Name: メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: 学ぶ超高周波超音波イメージングによるBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルでのリンパ節容積測定法。非侵襲的に転移性メラノーマの進行を縦断的にモニタリングし、薬理学的治療効果を評価するための強力な手法です。

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著者らは、動物の処置に関する彼女の支援について、S. Burchielli(FTGM、Pisa)に感謝したい。この作業は、LPへのISPRO-Istituto per lo Studio la Prevenzione e la Rete Oncologicaの機関資金によって支援されました。MFAG #17095 AIRC-Associazione Italiana Ricerca sul Cancro が LP に授与。

ここで説明するすべての方法は、イタリア保健省(動物プロトコル#754/2015-PRおよび#684/2018-PR)によって承認されています。
1. メラノーマ誘発
注:6週齢のTyr::CreER+、BrafCA/+、Ptenlox/lox マウス[B6.Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ(Braf/Pten)]を本研究に使用した(材料表参照)。
<ol><li>前述のように、背中上部の剃毛した皮膚に3μLの5mM 4-HTを3日間連続して塗布することにより、マウスを4-ヒドロキシタモキシフェン(4-HT)で治療する11、16、17。 注:これにより、Cre酵素が活性化され、wt BrafからBrafV600Eへの切り替えとPtenの損失が発生します。これらの2つのヒットは、メラノーマ形成を誘発するのに十分である。</li>
	<li>原発性腫瘍が2〜3週間で皮膚塗装部位に発症し、4週間で50〜100mm3の体積に達することを観察する。また、この時点で他の皮膚部位、リンパ節、肺への転移を観察した(t0)。</li>
	<li>ノギスを使用して原発腫瘍および皮下転移の体積を測定し、超音波イメージングを使用して鼠径リンパ節の体積を測定する。これらの測定を1週間後(t1、皮膚塗装後5週間後)および2週間後(t2、皮膚塗装後6週間後)に繰り返す。</li>
	<li>最後の時点で、ガス状のセボランを過剰摂取してマウスを安楽死させる。</li>
	<li>原発性腫瘍およびリンパ節を目視検査によって分析し、次いで、in16で報告されたように、組織学的研究のためにそれらを切除する。</li>
</ol>2. 撮影手順
<ol><li>マウスをガス麻酔用の誘導チャンバーに入れ、動物が完全に麻酔されるまで純酸素中の3%イソフルランを供給する。足のピンチに対する反応の欠如によって麻酔の深さを確認する。</li>
	<li>動物を加熱したボード(UHFUSイメージングステーションの構成部分)に移し、動物を仰臥位に保ちます。ワセリンで潤滑された直腸プローブを使用して体温を測定します。ボード温度を調整して、マウスの体温を生理学的範囲(36 ± 1°C)に維持します。</li>
	<li>麻酔中の乾燥を防ぐために獣医軟膏でマウスの目を湿らせます。麻薬性ガス(純酸素中の1.5%イソフルラン)をマウスの鼻マスクを通して供給する。イソフルランの割合を調整して、麻酔の正しい深さを維持します。</li>
	<li>前足と後足を導電性ペーストでコーティングし、ボードに埋め込まれたECGプレート電極にテープで貼り付けます。生理学的パラメータ(心拍数、呼吸信号、深部体温)が正しく取得され、表示されていることを確認してください。</li>
	<li>脱毛剤を塗布して両方の鼠径部から脱毛し、音響結合媒体でそれらをコーティングする。</li>
	<li>UHFUSリニアプローブ(40MHzの中心周波数)をUHFUSイメージングステーションに埋め込まれた特殊な3Dモータにクランプし、プローブの自動的かつ段階的な移動を可能にします。</li>
	<li>超音波プローブの位置を適切に向き、調整して鼠径リンパ節の短軸画像(左/右)を取得し、関心領域を焦点ゾーンに配置します。</li>
	<li>鼠径リンパ節の全体積を、前述のように、一連の2D Bモード画像としてスキャンします18。マイクロメートルスケールのステップサイズでトランスデューサを直線移動させることによりリンパ節の複数のレベルで画像を取得し、自動的に呼吸および心臓依存性シネループの観点から3Dデータを生成する。</li>
	<li>次のパラメータで画像記録を設定します:スキャン距離範囲を2〜5mm(リンパ節のサイズによって異なります)。ステップサイズは44μmで、結果は46〜114スキャンステップ/リンパ節スライス、取得時間は動物あたり1〜3分です。取得した画像を生フォーマット(DICOM)でデジタル保存し、オフライン分析をさらに進めます。</li>
	<li>イメージングセッションの最後に、ガス麻酔を中止し、動物が胸骨リカンブルで加熱ボード上で回復するのを許します。それが臥位を維持するのに十分な意識を取り戻すまで動物の世話をしてください。</li>
</ol>3. 超音波画像の後処理
<ol><li>超音波画像の後処理のためのソフトウェアプラットフォームで左右の鼠径リンパ節のDICOM 3D画像のデータセットを開きます。</li>
	<li>セグメンテーション：<ol>
<li>「マルチスライス方法」を選択すると、3D 取得中にキャプチャされた各画像に対応するすべてのフレームの現在のフレームとサムネイルの両方が視覚化されます。</li>
		<li>最初のフレームのサムネールを選択して、輪郭ビューに読み込みます。輪郭ビューで、マウスを左クリックしてリンパ節の境界に沿ってポイントをドロップします。必要なポイント数(範囲 10 ~ 15)を設定したら、右クリックして輪郭を完成させます。</li>
		<li>最初の輪郭が完成したら、サムネイルビューを使用して、輪郭を描く次の画像を選択します。必要に応じて、輪郭間の複数の画像(平均3フレーム)をスキップして、各3Dボリュームに必要な手動トレースの数を減らします。 注:超音波画像後処理用のソフトウェアプラットフォームは、手動トレース間の輪郭を自動的に生成し、それによって分析時間を短縮します。</li>
		<li>ボリューム全体の輪郭が描かれるまで、このプロセスを繰り返します。完了したら、[ 完了]をクリックします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3Dワイヤーフレームの生成と体積測定:<ol>
<li>3Dモードウィンドウワークスペースで、画像表示領域の下にある体積測定アイコンをクリックして、サーフェスビューをアクティブにします。 メモ: サーフェスビューは、ユーザーが生成したボリュームを取得したイメージにマップするコンパイルビューを作成します。サーフェスビューは、任意の位置に回転させることができます。</li>
		<li>立方体ビューの左下隅にリストされている体積測定値を書き留めます。 注:セグメンテーションと3Dボリューム生成は、カスタム開発のソフトウェアおよび/または一般的な画像処理用の自由に入手可能な/商用ソフトウェアを使用して取得することもできます。手動セグメンテーションから始めて、ソフトウェアはリンパ節輪郭の数学的および/またはピクセルレベルの記述を提供する必要があります。これらの輪郭は、リンパ節の外面をレンダリングするために3D空間で結合される。画像化手順および超音波画像の後処理で説明されるすべてのステップは、 図2に要約される。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Schvartsman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Management+of+metastatic+cutaneous+melanoma%3A+updates+in+clinical+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Medical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Management of metastatic cutaneous melanoma: updates in clinical practice.</a> Therapeutic Advances in Medical Oncology. 11, 1758835919851663(2019).</li>
