リンゴパルプでFluo-4/AMで細胞質Ca2+ を染色する
2021年11月6日
リンゴパルプ細胞の単離プロトプラストは、細胞質Ca2+ 濃度を検出するためにカルシウム蛍光試薬を装填した。
重要なミネラル要素として、カルシウムはリンゴなどの樹木果実の成長と品質管理において重要な役割を果たし、貯蔵中の硬度、糖度、貯蔵期間、および生理学的障害を調節することができます。カルシウムイメージングは、細胞質におけるカルシウムイオンの動的変化を検出する最も西洋的な方法です。Fluo-4/AMなどの低分子蛍光指標はカルシウムイオン特異的選択性を有し、フレキシブルで迅速で非細胞毒性のエステル化インキュベーションにより非侵襲的にロードすることができます。
このプロトコルは、植物プロトプラストに小分子化学蛍光試薬fluo-4/AMをロードする方法を導入する。プロトプラスト抽出 1.5 ミリリットル遠心分離チューブに 0.5 ミリリットルの酵素溶液を加えます。健康で熟したリンゴを選び、パルプを10倍の5倍の立方ミリメートルサイズにスライスします。
パルプピースを酵素溶液に入れ、チューブを閉じます。1時間28度でチューブをインキュベート。暗闇の中で70 rpmでシャック。
その後、パルプ部分を洗浄し、酵素溶液をすべて吸引し、0.5ミリリットルの塩基性溶液を加えます。2分間300gの速度で遠心分離機。プロトプラスト懸濁液は底液を吸引することにより得ることができる。
低分子化学蛍光試薬染色。fluo-4/AM負荷溶液を2ミリモルフルオ-4/AM、20%ethyl127、10Xリン酸緩衝生理食塩水を1~1~2の比率で調製します。99マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液にフルー4/AMの1マイクロリットルの負荷溶液を加えます。
蛍光色素の最終濃度は5マイクロモルです。溶液を混ぜてからチューブを閉じます。同時に、ランタンは、小分子化学蛍光剤のカルシウムまたは独自性を鉄。
1マイクロリットルまたは10マイクロリットル以上のランタン鉄を加え、フルオロ4/AMのマイクロリットル負荷溶液を98マイクロリットルのプロトプラストサスペンションに加えます。ランタン鉄の最終濃度は100マイクロモルである。溶液を混ぜてからチューブを閉じます。
暗い中で30分間37度でインキュベートします。その後、300Gの速度で2分間遠心分離する。17マイクロリットル溶液に吸気し、17マイクロリットルの基本的な溶液を加える。
その後30分間37度でプロトプラスト懸濁液をインキュベートし、50マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液を吸引し、スライドに滴下する。蛍光顕微鏡で観察します。20倍の倍率とGFPチャンネルを選択して観察します。
明るさを 0.5 に均一に調整します。この提案された方法の重要なステップは、プロトプラストの汚れを洗浄し、30分間インキュベートすることです。十分な洗浄は観察中に蛍光に過剰な後ろを引き起こし、インキュベーションはより良い負荷または細胞質へのプローブを可能にする。
プロトプラスト Viability アッセイ 37 度で 30 分間インキュベートした後、99 マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液を取ります。FD溶液に1mlを加えて、プロトプラスト懸濁液にします。溶液を数回上下にピペットして混ぜ、チューブを閉じます。
暗い中で5分間室温に滞在します。スライドを準備し、GFPチャネルで蛍光顕微鏡でそれらを観察します。私たちはあなたに結果を提示する図1に続きます。
パルプからプロトプラストを得る酵素的な方法を使用します。一部のプロトプラストは液胞を持っていましたが、他のプロトプラストは持っていませんでした。プロトプラストをFDで5分間染色し、細胞質の中の花を示し、高温、37度が生存率またはプロトプラスト図2に影響を与えないことを示す。
プロトプラストは、カルシウム鉄蛍光指標の1つに蛍光を示さなかったか、それらにロードされていない。fluo-4/AMよりも原虫に積み込まれたが、細胞は蛍光となった。カルシウムチャネルを効果的に遮断するランタン鉄は、細胞膜をプロトプラストフルオ-4/AM負荷に添加した。
100マイクロモルランタン鉄の最終濃度では、カルシウム蛍光強度を大幅に減少させます。この結果は、fluo-4/AMが効果的に細胞芽球のカルシウム鉄に留まり、カルシウム鉄含有量の動的変化を示していることをさらに実証した。図3 Fluo-4/AMの結果は、ランタン鉄を添加したIMH承認6.0ソフトウェアフルオ4/AM染色を用いて分析し、細胞質カルシウム鉄の蛍光値を有意に低下させた。
本ビデオでは、全てのプロトプラストを酵素加水分解により得た。蛍光プローブを37度でプロトプラストに積み込むことに成功しました。さらに、この方法はプロトプラストの生存率に影響を与えなかった。
要約すると、ここで説明する方法は種類の詳細です。リンゴ果肉細胞における細胞質カルシウムイオンの動的変化により、カルシウム関連研究のさらなる目的のために10等しい支持を提供する。
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概要
本記事では、リンゴの果肉細胞から生存可能なプロトプラストを単離し、低分子蛍光指示薬Fluo-4/AMを用いて細胞質Ca2+ダイナミクスを検出するためのプロトコルを提示します。この手法により、植物細胞における非侵襲的で迅速かつ効果的なカルシウムイメージングが可能となり、果実の発達や品質管理におけるカルシウムの役割を研究するための有用なツールとなります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 植物生理学
- 細胞生物学
- 蛍光イメージング
背景
- カルシウムは、植物の成長、果実の品質、および貯蔵特性にとって不可欠です。
