成体マウスからの心房と心室筋細胞の同時分離のためのランゲンドルフ法の改変
2021年5月13日
このプロトコルは、成体マウスからの心房および心室筋細胞の同時分離のための大歯カンヌレーションの深さを含むランゲンドルフ法の修飾を記述する。
このプロトコルは、浸透したマウス心臓からの心房収率を向上させるのに役立つ可能性がある。この方法の主な利点は、心房と心室筋細胞が同じ消化条件下で同時に単離できることである。この方法は、細胞および細胞内レベルでの心臓病のメカニズムに関する洞察を提供することができる。
8〜10週齢の雄C57黒6マウスを安楽死させた後、組織鉗子を使用してxiphoidの皮膚を持ち上げる。次に、ティッシュハサミを使用して、皮膚を通して軽度の横切開を行います。皮膚と鼻隠しの間で鈍い解剖を行う。
両側のV字形の腋窩に向かって皮膚切開を伸ばし、胸部を通して切開を続けます。その後、組織鉗子を使用して胸骨をクランプし、胸部を上方に偏向させ、心臓と肺を完全に露出させます。湾曲した鉗子を使用して、心膜を剥がします。
胸腺が大血管を覆う場合は、2つの湾曲した鉗子を使用して胸腺を両側に引き裂き、大動脈とその枝動脈がY字型血管として見えるまで、心臓の基部を尾に向かってそっと引っ張る。左の一般的な頸動脈で大動脈をトランセクトし、次に腕頭筋動脈を切断する。心臓を切り出し、すぐにチロードの溶液を含むペトリ皿に浸して、残りの血液を洗浄して送り出します。
その後、溶液1を含む別のペトリ皿に心臓を移します。ステレオ顕微鏡の下で、細かいアイリスはさみを使用して、余剰組織をトリミングします。注射器から気泡を排出します。
次に、2つのストレートタイイング鉗子の助けを借りて、逆行大動脈カヌレーションを行い、全体の缶占プロセスが液体表面下で行われることに注意を払う。カニューレ先端が上大動脈にあるようなカニュールの深さを調整し、大動脈弁に浸透しないように注意してください。次に、前ノット3-O縫合糸で、大麦をカニューレノッチにリゲートします。
注射器から溶液1を穏やかに注入し、残りの血液を洗い流します。その後、カンヌル化された心臓をランゲンドルフ装置に接続し、心臓に気泡を導入しないように注意してください。カンニュール心臓をランゲンドルフ装置に接続した後、約2分間、溶液1で心臓を穿ファリングする。
1回使用の滅菌ポリエチレンピペットを使用して、約2.5ミリリットルの溶液3を引き出し、後で使用するために水浴に事前に温めます。次いで組織を消化し、残りの溶液3を約11〜12分間心臓に浸透させた。溶液3で灌流の最初の2分後、消化が完了するまで再使用するために蠕動ポンプによって灌流液に灌流液をリサイクルする。
心臓が腫れ、わずかに青白くフラシッドに変わったら、歯付き鉗子を使って心筋をそっとつまみます。刻印が見える場合は、消化を終了し、装置から心臓を切り離します。動脈および心室筋細胞を分離するには、鉗子を使用して心室と心房を取り除き、それらを異なるペトリ皿に入れる。
その後、両方の料理に事前に温めたソリューション3を追加します。鈍い鉗子を使用して、組織を濁った質感にトリチュレートし、空気泡を導入することなく組織を穏やかに消化する。残りの酵素活性を阻止するために、ピペットを用いて濁った消化組織を溶液4に移し、次いで192倍G.で20秒間遠心分離機を上清を除去した後、溶液5で細胞沈降を再懸濁させる。
カルシウムパラドックスとカルシウム過負荷を避けるために、細胞懸濁液に1リットル当たり100ミリモルの合計50ミリリットルを徐々に添加することによって、カルシウムを段階的に再導入する。塩化カルシウムをすべて添加したら、パッチクランプ研究のためにタイロードの溶液中に細胞を保管します。カヌレーション深さは、心房とその付属物の灌流に関連付けられている。
カニューレ先端が上昇大オルタにある場合、両方の心房付属器が十分な心房灌流を示す膨張する。しかしながら、カニューレ先端が大動脈根にある場合、両方の心房付属器が拭き取られ、充血不十分を示す。上昇大動脈でのカヌリン酸によって分離された心房筋細胞は、カルシウム再導入の前後の大動脈根でのカヌリン酸によって単離されたものよりも生存率が高い。
対照的に、カルシウム再導入の前後の両方で、上昇大動脈または大動脈根のいずれかでカヌル化によって単離された心室筋細胞の生存率に差はなかった。単離心房および心室筋細胞におけるナトリウム電流の全細胞パッチクランプ記録、ならびに現在の密度は、単離された細胞の品質が電気生理学的実験の要件を満たしていることを確認する。大オルタをトランセクトする際には、結紮に十分な腺を保持するようにしてください。
それ以外の場合、カニューレは、結紮後に大動脈弁に浸透し得る。
概要
このプロトコルは、成体マウスから心房筋細胞と心室筋細胞を同時に分離するためのLangendorff法の改良法を説明しています。この方法は、電気生理学的研究のために分離した細胞の質を維持しながら、心房筋細胞の収率を向上させます。
主要な研究要素
科学の分野
- 心血管生理学
- 細胞生物学
- 電気生理学
背景
- Langendorff法は心臓灌流に広く使用されている技術です。
- 心房筋細胞と心室筋細胞を同時に分離することで、心臓機能に関するより良い洞察が得られます。
- 筋細胞の挙動を理解することは、心臓病を研究する上で重要です。
- 心房筋細胞の収率を向上させることは、正確な実験結果を得るために不可欠です。
研究目的
- マウスの心臓から心房筋細胞の収率を向上させること。
- 心房筋細胞と心室筋細胞の同時分離を可能にすること。
- 心臓病の根底にある細胞メカニズムを調査すること。
使用された方法
- 成体のオスC57BL/6マウスを心臓摘出のために安楽死させました。
- 逆行性大動脈カニューレ挿入を灌流のために行いました。
- 心臓は消化のための特定の溶液で灌流されました。
- 筋細胞は分離され、電気生理学的研究のために準備されました。
主要な結果
- 改良法で分離された心房筋細胞は、より高い生存率を示しました。
- 同時分離は心室筋細胞の質に影響を与えませんでした。
- 電気生理学的記録は、分離した細胞の実行可能性を確認しました。
- 最適なカニューレ挿入深さは、効果的な心房灌流にとって重要でした。
結論
- 改良されたLangendorff法は心房筋細胞の収率を向上させます。
- 同時分離は心臓生理学の研究能力を向上させます。