<li>Blum, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+examination+of+regional+lymph+nodes+significantly+improves+early+detection+of+locoregional+metastases+during+the+follow-up+of+patients+with+cutaneous+melanoma+-+Results+of+a+prospective+study+of+1288+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Ultrasound examination of regional lymph nodes significantly improves early detection of locoregional metastases during the follow-up of patients with cutaneous melanoma - Results of a prospective study of 1288 patients.</a> Cancer. 88 (11), 2534-2539 (2000).</li>
<li>Olmedo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+lymph+node+ultrasound+prior+to+sentinel+lymph+node+biopsy+in+384+patients+with+melanoma%3A+a+cost-effectiveness+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Actas+Dermo-Sifiliograficas%22%5BJournal%5D)">Use of lymph node ultrasound prior to sentinel lymph node biopsy in 384 patients with melanoma: a cost-effectiveness analysis.</a> Actas Dermo-Sifiliograficas. 108 (10), 931-938 (2017).</li>
<li>Voit, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+morphology+criteria+predict+metastatic+disease+of+the+sentinel+nodes+in+patients+with+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Ultrasound morphology criteria predict metastatic disease of the sentinel nodes in patients with melanoma.</a> Journal of Clinical Oncology. 28 (5), 847-852 (2010).</li>
<li>Hayes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+cohort+study+of+ultrasound+surveillance+of+regional+lymph+nodes+in+patients+with+intermediate-risk+cutaneous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Prospective cohort study of ultrasound surveillance of regional lymph nodes in patients with intermediate-risk cutaneous melanoma.</a> British Journal of Surgery. 106 (6), 729-734 (2019).</li>
<li>Ipenburg, N. A., Thompson, J. F., Uren, R. F., Chung, D., Nieweg, O. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound+surveillance+of+lymph+nodes+following+lymphoscintigraphy+without+sentinel+node+biopsy%3A+a+useful+and+safe+strategy+in+elderly+or+frail+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Oncology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound surveillance of lymph nodes following lymphoscintigraphy without sentinel node biopsy: a useful and safe strategy in elderly or frail melanoma patients.</a> Annals of Surgical Oncology. 26 (9), 2855-2863 (2019).</li>
<li>Jayapal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+benign+and+metastatic+cervical+lymph+nodes+using+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacy+and+Bioallied+Sciences%22%5BJournal%5D)">Differentiation between benign and metastatic cervical lymph nodes using ultrasound.</a> Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11, Suppl 2 338-346 (2019).</li>
<li>Dankort, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Braf%28V600E%29+cooperates+with+Pten+loss+to+induce+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Braf(V600E) cooperates with Pten loss to induce metastatic melanoma.</a> Nature Genetics. 41 (5), 544-552 (2009).</li>
<li>Damsky, W. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-catenin+signaling+controls+metastasis+in+Braf-activated+Pten-deficient+melanomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">β-catenin signaling controls metastasis in Braf-activated Pten-deficient melanomas.</a> Cancer Cell. 20 (6), 741-754 (2011).</li>
