Name: リンゴパルプでFluo-4/AMで細胞質Ca2+ を染色する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-11-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぼうリンゴ果肉細胞からのプロトプラスト分離とFluo-4/AMを用いた細胞質Ca2+イメージング法。この非侵襲的な手法は、果実の発育や品質管理におけるカルシウム動態の研究に有用です。

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この研究は、山東省農業品種改良プロジェクト(2019LZGC007)と山東省現代農業産業技術システム(SDAIT-06-05)の果樹イノベーションチームによって支援されました。

1. プロトプラスト抽出
<ol><li>基本溶液を調製:20 mM CaCl2、5mM 2-(Nモルフォリノ)エタネスルホン酸、および0.4 M Dソルビトール。 注:基本溶液のpHは、0.1 Mトリスバッファーで5.8に調整し、0.22 μmの水溶性フィルタを通して濾過し、4°Cで保存しました。</li>
	<li>酵素ソリューションを準備する:基本的なソリューションと0.3%(w/v)マセロザイムR-10と0.5%(w/v)セルラーゼR-10をミックス。</li>
	<li>0.5 mLの酵素溶液を1.5 mL遠心分離管に加えます。健康で熟したリンゴを選んでください。その後、パルプを10 x 5 x 1 mm3サイズにスライスします(図1A-1C)。</li>
	<li>リンゴの果実の果肉片を酵素溶液を含む1.5mL遠心分離チューブに入れ、チューブを閉じます(図1D)。</li>
	<li>28°Cで1時間インキュベートし、暗闇の中でシェーカーで70rpm/分で揺れます。</li>
	<li>パルプ部分を洗います。酵素溶液をすべて吸引し、0.5 mLの基本液を加えます。</li>
	<li>室温で2分間300×gで遠心分離機。</li>
	<li>プロトプラスト懸濁液を得るために、遠心分離管の底部から溶液を吸引する(図1E)。</li>
</ol>2. 低分子カルシウムイオン蛍光染色
<ol><li>Fluo-4/AM負荷溶液を2 mM Fluo-4/AM、20%F-127、10倍のリン酸緩衝生理食塩水(PBS:80 mM Na2HPO 4、1.36 M NaCI、20 mM KH2PO4、26mM KCI)で1:1:2の比率で調製します。</li>
	<li>1.5 mL遠心分離管に存在するプロトプラスト懸濁液の99 μLに、Fluo-4/AM負荷溶液を1 μL加えます。蛍光色素の最終濃度が5μMであることを確認し、溶液を混合し、チューブを閉じます。</li>
	<li>ラ3+処理:プロトプラスト懸濁液98 μL、1μLのラ3+、1μLのFluo-4/AMローディング溶液を1μL用意します。溶液を混ぜてチューブを閉じます。</li>
	<li>暗闇の中で37°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>プロトプラストを300xgで室温で2分間遠心して洗浄します。70 μLの溶液を吸引し、70 μLの基本溶液を追加します。</li>
	<li>プロトプラスト懸濁液を37°Cで30分間インキュベートし、完全に脱エステル化します。</li>
	<li>プロトプラスト懸濁液の15μLを吸引し、スライドに滴下します。</li>
	<li>蛍光顕微鏡下で観察する(補助図S1)。 注:3.45 μmピクセル解像度の3.2 MP(2048 x 1536)CMOSセンサーなど、高感度のカラーカメラを使用してください。</li>
	<li>イメージング用の GFP チャネルを選択します(20x)。明るさを 0.5 に設定します。 メモ:照明は、統合されたハードコーティングされたフィルタセットを備えた調整可能な強度LEDライトキューブです。Fluo-4/AMの励起波長は490nmです。</li>
</ol>3. プロトプラスト生存アッセイ
<ol><li>フルオレセインジアセテート(FDA)ストック溶液を調製する:最終濃度が1mg/mLになるまでFDAをアセトンに溶解する。</li>
	<li>1 μLのストック溶液と99 μLのアセトンでFDAの作業ソリューションを準備します。</li>
	<li>99 μLのプロトプラスト懸濁液に1 μLのFDA作業溶液を加えます。上下にピペットして溶液を混ぜ、チューブを閉じます。 注:FDAの最終濃度は100 μg/Lです。</li>
	<li>暗闇の中で5分間室温で汚す。</li>
	<li>スライドを準備し、蛍光顕微鏡で観察します。</li>
	<li>イメージング用の GFP チャネルを選択します (図 1F)。</li>
</ol>4. 画像解析
<ol><li>取得した画像を画像解析およびスプレッドシートソフトウェア(例えば、Image-Pro PlusおよびExcel 2010)を使用して分析します。</li>
	<li>プロトプラストから2つの垂直直径を選択して蛍光強度を計算する(補助図S2)。異なる治療の下ですべてのプロトプラストの蛍光強度を測定し測定した。最終処理には、写真編集ソフトを使用してください。</li>
</ol>5. 統計分析
<ol><li>統計ソフトウェアを使用して統計解析を実行する (補助図 S3)。データは平均±SDで提示されます。実験グループ間の違いを分析するために、学生の t-testを使用しました。</li>
</ol>

