骨髄由来肥満細胞培養用結晶性ナノセルロース埋め込みアガロースバイオマテリアルインクの製造

このプロトコルは、複雑な3Dバイオプリンティング実験の前に、敏感な一次細胞および免疫細胞に対する潜在的な細胞毒性効果のための候補生体材料インクをスクリーニングするための簡単かつ迅速なアプローチを提供する。生体物質インク構築物上の免疫細胞のインキュベーション後、細胞は下流の細胞傷害性またはバイオマーカー分析を行うために穏やかな洗浄によって構築物から容易に取り出すことができる。このプロトコルは、移植を目的としたバイオプリント組織を原細胞および生体適合性生体材料インクから構築しなければならない組織工学に直接関連する。

まず、INKREDIBLE+3Dバイオプリンターにインストールするためのバイオインクカートリッジを用意します。まず、3ミリリットルの生体材料インクカートリッジから青色のエンドキャップを取り出し、滅菌22ゲージ円錐形バイオプリンティングノズルをバイオインクカートリッジのLuerロックエンドに貼り付けます。プリントヘッド1またはPH1用の空気圧供給チューブをカートリッジの反対側の端に接続し、取り付けられた円錐形バイオプリンティングノズルを取り付けたカートリッジをPH1の垂直スロットに挿入します。

次に、プリントヘッドの下に伸びる円錐形のバイオプリンティングノズルを使用して、カートリッジをPH1にしっかりと装着します。PH1のネジを指が締まるまで時計回りに締め、バイオインクカートリッジを所定の位置に固定します。3Dバイオプリンティングは、PH2を空のままにして実行できることに注意してください。

バイオプリンターの電源を入れ、USB 2.0ケーブルを介して3Dバイオプリンターに接続されたPCでバイオプリンターソフトウェアを起動します。ソフトウェアで、接続ボタンをクリックして、3Dバイオプリンターと同期します。3Dバイオプリンターのメインコントロールメニューの3つのオプションを観察してください。

まず、バイオプリントを準備します。次に、ユーティリティメニューです。そして第三に、ステータス画面。

[バイオプリントの準備] オプションを選択し、下にスクロールしてホーム軸オプションを選択します。XYZ軸のキャリブレーションが成功すると、プリントベッドの高さがわずかに下がり、プリントヘッドがプリントベッドの中心点の上に移動します。24ウェルプレートでのバイオプリンティングの開始点キャリブレーションを進めるには、密閉されたプラスチック包装から無菌の24ウェル培養プレートを取り除き、プレートの下側にあるウェルD1の中心点にドットを永久的なマーカーでマークします。

プレートカバーを取り外し、プリントベッドの左前角に位置するウェルD1のプリントベッドに24ウェル培養プレートを置きます。メインコントロールメニューでユーティリティメニューを選択し、軸を移動します。PH1の円錐形バイオプリンティングノズルがウェルD1の下にマークされたドットの上に直接あるまで、X軸とY軸に沿って1ミリメートルずつプリントヘッドを移動します。必要に応じて、印刷ヘッドを 0.1 ミリメートル単位で移動して、円錐形のバイオプリンティング ノズルの位置を細かく調整します。

3Dバイオプリンターのコントロールパネル画面に示されているように、ウェルD1の中心を直接上にしたときの円錐バイオプリントノズルのX座標とY座標を記録し、座標をマークダウンします。次に、プリントヘッド1に設置された円錐形バイオプリンティングノズルにウェルD1の底部がほぼ接触するまで、プリントベッドを1ミリメートルずつ上げます。必要に応じて、プリントベッドの動きを0.1ミリメートル単位で微調整します。

ユーティリティメニューから Z 軸キャリブレーションオプションを選択し、さらに「Z キャリブレーション」オプションを選択して確認します。メインメニューに戻り、バイオプリントの準備オプションを選択します。スクロールダウンして、[Z の調整]オプションを選択します。

24 ウェル プレートのジオメトリ コードまたは G コードを、正しい開始点座標で更新します。バイオプリントソフトウェアで提供されている24ウェルGコードファイルを開きます。1 行目の X 座標と Y 座標を、前の手順で取得した値で更新し、ファイルを新しい名前で保存します。