<li>Xie, X., Koh, J. Y., Price, S., White, E., Mehnert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg7+overcomes+senescence+and+promotes+growth+of+BrafV600E-driven+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Atg7 overcomes senescence and promotes growth of BrafV600E-driven melanoma.</a> Cancer Discovery. 5 (4), 410-423 (2015).</li>
<li>Kohler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cutaneous+melanoma+induced+by+mutant+BRaf+arises+from+expansion+and+dedifferentiation+of+mature+pigmented+melanocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mouse cutaneous melanoma induced by mutant BRaf arises from expansion and dedifferentiation of mature pigmented melanocytes.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 679-693 (2017).</li>
<li>Yuan, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenformin+enhances+the+therapeutic+benefit+of+BRAF%28V600E%29+inhibition+in+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Phenformin enhances the therapeutic benefit of BRAF(V600E) inhibition in melanoma.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (45), 18226-18231 (2013).</li>
<li>Marsh Durban, V., Deuker, M. M., Bosenberg, M. W., Phillips, W., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+AKT+dependency+displayed+by+mouse+models+of+BRAFV600E-initiated+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Differential AKT dependency displayed by mouse models of BRAFV600E-initiated melanoma.</a> Journal of Clinical Investigation. 123 (12), 5104-5118 (2013).</li>
<li>Hooijkaas, A. I., Gadiot, J., vander Valk, M., Mooi, W. J., Blank, C. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+BRAFV600E+in+an+inducible+murine+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Targeting BRAFV600E in an inducible murine model of melanoma.</a> American Journal of Pathology. 181 (3), 785-794 (2012).</li>
<li>Steinberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAF+inhibition+alleviates+immune+suppression+in+murine+autochthonous+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology+Research%22%5BJournal%5D)">BRAF inhibition alleviates immune suppression in murine autochthonous melanoma.</a> Cancer Immunology Research. 2 (11), 1044-1050 (2014).</li>
<li>Vitiello, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitumoral+effects+of+attenuated+Listeria+monocytogenes+in+a+genetically+engineered+mouse+model+of+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Antitumoral effects of attenuated Listeria monocytogenes in a genetically engineered mouse model of melanoma.</a> Oncogene. 38 (19), 3756-3762 (2019).</li>
<li>Moon, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanocyte+stem+cell+activation+and+translocation+initiate+cutaneous+melanoma+in+response+to+UV+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Melanocyte stem cell activation and translocation initiate cutaneous melanoma in response to UV exposure.</a> Cell Stem Cell. 21 (5), 665-678 (2017).</li>
<li>Zhao, L., Zhan, Y. T., Rutkowski, J. L., Feuerstein, G. Z., Wang, X. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+2-and+3-dimensional+assessment+of+tumor+volume+and+vascular+density+by+ultrasonography+in+a+transgenic+mouse+model+of+mammary+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ultrasound+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Correlation between 2-and 3-dimensional assessment of tumor volume and vascular density by ultrasonography in a transgenic mouse model of mammary carcinoma.</a> Journal of Ultrasound in Medicine. 29 (4), 587-595 (2010).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