<ol><li>Hocking, B., Tyerman, S. D., Burton, R. A., Gilliham, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+calcium%3A+Transport+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Fruit calcium: Transport and physiology.</a> Frontiers in Plant Science. 7, 569(2016).</li>
<li>Li, J., Yang, H. -q, Yan, T. -l, Shu, H. -r <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+indole+butyric+acid+on+the+transportation+of+stored+calcium+in+Malus+hupehensis+rhed.+Seedling%5BTitle%5D)+AND+%22Agricultural+Sciences+in+China%22%5BJournal%5D)">Effect of indole butyric acid on the transportation of stored calcium in Malus hupehensis rhed. Seedling.</a> Agricultural Sciences in China. 5 (11), 834-838 (2006).</li>
<li>Gao, Q., Xiong, T., Li, X., Chen, W., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+and+calcium+sensors+in+fruit+development+and+ripening%5BTitle%5D)+AND+%22Scientia+Horticulturae%22%5BJournal%5D)">Calcium and calcium sensors in fruit development and ripening.</a> Scientia Horticulturae. 253, 412-421 (2019).</li>
<li>Barrett, D. M., Beaulieu, J. C., Shewfelt, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color%2C+flavor%2C+texture%2C+and+nutritional+quality+of+fresh-cut+fruits+and+vegetables%3A+desirable+levels%2C+instrumental+and+sensory+measurement%2C+and+the+effects+of+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Food+Science+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Color, flavor, texture, and nutritional quality of fresh-cut fruits and vegetables: desirable levels, instrumental and sensory measurement, and the effects of processing.</a> Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 50 (5), 369-389 (2010).</li>
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<li>Johnston, J., Hewett, E., Hertog, M. A. T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postharvest+softening+of+apple+%28Malus+domestica%29+fruit%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22New+Zealand+Journal+of+Experimental+Agriculture%22%5BJournal%5D)">Postharvest softening of apple (Malus domestica) fruit: A review.</a> New Zealand Journal of Experimental Agriculture. 30 (3), 145-160 (2002).</li>
<li>Demidchik, V., Shabala, S., Isayenkov, S., Cuin, T. A., Pottosin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+transport+across+plant+membranes%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Calcium transport across plant membranes: mechanisms and functions.</a> New Phytologist. 220 (1), 49-69 (2018).</li>
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<li>Kou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+CaCl2+dipping+and+pullulan+coating+on+the+development+of+brown+spot+on+%27Huangguan%27+pears+during+cold+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Postharvest+Biology+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Effects of CaCl2 dipping and pullulan coating on the development of brown spot on 'Huangguan' pears during cold storage.</a> Postharvest Biology and Technology. 99, 63-72 (2015).</li>
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<li>Yamane, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foliar+calcium+applications+for+controlling+fruit+disorders+and+storage+life+in+deciduous+fruit+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Japan+Agricultural+Research+Quarterly%22%5BJournal%5D)">Foliar calcium applications for controlling fruit disorders and storage life in deciduous fruit trees.</a> Japan Agricultural Research Quarterly. 48 (1), 29-33 (2014).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T. J., Walker, S., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca2%2B-sensitive+fluorescent+dyes+and+intracellular+Ca2%2B+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging.</a> CSH Protocols. 2013 (2), 83(2013).</li>