- このプロトコルは心臓病メカニズムのより良い理解を促進できます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Simultaneous isolation of atrial and ventricular myocytes using a modified Langendorff method addresses a critical bottleneck in cardiac target validation and mechanistic de-risking. This protocol enables high-quality, reproducible cell preparations essential for predictive electrophysiological assays and translational cardiac research. The approach supports robust early discovery and preclinical workflows by ensuring reliable access to both atrial and ventricular cell types from a single preparation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of atrial and ventricular mechanisms in disease-relevant systems.
- Supports functional target validation by providing viable myocytes for mechanistic studies.
- Facilitates predictive confidence in cardiac safety and efficacy assessments.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized, high-viability cardiomyocytes for downstream electrophysiological assays.
- Improves assay reproducibility by controlling for cell source and preparation conditions.
- Enables scalable preparation of both atrial and ventricular cells for compound screening.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cellular models with disease-relevant atrial and ventricular pathologies.
- Ensures continuity from early discovery through preclinical cardiac safety studies.
- Reduces biological risk by validating cell quality for patch clamp and functional assays.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical cardiac research, supporting workflows from hypothesis testing to lead identification and safety de-risking.
- Discovery Biology: Provides robust cellular substrates for mechanistic hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Supplies reproducible, quantitative readouts for electrophysiological assay development.
- Analytics: Enables direct measurement of sodium currents and cell viability for comparative studies.
- Translational Research: Bridges cellular findings to preclinical cardiac models by ensuring cell quality and relevance.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, reusable protocol for consistent cardiomyocyte isolation across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac research.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of cell isolation workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of cardiac programs.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in cardiac dissection and Langendorff perfusion.
- Needs access to specialized perfusion apparatus and patch clamp infrastructure.
- Demands rigorous cross-team standardization of cannulation and digestion steps.
- Adaptation may be needed for different mouse strains or cardiac disease models.
- Careful control of cannulation depth is critical for optimal atrial cell yield and viability.