この研究で得られたデータは、転移性黒色腫のBraf/Ptenマウスモデルの鼠径リンパ節の転移性関与を監視する超音波イメージングの能力を証明している。前に示したように16、この技術は、薬物治療の有効性を評価するのに特に有用である。これは、t1および t2で収集された測定値をt0で収集された測定値と比較することによって、同じ動物におけるリンパ節容積の経時的な変化のモニタリングを可能にするからである。これは、マウス間の変動性および基底リンパ節のサイズに影響を与える可能性のある他の要因がすべて考慮されるため、得られた結果のロバスト性の増加に寄与する。さらに、超音波イメージングは、実験群あたりの動物数を減らすことによって、3R原理への準拠を可能にする。
Braf/Ptenマウスでは、鼠径部だけでなく、上腕および腋窩リンパ節も転移性拡散の部位である。しかし、他のものは原発性腫瘍部位に近すぎるため、鼠径リンパ節に焦点を当てることが賢明であり、原発性腫瘍自体の発症...

メラノーマは、しばしば他の皮膚部位(皮下転移)だけでなく、リンパ節、肺、肝臓、脳、骨にも広がる攻撃的な形態の皮膚癌です1。過去10年間で、新薬が臨床現場に導入され、転移性黒色腫患者の平均余命の改善に貢献してきました。しかし、応答までの時間や程度の変動、重篤な副作用、獲得した抵抗の反乱など、限界が残っています1。したがって、転移性の広がりを初期段階、すなわち局所リンパ節に到達したときに検出することが重要です。
局所リンパ節(センチネルリンパ節)の生検は、通常、黒色腫細胞の存在を確認するために行われる。しかし、超音波イメージングは、臨床評価を凌駕し、不必要な生検を回避するのに役立つため、転移性関与を検出する非侵襲的な方法として定着しています2,3,4。さらに、超音波画像は、リンパ節の監視、特に高齢および/または併存疾患の場合に適切であると思われる5,6。超音波分析によって検出され、正常リンパ節と転移性リンパ節の区別を可能にする特徴は、サイズ(体積)の増加、楕円形から円形への形状の変化、不規則なマージン、エコー発生パターンの変化、および変化した(増加した)血管新生7。
Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox遺伝子操作マウス(Braf/Ptenマウス)は、転移性黒色腫の組織特異的で誘導可能なモデルとして最近科学界に利用可能になりました8。この動物モデルでは、原発性腫瘍は非常に迅速に発症する:野生型(wt)BrafからBrafV600Eへの切り替えおよびPtenの喪失の誘導後2〜3週間以内に目に見えるようになり、4週間以内に50〜100mm3の体積に達する。次の2週間で、原発性腫瘍の増殖は、他の皮膚部位、リンパ節、および肺における転移性負荷の漸進的な増加を伴う。
Braf/Ptenマウスは、メラノーマ発生に関与するシグナル伝達経路の解剖9,10、起源のメラノーマ細胞の同定11,12,13、標的療法と免疫療法の両方の観点からの新しい治療選択肢の試験など、複数の目的で広く使用されています8,14,15,16。.具体的には、Braf/Ptenマウスを用いて、弱毒化リステリア・モノサイトゲネス(Lmat)が抗黒色腫ワクチンとして作用することを実証した。治療環境で全身投与した場合、Lmatは腫瘍部位に選択的に蓄積するため、全体的な毒性とは関連しない。さらに、原発性黒色腫量の顕著な減少およびリンパ節および肺における転移性負荷の減少を引き起こす。分子レベルでは、Lmatはメラノーマ細胞のアポトーシス死滅を引き起こし、これは少なくとも部分的には、非細胞自律活性(CD4+およびCD8+ Tリンパ球の部位での動員)に起因する16。
Braf/Ptenマウスをメラノーマモデリングに使用すると、原発性腫瘍および皮下転移の増殖をノギス測定によってモニターすることができる。しかし、リンパ節と肺の関与は、代替技術、おそらく研究者が時間の経過とともに同じ動物を追跡できる非侵襲的な技術を使用して調査する必要があります。この論文では、鼠径リンパ節のサイズ(体積)の増加の縦断的モニタリングのための、得られたデータのその後の3D体積分析と相まって、超音波イメージング(図1)の使用について説明する。