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<li>Qu, H., Xing, W., Wu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+inexpensive+method+of+loading+fluorescent+dye+into+pollen+tubes+and+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid and inexpensive method of loading fluorescent dye into pollen tubes and root hairs.</a> PLoS One. 11, 0152320(2016).</li>
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<li>Qiu, L., Wang, Y., Qu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loading+calcium+fluorescent+probes+into+protoplasts+to+detect+calcium+in+the+flesh+tissue+cells+of+Malus+domestica%5BTitle%5D)+AND+%22Horticulture+Research%22%5BJournal%5D)">Loading calcium fluorescent probes into protoplasts to detect calcium in the flesh tissue cells of Malus domestica.</a> Horticulture Research. 7, 91(2020).</li>
<li>Boyer, J., Liu, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apple+phytochemicals+and+their+health+benefits%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrition+Journal%22%5BJournal%5D)">Apple phytochemicals and their health benefits.</a> Nutrition Journal. 3 (1), 5(2004).</li>
<li>Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+intracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Measurement of intracellular calcium.</a> Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).</li>
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<li>Merritt, J. E., Mccarthy, S. A., Davies, M., Moores, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluo-3+to+measure+cytosolic+Ca2%2B+in+platelets+and+neutrophils.+Loading+cells+with+the+dye%2C+calibration+of+traces%2C+measurements+in+the+presence+of+plasma%2C+and+buffering+of+cytosolic+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+Journal%22%5BJournal%5D)">Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2.</a> Biochemical Journal. 269 (2), 513-519 (1990).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+Ca+content+and+distribution+in+two+Gesneriaceae+species+reveals+distinctive+mechanisms+to+cope+with+high+rhizospheric+soluble+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">A comparative study on Ca content and distribution in two Gesneriaceae species reveals distinctive mechanisms to cope with high rhizospheric soluble calcium.</a> Frontiers in Plant Science. 5 (5), 647(2014).</li>
<li>Zhang, W., Rengel, Z., Kuo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+intracellular+Ca2%2B+in+cells+of+intact+wheat+roots%3A+loading+of+acetoxymethyl+ester+of+Fluo-3+under+low+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature.</a> Plant Journal. 15 (1), 147-151 (1998).</li>
<li>Qu, H., Jiang, X., Shi, Z., Liu, L., Zhang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+loading+ester+fluorescent+Ca2%2B+and+pH+indicators+into+pollen+of+Pyrus+pyrifolia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Research%22%5BJournal%5D)">Fast loading ester fluorescent Ca2+ and pH indicators into pollen of Pyrus pyrifolia.</a> Journal of Plant Research. 125 (1), 185-195 (2012).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+actin+filaments+induces+mitochondrial+Ca2%2B+release+to+the+cytoplasm+and+%5BCa2%2B%5Dc+changes+in+Arabidopsis.+root+hairs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">Disruption of actin filaments induces mitochondrial Ca2+ release to the cytoplasm and [Ca2+]c changes in Arabidopsis. root hairs.</a> BMC Plant Biology. 10, 53(2010).</li>
<li>Fujimori, T., Jencks, W. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lanthanum+inhibits+steady-state+turnover+of+the+sarcoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+by+replacing+magnesium+as+the+catalytic+ion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Lanthanum inhibits steady-state turnover of the sarcoplasmic reticulum calcium ATPase by replacing magnesium as the catalytic ion.</a> Journal of Biological Chemistry. 265 (27), 16262-16270 (1990).</li>
</ol>

