J. -f, Cruz, M. A., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+N-terminal+flanking+region+of+the+A1+domain+regulates+the+force-dependent+binding+of+von+Willebrand+factor+to+platelet+glycoprotein+Ib%CE%B1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The N-terminal flanking region of the A1 domain regulates the force-dependent binding of von Willebrand factor to platelet glycoprotein Ibα.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (45), 32289-32301 (2013).</li>
<li>Ju, L., Chen, Y., Xue, L., Du, X., Zhu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+unfolding+of+distinctive+mechanoreceptor+domains+transduces+force+into+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Cooperative unfolding of distinctive mechanoreceptor domains transduces force into signals.</a> Elife. 5, 15447(2016).</li>
</ol>

著者らは、本研究に関して報告する競合する利益はないと宣言している。

要約すると、BFPビーズビーズおよびビードセル解析モードでDFS生データを前処理し、分子ばね定数を導出するための詳細なデータ分析プロトコルを提供しました。分子および細胞のばね定数を決定するために必要な生体力学的モデルと方程式が提示される。異なるインテグリンが研究されているにもかかわらず、ビーズ・ビーズ・モードとビーズ・セル・モードで測定された kモル は有意な範囲差を有する(図3A 対 図3C)。注目すべきは、ビードビーズモードでは、受容体はガラスビーズに共有結合している。これに対して、ビーズ細胞モードでは、表面受容体は、基になる原形質膜および細胞骨格によって適応され、測定された kモルに影響を与える可能性が最も高い。
データ品質管理は、再現性を確保するために重要です。このため、フォースプロットと時間プロットに対するDFSデータの事前スクリーニングと外れ値除外基準を実装しました。これを...

ライブセルDFS技術として、BFPはヒト赤血球(RBC;)図1)0.1-3pN/nm1、2、3で互換性のあるばね定数範囲を持つ超高感度で調整可能な力トランスデューサーに。リガンドと受容体の相互作用をプローブするために、BFPは、約1pN(10-12 N)、〜3nm(10-9 m)、および〜0.5 ms(10-3 s)の力、空間、および時間分解能4、5でDFS測定を可能にする。その実験的構成は、2つの対向するマイクロピペット、すなわちプローブとターゲットで構成されています。プローブマイクロピペットはRBCを吸引し、ビーズはビオチンとストレプトアビジンの相互作用を介して頂点に接着されます。ビーズは、目的のリガンドでコーティングされている(図1A)。標的マイクロピペットは、対象の受容体を担う細胞またはビーズのいずれかを吸引し、ビーズ細胞(図1B)およびビーズビーズ(図1C)モードにそれぞれ対応し、それぞれ5。
BFP の構築、アセンブリ、DFS 実験プロトコルについては、前に1,6を詳しく説明しました。簡単に言えば、BFPタッチサイクルは、アプローチ、インピンジ、接触、後退および解化の5つの段階で構成されています(図1D)。水平 RBC 頂点位置は ΔxRBCと示されます。冒頭で、無ストレス(ゼロフォース)RBC変形ΔxRBCは0(表1)である。ターゲットは、ピエゾトランスレータによって駆動され、プローブビードを押さえ、引き込まれるようにします(図1D)。RBCプローブは、まず負のRBC変形ΔxRBC&lt;0でターゲットによって圧縮されます。ボンドイベントでは、リトラクトステージは、正のRBC変形ΔxRBC&gt;0(図2CおよびD)を有する圧縮相から引張り相に移行する。フックの法則によれば、BFP軸受力は、F = kRBC×Δ xRBCとして測定することができ、k RBC(表1)はBFPのRBCばね定数である。ボンド破裂と1回のタッチサイクルの完了時に、プローブビーズはΔxRBC = 0(図1D)でゼロフォース位置に戻ります。
kRBCを決定するために、プローブマイクロピペット内オリフィス(R p)、RBC(R0)、およびRBCとプローブビーズの間の円形接触領域(Rc)の半径を測定し、記録する(図1A)。次いで、KRBCは、BFP(図S1A)8,9を操作する仮想計測器(VI)として機能するLabVIEWプログラムを用いて、Evanのモデル(Eq. 1)7,8に従って計算される。 
<img alt="流体力学におけるkRBCの静的平衡方程式 変数と対数項を示す" src="/files/ftp_upload/62490/62490eq01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation 1"> (Eq. 1)
BFPが確立され、DFS生データが得られたことで、リガンドとレセプターの対または細胞のばね定数を分析する方法を紹介します。グリコシル化タンパク質Thy-1とK562細胞を持つインテグリンの相互作用に関するDFS生データα 5 β 1 (thy-1-α5β1;図3A及び3B)10及びフィブリノーゲン及びビーズ αのそのとIIb β 3(FGN-α IIb β 3; 図3C)11,12は、ビーズセルおよびビードビーズ分析モードをそれぞれ実証するために使用されています。
BFP実験準備 BFP実験の準備と計測の詳細については、前に公開したプロトコル3を参照してください。簡単に言えば、ヒトRBCは、炭素/重炭酸塩緩衝液中のビオチン-PEG3500-NHSを用いてビオチン化されている。目的のタンパク質は、リン酸緩衝液中のMAL-PEG3500-NHSを用いてホウケイ酸ガラスビーズに共有結合されている。ビオチン化RBCに付着するために、プローブビーズはまた、MAL-SAを使用してストレプトアビジン(SA)でコーティングされています。 資料表 と 表2を参照してください。
BFP(図1、左)を組み立てるには、プローブビーズを送達し、RBCの頂点1、3に接着するために「ヘルパー」と呼ぶ3番目のマイクロピペットを使用します。SAコーティングプローブビーズとビオチン化RBCの共有結合相互作用は、対象のリガンド-受容体結合よりもはるかに強い。したがって、解離ステージは、RBCからのプローブビーズの剥離ではなく、リガンド-受容体結合破裂と解釈することができる。

