ヒト骨髄性U937細胞におけるフローサイトメトリーによるSAMHD1制限の解析

マクロファージのHIV感染における細胞因子の役割への関心が高まる中、特にU937細胞では発現していないSAM HG ONについて、柔軟な解析システムを開発しました。システムの主な利点は、その柔軟性です。セットアップが完了すると、さまざまなタンパク質、細胞、または標的ウイルスの分析に使用できます。

細胞の健康を維持し、マルチカラーフローサイトメトリーに慣れていることが重要です。分析を開始する10分前にサイトメーターとコンピューターの電源を入れます。廃棄物が空で、シースタンクがいっぱいであることを確認してください。

次に、ログインして分析ソフトウェアを開きます。アームを動かした後、ウォーターチューブを外します。流量を高く設定し、プライムを押します。

ライトが消えるのを待って、このプロセスをさらに3回繰り返します。水管を元に戻し、高流量で3分間運転します。次に、流量を低く設定し、取得するまでスタンバイを押します。

実験を選択し、新しい実験を選択し、[OK]を押して空の実験を選択し、実験を右クリックして新しい標本を追加します。OKを押してパネルを空白にします。右クリックして適切な名前に変更し、プラス記号をクリックして試験片を開き、新しいチューブを表示します。

チューブをダブルクリックして、インスペクターにサイトメーターの設定を表示します。パラメータメニューで、青色レーザー53030と黄色レーザー61020以外の不要な蛍光色素を削除します。ワークシートで、対応するアイコンをクリックし、軸ラベルをクリックして軸を変更して、前方散布領域対側散布領域ドットプロット、YFPヒストグラム、RFPヒストグラム、およびRFP対YFPドットプロットを作成します。

感染していない、トランスデュースされていないコントロールをロードし、マシンで実行を押します。次に、取得ダッシュボードで[取得]を押します。ダッシュボードで前方散乱電圧と側面散乱電圧を調整して、セルを左下の象限に配置します。

この人口の周りをゲートし、P oneとしてラベルを付けます。他のプロットを右クリックし、P 1を表示を選択して、後続の解析から破片を除去します。RFP電圧とYFP電圧を下げて、ピークがヒストグラムの左側になるようにします。

YFPのシングルカラーコントロールをロードし、取得を押します。ダッシュボードでYFP電圧を調整して、ほとんどの蛍光セルが検出器の範囲内にあるようにします。次に、RFPコントロールについても同じことを繰り返します。

実験を選択します。報酬設定に移動し、報酬コントロールの作成を選択し、正常ワークシートに切り替えてから、染色されていない通常のワークシートを選択します。実行を押して、汚れのないコントロールを取得します。

無傷のセルの周りにゲートPを1つ描き、記録します。チューブを取り外し、機械をスタンバイ状態にします。P oneを右クリックします。

すべての報酬コントロールに適用をクリックし、RFPの通常のワークシートに切り替えます。実行を押して、単色RFPコントロールを記録すると、ソフトウェアは自動的に正のセルをゲートします。マシンをスタンバイ状態にし、YFPコントロールについても同じことを繰り返します。

実験を選択し、報酬設定に移動し、報酬の計算を選択してから、リンクをクリックして保存します。グローバルワークシートに切り替えて、試験片チューブに戻ります。HIV RFPに感染した野生型SAM HD 1で形質導入された細胞を取得し、YFPとRFPのために垂直方向と水平方向に整列した象限の隅に4つの異なる集団が見られることを確認します。

チューブを取り外し、スタンバイを押します。形質導入されていない、感染していないサンプルをリロードし、runを押します。取得ダッシュボードで、停止ゲートをP oneに設定し、イベントは30, 000イベントを記録するように設定します。

レコードを押します。各チューブの間に次のチューブを押して、他のサンプルとコントロールについても同じことを繰り返します。実行中またはホーク後にサンプルの名前を変更し、データをドットFCSファイルとしてエクスポートします。

ソフトウェアを開き、すべてのFCSファイルをダッシュボードにドラッグします。報酬コントロールを選択し、報酬サブフォルダーにドラッグします。トランスデュースされていない、感染していないチューブをダブルクリックしてファイルを開き、前方散乱プロットと側方散乱プロットを行います。