著者らは、この記事の内容と利益相反はないと宣言している。

本研究では、生き生きとしたプロトプラストを酵素加水分解により得た。この方法には新鮮なリンゴが必要であることに注意してください。本プロトコルは、研究研究で使用するために、果肉から多数のプロトプラストを迅速に分離することを可能にする。この方法の適用可能性は「富士」に限定されません。「ドゥーナン」と「ハニークリスプ」のリンゴパルプのプロトプラストも同じプロトコルを介して抽出することができます(補助図S4)。酵素溶解後のプロトプラスト溶液には細胞デブリが含まれており、これは以前の方法に比べて幾分改善された。必須の細胞材料として、リンゴパルププロトプラストは、細胞タンパク質発現技術、単細胞シーケンシング、およびその他の研究に使用することができます。
植物細胞30における化学蛍光試薬染色に関する多くの方法がある。例えば、Fluo-3/AMは、低温度(4°C)でロードされ、ルート先端セル31に入る。Fluo-3/AMは、花粉管32<...

Ca2+は植物のシグナル伝達と代謝に重要な役割を果たす1,2 .また、それは、貯蔵中の硬度、糖度、および生理障害に対する感受性を含む果物品質形質3、4を調節する5、6。細胞質Ca2+は、シグナル伝達に重要な役割を果たし、植物の成長と開発を調節する7.細胞カルシウム恒常性の乱れは、リンゴ8、梨9の褐色スポット病、トマト10の臍帯病に苦いピットを誘発し、果実の質に影響を及ぼし、深刻な経済的損失を引き起こす3、11。カルシウムイメージングは十分な空間的および時間的分解能を有し、生細胞12,13におけるCa2+ダイナミクスを観察するための重要な方法である。
現在、生細胞における細胞内カルシウムイメージングには主に2つの方法がある:一方は化学小分子蛍光プローブ14を採用し、もう1つは遺伝子コードセンサ(GECI)15,16である。果樹における安定したトランスジェニックシステムの確立と長い果実の開発の難しさを考えると、GECISはフルーツCa2+蛍光イメージングには適していません。
Fluo-4/AMのような低分子蛍光プローブは特に利点があります:そのAMエステル形態(細胞透過性アセトキシメチルエステル誘導体)は、トランスフェクションを必要とせずに生細胞に容易にバルクロードすることができ、柔軟で迅速で非細胞毒性の17になります。Fluo-4/AMは、ピルス・ピリフォリア18とペチュニア、19の花粉管に正常にロードすることができ、また、アビニズナプシス21のガードセル20と根髪に入れることができました。
現在のところ、パルプ細胞22のカルシウム蛍光染色に関する報告はほとんどない。重要なミネラル成分として、リンゴなどの樹果の成長と品質管理においてカルシウムが重要な役割を果たします。リンゴの木は世界的に重要な経済種として認識されており、リンゴは健康的な食品23と考えられています。本研究では、リンゴ果実パルプから酵素加水分解を介して生存可能なプロトプラストを得てから、細胞質に低分子蛍光試薬をロードしてCa2+を検出した。