<table><tbody><tr><td>3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPTMS)</td><td>Uct、Specialties、llc</td><td>4420-74-0</td><td>ガラスビーズ機能化</td></tr><tr><td>Anhy。リン酸ナトリウム 二塩基性(Na2HPO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td><td>リン酸緩衝液調製</td></tr><tr><td>BFPデータ取得 VI</td><td>LabVIEW</td><td></td><td>BFP制御およびパラメータ設定 BFP</td></tr><tr><td>データ解析 VI</td><td>LabVIEW</td><td></td><td>BFP生データ解析</td></tr><tr><td>Biotin-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5026-1</td><td>RBCビオチン化</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスビーズ</td><td>Distrilab Particle Technology, Netherlands</td><td>9002</td><td>ガラスビーズの機能化</td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0336</td><td>リガンド機能化</td></tr><tr><td>カメラ VI</td><td>LabVIEW</td><td></td><td>BFPモニタリング</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td>Tyrode'緩衝液調製</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode'緩衝液</td></tr><tr><td>調製 MAL-PEG3500-NHS</td><td>JenKem</td><td>A5002-1</td><td>ガラスビーズ官能基化</td></tr><tr><td>塩化カリウム (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td>Tyrode's緩衝液</td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム(NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td>炭酸塩/重炭酸塩緩衝液;タイロード緩衝液</td></tr><tr><td>炭酸ナトリウム(Na2CO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127</td><td>炭酸塩/重炭酸塩緩衝液</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td>Tyrode's緩衝液</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一塩基性一水和物(NaH2PO4&bull;H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td>リン酸緩衝液の調製</td></tr><tr><td>ストレプトアビジン-マレイミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9415</td><td>ガラスビーズの機能化</td></tr></tbody></table>

生体膜力プローブ分光法による分子ばね定数解析

Molecular Spring Constant Analysis by Biomembrane Force Probe Spectroscopy

生体膜力プローブ(BFP)は、最近、単一分子結合性キネティクスを測定し、リガンド-受容体相互作用の機械的特性を評価し、タンパク質の動的構造変化を視覚化し、よりエキサイティングに受容体媒介細胞メカノセンシング機構を解明することができる、ネイティブ細胞表面または その場 動的力分光(DFS)ナノツールとして出現しました。最近では、BFPは分子結合のばね定数を測定するために使用されています。このプロトコルは、分子ばね定数DFS分析を実行するためのステップバイステップの手順を説明する。具体的には、2つのBFP動作モード、すなわちビードセルとビードビードモードについて説明します。このプロトコルは、DFS生データから分子結合と細胞のばね定数を導き出することに焦点を当てています。

この研究では、BFPばね定数分析のプロトコルを実証しました。ビーズ細胞解析モードでは、プローブビーズ上でコーティングされたグリコシル化タンパク質Thy-1と、標的K562α細胞上で発現するインテグリンα 5 β 1との間の分子結合のkモルを解析β 1 β。図 3A)10. kセルもビーズセルモードから派生します (K562 セル;図 3B)。ビード・ビードモードでは、フィブリノーゲンとインテグリンの間に形成される分子結合α IIbβ 3(FGN-インテグリンα IIbβ 3;図3C)11,12...

バイオメンブレン力プローブ(BFP)は、イン ・ス・ ダイナミック・フォース分光法(DFS)の技術です。BFPは、生細胞上の分子相互作用のばね定数を測定するために使用することができる。このプロトコルは、BFPによって検出された分子結合に対するばね定数分析を提示する。

A biomembrane force probe (BFP) has recently emerged as a native-cell-surface or in situ dynamic force spectroscopy (DFS) nanotool that can measure ...