空気圧ポンプがINKREDIBLE+3Dバイオプリンターの後部空気取り口にしっかりと接続されていることを確認し、オンにします。INKREDIBLE+3Dバイオプリンターの右側にある前方制御ノブを引き出します。バイオプリンターの前面にあるPH1とPH2のデジタル圧力計が、それぞれゼロキロパスカル近くを読むことを確認してください。

PH1の左ゲージに示された圧力が12キロパスカルに達するまで、前方制御ノブを時計回りにゆっくりと回転させます。折り紙または防水シールフィルムを取り付けたカートリッジの印刷ノズルの下に、印刷ノズルに触れないように注意してください。3Dバイオプリンターのメインコントロールメニューから、バイオプリントの準備を選択します。

[PH1 を有効にする] に移動して選択します。バイオインクが印刷ノズルから押し出しを開始することに注意してください。必要に応じて、バイオインクが連続フィラメントに押し出されるまでコントロールノブを時計回りに回転させることで押出圧力を高め、新しい圧力設定を記録します。

[PH1 をオフにする] を選択すると、バイオインクの押し出しが停止します。押し出されたバイオインクを含むティッシュペーパーまたはフィルムをプリントベッドから取り出し、バイオプリンターのドアを閉めます。24ウェルプレート形式で直流ヒドロゲル基板の3Dバイオプリンティングを実行するには、メインコントロールメニューからユーティリティメニューを選択し、バイオプリンターソフトウェアがGコードファイルを印刷用に3Dバイオプリンターに送信できるようにするSDプリントを無効にします。

バイオプリンターソフトウェアのロードボタンをクリックし、更新された24ウェルプレートGコードファイルを選択します。ソフトウェアの右側のコントロールパネルで、印刷プレビュータブを選択し、プリントボタンをクリックして、Well D1でバイオプリントを開始します。直流構造のバイオプリンティングが完了したら、蓋で24ウェルプレートを覆い、クラスIIのバイオセーフティキャビネットに移動します。各直腸構造を滅菌50ミリモルクロライド溶液の2滴に浸し、室温で5分間インキュベートします。

各ウェルから慎重に塩化カルシウム溶液を吸引し、1XPBSの1ミリリットルに1回リンスして余分な塩化カルシウムを除去する。バイオプリントヒドロゲル構築物の脱水を防ぐために、骨髄由来肥満細胞が構築物に播種される準備が整うまで、新鮮な1X PBSで3Dバイオプリント直行構造を維持します。フローサイトメトリーで解析したBMMCsの前方および側散乱パラメータに基づいて、CNC濃度が最も高いヒドロゲル基板は、CNCアガロースD-マンニトールヒドロゲル基材の不在時に培養されたBMMCsと比較して、BMMCsの天然サイズまたは粒度を変化させなかったことを観察した。

BMMCsのヨウ化プロピジウムへの透過性のフロー細胞測定分析は、試験されたCNC濃度のいずれもBMMC生存率に悪影響を及ぼしていないことを実証した。CNCアガロース基質は、2.5%以上のCNC濃度でマスト細胞バイオマーカーの発現を増加させたが、これらの受容体の発現レベルは、CNCの濃度とは無関係であるという効果を示唆する2.5%と12.5%CNCの間で相対的に一貫したままであった。XTTアッセイは、3Dバイオプリントヒドロゲル足場で培養されたBMMCsの代謝活性が、すべての試験された時点で約100%で比較的一貫していることを実証した。

同様に、LDHリリースとPI染料除外アッセイは、BMMCsの生存率に大きな変化を明らかにしなかった。印刷ノズルゲージの選択、3Dバイオプリンターの軸のキャリブレーション、および押出圧力設定は、高品質の3D構造の再現性印刷を保証します。肥満細胞を取り出すことができる容易さは、彼らの細胞機能の任意の側面をさらに研究するために生物学的アッセイの広い範囲によって調査されることを可能にする。