<table><tbody><tr><td>10&times; リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Solarbio</td><td>P1022</td><td>PBS(リン酸緩衝液)は、比較的安定したイオン環境とpH緩衝能力を提供できるリン酸緩衝液です。生物学で分子クローニングや細胞培養によく使用される緩衝塩溶液です。pHは7.4です。</td></tr><tr><td>2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸</td><td>Solarbio</td><td>M8010</td><td>生物学的緩衝剤</td></tr><tr><td>CaCl2&middot;2H2O</td><td>Solarbio</td><td>C8370</td><td>塩化カルシウム二水和物は、主に粒状の白色または灰色の化学物質です。</td></tr><tr><td>セルラーゼR-10</td><td>ヤクルト本社</td><td>MX7352</td><td>植物細胞壁を劣化させます。</td></tr><tr><td>D-ソルビトール</td><td>ソーラーバイオ</td><td>S8090</td><td>保湿性に優れ、乾燥を防ぎ、砂糖や塩分などの結晶化を防ぎます。</td></tr><tr><td>F-127</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>P6867</td><td>プルロニック F-127は、非イオン性の界面活性剤ポリオール(分子量約12500ダルトン)で、生理剤中の水不溶性染料やその他の材料の溶解を促進するのに有益であることがわかっています。</td></tr><tr><td>FDA</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F1303</td><td>FDAは、蛍光を活性化するために必要な酵素活性と、蛍光産物の細胞内保持に必要な細胞膜の完全性の両方を測定する生存率プローブとして機能する細胞透過性エステラーゼ基質です。&nbsp;</td></tr><tr><td>Fluo-4/AM</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>F14201</td><td>緑色蛍光カルシウムインジケーターFluo-4/AMは、カルシウムインジケーターFluo-3/AMの改良版です。Fluo-4/AMは、同じ濃度でより速くロードされ、より明るくなります。488 nmのアルゴンイオンレーザーで十分に励起できます。</td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>Thermo Fisher</td><td>EVOS Auto 2</td><td>蛍光画像を観察します。</td></tr><tr><td>マセロチーム R-10</td><td>ヤクルト本社</td><td>MX7351</td><td>植物組織を分解して単一細胞を分離します。</td></tr><tr><td>トリス</td><td>ソーラーバイオ</td><td>T8060</td><td>生化学および分子生物学実験における緩衝液の調製に広く使用されています。</td></tr></tbody></table>

リンゴパルプでfluo-4/amで細胞質ca2+ を染色する

Staining the Cytoplasmic Ca2+ with Fluo-4/AM in Apple Pulp

サイトソリックCa2+は、植物開発において重要な役割を果たしています。カルシウムイメージングは、細胞質におけるCa2+の動的変化を検出する最も汎用性の高い方法です。本研究では、酵素加水分解によりパルプ細胞の生き生き可能なプロトプラストを得た。単離したプロトプラストを37°Cで30分間、低分子蛍光試薬(Fluo-4/AM)でインキュベートした。 蛍光プローブは細胞細胞系Ca2+の染色に成功したが、液胞に蓄積しなかった。Ca3+、Ca2+チャネルブロッカーは、細胞質蛍光強度を低下した。これらの結果は、Fluo-4/AMが果実肉における細胞質Ca2+の変化を検出するために使用できることを示唆している。要約すると、果実の果実の果体細胞からプロトプラストを効果的に単離し、小分子カルシウム蛍光試薬をパルプ細胞の細胞質に負荷させることでCa2+を検出する方法を提示する。

上述したプロトコルに従って、酵素法を用いて、パルプから生き生き可能なプロトプラストを得た(図1)。一部のプロトプラストは空胞を持っていましたが、他のプロトプラストは持っていませんでした。プロトプラストは、Ca2+ 蛍光指標がそれらにロードされなかったときに蛍光を示さなかった。Fluo-4/AMがプロトプラストに積み込まれると、細胞質は蛍光を発するが、液胞は含まれなかった(図2)。この結果は、Fluo-4/AMが細胞質にCa2+ を染色し、区画化が24を観察されなくなったことを示した。プロトプラストをFDAで5分間染色し、細胞質蛍光を示した。これは、高温(37°C)がプロトプラストの生存率に影響を与えないことを示した。
La3+は、Fluo-4/AM がプロトプラストにロードされたときに、Ca2+チャネル<sup class="xr...

リンゴパルプ細胞の単離プロトプラストは、細胞質Ca2+ 濃度を検出するためにカルシウム蛍光試薬を装填した。

リンゴパルプでFluo-4/AMで細胞質Ca2+ を染色する

Cytosolic Ca2+ plays a key role in plant development. Calcium imaging is the most versatile method to detect dynamic changes in Ca2+ in the cytoplasm. In ...