<table><tbody>腫瘍誘発B6に使用される<tr><td>4-ヒドロキシタモキシフェン</td><td>メルク</td><td>H6278</td><td>薬</td></tr><tr><td>。Cg-Braftm1Mmcm Ptentm1Hwu Tg(Tyr-cre/ERT2)13Bos/BosJ (Braf/Pten) マウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>013590</td><td></td></tr><tr><td>Blu gel</td><td>Sooft Ialia</td><td></td><td>点眼液ゲル</td></tr><tr><td>BRAFV600E抗体</td><td>Spring Bioscience Corporation</td><td>E19290</td><td></td></tr><tr><td>IsoFlo (isoflorane)</td><td>Zoetis</td><td></td><td>気体麻酔用液体</td></tr><tr><td>MLANA抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>M2-7C10</td><td></td></tr><tr><td>シグマゲル</td><td>パーカー</td><td></td><td>電極ゲル</td></tr><tr><td>トランスソニックゲル クリア</td><td>テリック SAU</td><td></td><td>超音波ゲル</td></tr><tr><td>ヴィート</td><td>・レキット ベンキーザー IT</td><td></td><td>脱毛クリーム</td></tr><tr><td>コンパクトデュアル麻酔システム</td><td>富士フイルム、ビジュアルソニックス</td><td></td><td>ノーズコーンとインダクションチャンバーを搭載したイソフルラン系麻酔システム</td></tr>「<tr><td>MX550S</td>」富士<td>フイルム、株式会社ビジュアルソニックス</td><td></td><td>UHFUSリニアプローブ</td></tr><tr><td>Vevo 3100</td><td>富士フイルム、ビジュアルソニックス株式会社</td><td></td><td>UHFUSシステム</td></tr><tr><td>Vevo Imaging Station</td><td>富士フイルム、ビジュアルソニックス株式会社</td><td></td><td>UHFUSイメージングステーションと加熱ボードを備えたAdvancing Physiological Monitoring Unit</td></tr>:<tr><td>富士</td><td>フイルム、ビジュアルソニックス株式会社</td><td></td><td>超音波画像後処理用ソフトウェアプラットフォーム</td></tr></tbody></table>

メラノーマのbraf/pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析

Analysis of Lymph Node Volume by Ultra-High-Frequency Ultrasound Imaging in the Braf/Pten Genetically Engineered Mouse Model of Melanoma

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox遺伝子操作マウス(Braf/Ptenマウス)は、転移性黒色腫のin vivoモデルとして広く使用されている。原発性腫瘍がタモキシフェン治療によって誘導されると、誘導後4〜6週間以内に転移性負荷の増加が観察される。この論文は、超高周波超音波(UHFUS)イメージングを利用して、鼠径リンパ節の体積の増加を測定することによって、鼠径リンパ節の転移性関与の増加を監視する方法を示す。
UHFUSシステムは、UHFUSリニアプローブ(22-55MHz、軸分解能40μm)で麻酔マウスをスキャンするために使用されます。鼠径リンパ節(左右両側)からのBモード画像は、短軸ビューで取得され、動物を背側臥位に位置決めする。超音波記録は、電動機械式アームの44μmステップサイズを使用して取得されます。その後、2次元(2D)Bモード取得が超音波画像後処理用のソフトウェアプラットフォームにインポートされ、取得した断面2D画像において鼠径リンパ節が識別され、半自動的にセグメント化される。最後に、3次元(3D)体積の全再構成が、リンパ節体積のレンダリングとともに自動的に得られ、これも絶対測定値として表される。
この非侵襲的な in vivo 技術は、非常に忍容性が高く、同じ実験動物上で2週間にわたって複数のイメージングセッションをスケジュールすることができます。したがって、転移性疾患に対する薬理学的治療の影響を評価することが理想的である。