このビデオでは、バイオメンブレンフォースプローブ(BFP)を使用して分子ばね定数を測定する方法を段階的に説明します。力プローブでは、BFPは最近、ネイティブの細胞表面またはSITUダイナミックフォース分光分析で出現しました。この技術の主な目的は、単一分子結合遺伝学を測定することである。このデータ分析手順は、単純だが強力なメッセージであり、機械的な情報、特に細胞膜発現分子の動的な力および炎症を提供する。BFP実験サイクル中、プローブマイクロバイオームは赤血球と検認物でベットし、標的細胞とリガンド受容体受容体とプローブと標的との間の分子結合は、一連の接続された脳系と考えることができる。フックの法則に基づいて、接続されたばね系のスプリングの全定数の逆数は、式が示すように、各単一成分の逆ばね定数の合計に等しくなります。赤血球のばね定数は、オリフィス中のプローブマイクロピペットの放射状に依存する事象運動に基づいて計算される。赤血球とは、赤血球と検認とマイクロピペット吸引圧との間の円形接触領域である。BFP道路データは、パトランスレータによるターゲットマイクロピペットの動きを制御する自家製左ビュー仮想機器によって取得されます。PFPの完全な接触周期は5つの段階から成っている。アプローチ.Impinge.Contact. 撤回し、解き直す。最初は、ロブスト APICS の位置が黒色のデシャインで 0 と等しいと示される応力は発生します。ターゲットは、負の検認運動を引き起こすためにrobustoを衝突させ、圧縮するためにピースまたは翻訳者によって駆動されます。赤い破線では、ゼロより小さい X として注意してください。リトラクト段階では、赤いバスの頂点がXから0未満の位置から、圧縮相と呼ばれるゼロ位置に等しいXに戻ります。リガンド受容体分子複合体との間に結合が形成される場合、赤血球は他の正方向とはさらに異なるだろう。このXはゼロより大きい周期を、引っ込みステージの引張フェーズと呼ぶ。リトラクトステージは、結合の分子のばね定数を決定する最も重要な部分です。BSPデータ取得プラットフォームを使用して、フォース対タイムロードデータを収集します。各実験は、通常、50〜200のタッチサイクルを記録し、PFPデータ分析ソフトウェアを開きます。黄色のフォルダアイコンをクリックし、それらをダブルクリックして、対応する行データファイルを選択します。私たちはプログラムに参加しています。次に、上下の矢印ボタンをクリックして、イベントを切り替えます。外れ値除外条件を使用して無効なイベントを除外する。強制的に時間形式に設定されているエクスポート データ型を選択し、適切な状態の時間範囲を選択します。[印刷データのエクスポート] ボタンをクリックします。エクスポートされたデータは、デフォルトでテキストファイルとして保存されます。このテキスト ファイルには、2 列のデータが含まれています。これは、時間パパを表す最初の列と、各時点で対応する力を表す2番目の列です。スプレッドシート ソフトウェアを使用してフォース対時間曲線をプロットし、強制対変位曲線を取得します。各データポイントの時間値にウィロー鋼の PSO ムーブメントを掛けます。各データ ポイントから最小の変位値を差し引いて、最初のデータ ポイントをゼロにします。この水平変換は、後続のばね定数計算には影響しません。力対変位曲線では、新しい力の傾きを識別できる場合、2つの異なるアクターグループが異なっていました。それぞれ圧縮相と 10 スタイルのフェーズを表します。回帰直線を各データ グループに適合します。傾斜が急なラインは、K1 と表記されたコンプレッサフェーズでのスプリングの合計定数を表します。そして、最も小さい上にあった線は、私が言及した K2.As として示されるこの10スタイルの相の線を表し、総ばね定数は各成分の系列ばね定数の息子の逆数です。拍細胞モードの圧縮相の間、分子結合は伸ばされず、従って分子結合ばね定数は考慮されない。ターゲットセルのばね定数は、K1が圧縮相中の総ばね定数を表す式として記述される。ビートの10スタイルのフェーズでは、売りモードで、総ばね定数は赤血球分子結合のuverseばね定数の太陽である。そして、標的細胞と、表示された式を用いて、分子結合ばね定数を計算し、K2は全ばね定数を表す。10 ストップ フェーズを読みます。拍動モードでは、B変形が無視可能であるため、ターゲット細胞ばね定数の逆値を記述する用語はゼロに近づき、したがって圧縮機相における総ばね定数は、次式として示す赤血球ばね定数と同等である。引張相において、分子結合のばね定数は、次式として示す赤血球の効果を減算して算出できる。側風積分姿勢B、β3複合体、K562細胞及びフェブリフジン積分態度Bβ3複合体のばね定数を収集し、ニュートンまたはナノメートルスケールをピックして導出されたばね定数の平均と標準偏差を算出する。これで、VFD データから一定の測定とスプリングの要件が何であるかをより深く理解する必要があります。ビート・ビト・セル・モードとビート・モードの違いは注目すべきです。異なる分子提示サービスは、ばね定数の尺度とは異なる防御を有するであろう。結論として、このステップバイステップの手順は、BFPを使用して分子ばね定数分析を行う方法を説明しています。今後、BFPデータ取得とDFS解析を1つのコンピュータ・レスト・プログラムに自動化・統合する取り組みが行われると見ています。全体のBFP操作データ分析をよりユーザーフレンドリーで高い全体を実現します。

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