- 細胞質Ca2+は、リンゴなどの果実における様々な生理学的プロセスを調節しています。
- カルシウムイメージングにより、細胞質Ca2+濃度の動的な変化を検出することが可能です。
- Fluo-4/AMのような低分子蛍光インジケーターは、生細胞内のCa2+を特異的かつ非侵襲的に検出することを可能にします。
研究目的
- リンゴ果肉細胞から生存可能なプロトプラストを単離するためのプロトコルを開発する。
- Fluo-4/AMを用いて、細胞質Ca2+の効果的なローディングおよびイメージングを実証する。
- 本手法の特異性と細胞生存率への影響を検証する。
使用した手法
- リンゴの果肉組織からプロトプラストを単離するための酵素消化。
- プロトプラストをFluo-4/AMとともに37 °Cで30分間インキュベート。
- プローブの特異性を検証するためのCa2+チャネル遮断剤としてのLa3+（ランタンイオン）の使用。
- Ca2+分布を観察するための蛍光顕微鏡観察（GFPチャネル、20倍率）。
- 処理後のプロトプラストの生存率を確認するためのFD染色による生存率アッセイ。
主な結果
- 酵素消化を用いることで、リンゴ果肉から生存可能なプロトプラストを正常に単離することができた。
- Fluo-4/AMは液胞に蓄積することなく、細胞質のCa2+を選択的に染色した。
- La3+の投与により細胞質の蛍光が著しく減少したことから、プローブのCa2+に対する特異性が確認された。
- FD染色で示されたように、本プロトコルはプロトプラストの生存能を損なわなかった。
結論
- 記述された方法により、果実果肉プロトプラストの効果的な単離およびカルシウムイメージングが可能になります。
- Fluo-4/AMは、植物細胞における細胞質Ca2+の動的な変化を検出するための信頼性の高いプローブです。
- 本プロトコルは、果実の発達および貯蔵におけるカルシウム関連プロセスのさらなる研究を支援します。
よくある質問
産業上の重要性
植物プロトプラストにおける細胞質Ca2+の定量イメージングにより、果実の発達および品質管理に関連するカルシウムシグナリング経路の精密な解析が可能になります。Fluo-4/AMを用いることで、動的なCa2+変化を測定するための非侵襲的かつ再現可能なアプローチが提供され、植物ベースのバイオプロダクトパイプラインにおける早期発見とメカニズムのリスク低減が促進されます。この能力は、農業バイオテクノロジーにおけるトランスレーショナルリサーチおよびポートフォリオの推進に向けた予測の信頼性を高めます。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 単離した植物細胞における細胞質Ca2+動態の直接測定を可能にします。
- カルシウムシグナリングが機能的ターゲットであることを検証することで、メカニズム的なリスク低減を支援します。
- 果実品質の決定要因に関する仮説主導の研究を促進します。
- 植物生理学研究における経路解明のためのプラットフォームを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- Ca2+レベルの標準化された定量的な蛍光読み取りを提供します。
- 検証済みのプロトプラスト分離および染色プロトコルにより、再現性を確保します。
- カルシウムシグナリングに影響を与える化合物や遺伝学的スクリーニングのための、拡張可能なアッセイ開発を可能にします。
- 植物系におけるチャネル遮断薬およびモジュレーターの信頼性の高い評価をサポートします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 果実の品質および貯蔵特性に関するトランスレーショナル・バイオマーカー戦略と整合します。
- 作物改良プログラムにおいて、細胞レベルでの発見から前臨床検証までの継続性を提供します。
- プローブの特異性と細胞生存率を確認することで、生物学的リスクを低減します。
- 下流の形質選択および最適化における予測価値を高めます。
パイプラインおよびワークフローの統合
このカルシウムイメージングプロトコルは、植物の形質開発および品質評価における、発見から前臨床段階に至る一連の流れに統合されます。
- 探索生物学： 果実細胞におけるカルシウム調節プロセスの仮説検証およびパスウェイ解析を支援します。
- スクリーニング： 比較研究やスクリーニングキャンペーンに適した、再現性のある定量的な蛍光出力を提供します。
- 分析： Ca2+変調およびプローブ特異性の統計分析のための測定可能なリードアウトを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： 細胞レベルでの知見を、農業バイオテクノロジーにおける前臨床的な形質検証へとつなげます。
- エンタープライズ再利用： 多様な植物モデルや研究プログラムにわたるカルシウムイメージングのための、再利用可能なプラットフォームを構築します。
運用の影響および企業への影響
- 科学的価値：カルシウムシグナリング研究における予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用的価値：植物細胞分析のための、標準化され、拡張可能で、非細胞毒性のプロトコルを提供する。
- 戦略的価値：形質開発および品質管理イニシアチブにおける、go/no-go判断（実施可否の決定）を改善する。
- ポートフォリオへの影響：作物改良パイプラインにおける標的および形質の、リスク調整後の優先順位付けを可能にする。
実施上の検討事項
- 植物細胞の単離および蛍光顕微鏡に関する専門知識が必要です。
- 酵素消化試薬および蛍光イメージング設備の利用環境が必要です。
- プロトプラストの調製および染色のプロトコルについて、チーム間での標準化が求められます。
- 細胞型や種に応じたプロトコルの最適化を行うことで、他の植物組織にも適応可能です。
- 信頼性の高いデータ解釈には、プローブの特異性と生存率の検証が不可欠です。