ポリゴンツールを選択し、左下隅の破片を除く無傷のセル集団にゲートし、セルに名前を付けます。セルが隠れないようにラベルを移動します。このゲートを、すべてのサンプルバーのチューブの母集団全体にドラッグします。

水平矢印ボタンを使用して母集団全体をスクロールし、各チューブに適切なゲーティングを確保します。セルをダブルクリックして、軸を高さと面積に調整します。長方形のゲートを使用して単一の大きな母集団を選択し、ダブレットを除外し、ソフトウェアが単一セルとして自動的に名前を付けるように提案できるようにします。

次に、このゲートをすべての細胞集団にドラッグし、ゲーティングがすべてのサンプルに適していることを確認します。感染していない、形質導入されていないサンプルの単一細胞集団を選択します。Y軸をYFPの補正された青色レーザーに変更し、X軸をRFPの補正された黄色のレーザーに変更します。

象限ゲーティングツールを選択し、負の細胞集団の右上端をクリックします。この予備ゲーティングをすべての単一細胞集団に適用するには、すべてのサンプルバーの親ゲートにドラッグします。象限ゲートで人口が十分に区切られない場合は、ポリゴン ツールを使用して個々の象限をゲートします。

野生型SAM HDワンオンリーサンプルまでスクロールして、形質導入されていないYFP陰性細胞とYFP陽性細胞の間の正しいゲーティングを確認します。等高線ビューを使用して、負のセルと薄暗いYFPセルを区別します。すべてのサンプルに有効なYFP陰性と陽性の間の最良の分割を使用し、サンプルをスクロールしてYFP陽性に関してゲーティングを確認します。

形質導入されていないHIV RFP感染サンプルまでスクロールし、感染していないRFP陰性と感染RFP陽性の間のゲーティングが正しいかどうかを確認します。必要に応じて等高線ビューを使用し、残りのサンプルをスクロールして、ゲーティングがすべてのサンプルに対して有効であることを確認します。各サンプルには4つの象限が必要です。

Q1 YFP陽性、Q2ダブルポジティブ、Q3 RFPポジティブ、Q4ダブルネガティブ。テーブル エディターを開き、4 つの象限ゲートをダッシュボードにドラッグします。ドロップダウンからファイリングとエクセルを選択します。

ファイルの保存先を選択し、[テーブルの作成]をクリックします。生成されたスプレッドシートをローカルファイルの命名規則に従って保存します。レイアウトエディタアイコンをクリックして、プロットとゲーティング戦略の表現をエクスポートします。

各母集団を選択し、必要な軸、ラベル、間隔を指定してエディターにドラッグします。バッチセクションの下のすべてのサンプルに同じプロットが表示されているレイアウトを作成するには、列に1つを入力し、バッチレポートの作成を押します。ファイルメニューで、幅に合わせて拡大縮小を選択し、改ページを避けます。

次に、必要なファイル形式で保存します。エクスポートされたスプレッドシートで、テキスト原稿の説明に従って列を生成します。適切なデータ分析ソフトウェアを使用して、SAM HD 1つのコンストラクトごとにレプリケートデータを平均し、制限率の値を計算します。

代表的なYFP対RFPプロットは、最適および準最適データに対して生成されました。次善のデータプロットは、HIV感染が低すぎて、補償とゲーティングが困難になったことを示しています。制限率は0.5で、予想比の0.3を上回った。

SAM HD Oneの変異株について、野生型および陰性対照に対する制限比のプロットを最適および準最適データについて生成した。最適データでは、野生型は約0.2の予想制限を示し、7つのAAに対する陰性対照HD 206の制限比は1.0であった。バリアントR372Dは野生型とは有意に異なっていましたが、陰性対照と有意差はなく、制限する能力を失いました。

次善のデータでは、陰性対照は期待どおりに行動したが、野生型は感染率が低いため0.5の制限率を示した。R143Dは、野生型および陰性対照とは統計的に異なる中間表現型を示した。変異体G209Sは野生型とは有意に異なっていたが、陰性対照と有意差はなかったため、制限する能力を失っている。

特にフローサイトメトリーを初めて使用する場合は、コントロール細胞をたくさん持つことが重要です。これに続いて、または並行して、同じ変異体の生化学的分析を実行して全体像を形成することができる。