重要なミネラル要素として、カルシウムはリンゴなどの樹木果実の成長と品質管理において重要な役割を果たし、貯蔵中の硬度、糖度、貯蔵期間、および生理学的障害を調節することができます。カルシウムイメージングは、細胞質におけるカルシウムイオンの動的変化を検出する最も西洋的な方法です。Fluo-4/AMなどの低分子蛍光指標はカルシウムイオン特異的選択性を有し、フレキシブルで迅速で非細胞毒性のエステル化インキュベーションにより非侵襲的にロードすることができます。このプロトコルは、植物プロトプラストに小分子化学蛍光試薬fluo-4/AMをロードする方法を導入する。プロトプラスト抽出 1.5 ミリリットル遠心分離チューブに 0.5 ミリリットルの酵素溶液を加えます。健康で熟したリンゴを選び、パルプを10倍の5倍の立方ミリメートルサイズにスライスします。パルプピースを酵素溶液に入れ、チューブを閉じます。1時間28度でチューブをインキュベート。暗闇の中で70 rpmでシャック。その後、パルプ部分を洗浄し、酵素溶液をすべて吸引し、0.5ミリリットルの塩基性溶液を加えます。2分間300gの速度で遠心分離機。プロトプラスト懸濁液は底液を吸引することにより得ることができる。低分子化学蛍光試薬染色。fluo-4/AM負荷溶液を2ミリモルフルオ-4/AM、20%ethyl127、10Xリン酸緩衝生理食塩水を1~1~2の比率で調製します。99マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液にフルー4/AMの1マイクロリットルの負荷溶液を加えます。蛍光色素の最終濃度は5マイクロモルです。溶液を混ぜてからチューブを閉じます。同時に、ランタンは、小分子化学蛍光剤のカルシウムまたは独自性を鉄。1マイクロリットルまたは10マイクロリットル以上のランタン鉄を加え、フルオロ4/AMのマイクロリットル負荷溶液を98マイクロリットルのプロトプラストサスペンションに加えます。ランタン鉄の最終濃度は100マイクロモルである。溶液を混ぜてからチューブを閉じます。暗い中で30分間37度でインキュベートします。その後、300Gの速度で2分間遠心分離する。17マイクロリットル溶液に吸気し、17マイクロリットルの基本的な溶液を加える。その後30分間37度でプロトプラスト懸濁液をインキュベートし、50マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液を吸引し、スライドに滴下する。蛍光顕微鏡で観察します。20倍の倍率とGFPチャンネルを選択して観察します。明るさを 0.5 に均一に調整します。この提案された方法の重要なステップは、プロトプラストの汚れを洗浄し、30分間インキュベートすることです。十分な洗浄は観察中に蛍光に過剰な後ろを引き起こし、インキュベーションはより良い負荷または細胞質へのプローブを可能にする。プロトプラスト Viability アッセイ 37 度で 30 分間インキュベートした後、99 マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液を取ります。FD溶液に1mlを加えて、プロトプラスト懸濁液にします。溶液を数回上下にピペットして混ぜ、チューブを閉じます。暗い中で5分間室温に滞在します。スライドを準備し、GFPチャネルで蛍光顕微鏡でそれらを観察します。私たちはあなたに結果を提示する図1に続きます。パルプからプロトプラストを得る酵素的な方法を使用します。一部のプロトプラストは液胞を持っていましたが、他のプロトプラストは持っていませんでした。プロトプラストをFDで5分間染色し、細胞質の中の花を示し、高温、37度が生存率またはプロトプラスト図2に影響を与えないことを示す。プロトプラストは、カルシウム鉄蛍光指標の1つに蛍光を示さなかったか、それらにロードされていない。fluo-4/AMよりも原虫に積み込まれたが、細胞は蛍光となった。カルシウムチャネルを効果的に遮断するランタン鉄は、細胞膜をプロトプラストフルオ-4/AM負荷に添加した。100マイクロモルランタン鉄の最終濃度では、カルシウム蛍光強度を大幅に減少させます。この結果は、fluo-4/AMが効果的に細胞芽球のカルシウム鉄に留まり、カルシウム鉄含有量の動的変化を示していることをさらに実証した。図3 Fluo-4/AMの結果は、ランタン鉄を添加したIMH承認6.0ソフトウェアフルオ4/AM染色を用いて分析し、細胞質カルシウム鉄の蛍光値を有意に低下させた。本ビデオでは、全てのプロトプラストを酵素加水分解により得た。蛍光プローブを37度でプロトプラストに積み込むことに成功しました。さらに、この方法はプロトプラストの生存率に影響を与えなかった。要約すると、ここで説明する方法は種類の詳細です。リンゴ果肉細胞における細胞質カルシウムイオンの動的変化により、カルシウム関連研究のさらなる目的のために10等しい支持を提供する。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

劣化とリサイクルのための酵母の液胞の酸性内腔に細胞小器官の配信を監視するための堅牢なアプローチが説明されています。方法は、遺伝的に符号化されたデュアルエミッション蛍光のpHバイオセンサー、及び蛍光顕微鏡を使用して、個々の細胞の可視化とターゲットの細胞小器官の特定のラベルに依存しています。...

酵母でMitophagyを監視するための蛍光顕微鏡アッセイサッカロマイセスセレビシエ

神経回路網の開発の自発的な活動は、カルシウム感受性インジケータ染料のAM...

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Calcofluor白色染色:双子葉植物の茎切片の細胞壁におけるセルロース沈着物のUV誘起蛍光可視化のための簡単な方法

私たちは、機能的な神経末端での画像シナプス小胞のリサイクルへのスチリルのFM色素の使用を記載している。このプロトコルは、誘発するだけでなく、自発的な、ミニチュアシナプス活動にも適用することができる。プロトコルは、効果的に評価することができシナプス様々なイベントが展開されます。...

誘発、自発的、およびミニチュアシナプス活動中に、FM色素を用いたシナプス小胞のリサイクルの検討

植物細胞壁の組成は組織タイプによって異なり、リグニン、セルロース、ヘミセルロース、ペクチンを含むことができます。細胞種レベルでの違いを可視化するために、さまざまな染色技術が開発されてきました。この論文は、一般的に使用される細胞壁染色技術をまとめたものです。...

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ここで説明する蛍光に基づくカルシウム動員アッセイは、オーファンGタンパク質共役受容体（GPCR）の機能的に活性化するリガンド（単数または複数）の同定のための培地スループット逆薬理スクリーニングシステムである。...

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FRETベースの共焦点イメージングを使用した培養平滑筋細胞の小胞体内カルシウム変動の測定

ミトコンドリアは、それらが細胞内の細胞質ゾルのCa 2+シグナル伝達を形成することができ、カルシウム（Ca 2+）隔離する彼らの内膜（ΔΨm）を横切って電気化学ポテンシャルを利用することができます。我々は、同時に、蛍光色素、共焦点顕微鏡を使用して、生細胞中のミトコンドリアの Ca 2+取り込みおよびΔΨmを測定するための方法を記載します。...

蛍光顕微鏡による生細胞内のミトコンドリアのカルシウムとミトコンドリア膜電位の同時測定

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全体マウント クリアとシロイヌナズナの花器官および Siliques の染色

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ここでは、蛍光タンパク質の安定性を維持しつつ植物組織を透明にする方法について説明する。この技術は、物理的な切片化なしに、クリアされた植物組織の深いイメージングを容易にする。...

蛍光イメージングのための植物組織の光学的クリアリング

学ぼうリンゴ果肉細胞からのプロトプラスト分離とFluo-4/AMを用いた細胞質Ca2+イメージング法。この非侵襲的な手法は、果実の発育や品質管理におけるカルシウム動態の研究に有用です。

リンゴパルプでFluo-4/AMで細胞質^Ca2+ を染色する

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