Tyr::CreER+、BrafCA/+、Ptenlox/loxマウスの4-HTの皮膚塗装後、Cre活性が誘導され、そのためにゲノムレベルでwt BrafからBrafV600Eへのスイッチがあり、Ptenは失われる(図3A)。2〜3週間で、マウスは100%の浸透度を有するオンサイト原発性腫瘍を発症する。4-HT治療(t0)から4週間後、原発性腫瘍は50〜100mm3の体積に達し、その増殖はノギスによってさらに2週間測定することができる((t1およびt2;図3B、上パネル)。腫瘍が非常に大きくなり、マウスが安楽死を必要とするため、後の時点に達することはできません。
転移性負担に関する限り、4-HT治療から4〜6週間以内に鼠径リンパ節において色素沈着の漸進的な増加が観察される(<strong class...

メラノーマは、すぐに他の臓器に広がる非常に攻撃的な病気です。このプロトコルは、転移性黒色腫のBraf/Ptenマウスモデルにおける鼠径リンパ節の体積を監視するために、3Dレンダリングと組み合わせた超高周波超音波イメージングの適用を説明する。

メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析

Tyr::CreER+,BrafCA/+,Ptenlox/lox&#160;genetically engineered mice (Braf/Pten mice) are widely used as an in vivo model of metastatic melanoma. Once a ...

我々の方法は、鼠径リンパ節の体積の増加を測定することによって、鼠径リンパ節の転移性関与の増加を監視することを可能にする。この非侵襲的方法は、非常に忍容性が高いため、2週間にわたって同じ実験動物に対して複数の画像化セッションをスケジュールすることができる。この方法は、転移性疾患に対する薬理学的治療の影響を評価するのに理想的である。我々はこの方法をBraf/Ptenメラノーマモデルに適用したが、原理的には転移性癌の様々な前臨床マウスモデルにおける様々な薬剤の有効性を評価するために適応させることができる。この手順を実演するのは、私の研究室のポスドクであるMarianna Vitiello博士と、IFC-CNRのフェロー研究者であるClaudia Kusmic博士です。メラノーマ誘発のために、3マイクロリットルの5ミリモルの4-ヒドロキシタモキシフェンを約1平方センチメートルの背中上部の剃毛皮膚に3日間連続して塗布する。皮膚の塗装から6週間後、ノギスを使用して原発性腫瘍、そして最終的には皮下転移の体積を測定します。次に、超音波画像を使用して、鼠径リンパ節の体積を測定する。原発巣およびリンパ節を目視検査により分析した後、組織学的研究のためにそれらを切除する。麻酔を確認した後、動物を超高周波超音波画像ステーションの加熱ボードに移し、動物を仰臥位に保ちます。ワセリンで潤滑された直腸プローブを使用してボード温度を調整し、マウスの体温を生理学的範囲に維持します。前足と後足を導電性ペーストでコーティングし、ボードに埋め込まれたECGプレート電極にテープで貼り付けます。生理学的パラメータが正しく取得され、表示されていることを確認してください。脱毛剤を塗布して両方の鼠径部から脱毛し、音響結合媒体でそれらをコーティングする。次に、超高周波超音波リニアプローブをイメージングステーションに埋め込まれた特殊な3Dモータにクランプし、プローブの自動的かつ段階的な移動を可能にします。超音波プローブの位置を適切に向けて調整し、鼠径リンパ節のショートアクセス画像を取得し、関心領域を焦点ゾーンに配置します。スキャン距離を2~5ミリメートル、ステップサイズを44マイクロメートルに設定し、リンパ節スライスあたり46~114スキャンステップ、動物1匹あたり1~3分の取得時間を設定します。鼠径リンパ節の全体積を一連の2D Bモード画像としてスキャンし、マイクロメートルスケールのステップサイズでトランスデューサを直線的に動かすことによって複数のレベルで画像を取得し、呼吸および心臓依存性シネループに関する3Dデータを生成します。イメージング後、取得した画像を生の形式でデジタル保存し、さらにオフラインで分析します。超音波画像の後処理のために、3D鼠径リンパ節画像のデータセットを開き、マルチスライス法を選択し、スタートボタンを押して、3D取得中にキャプチャされた各画像に対応するすべてのフレームの現在のフレームとサムネイルの両方を視覚化します。リンパ節が明らかな最初のフレームのサムネールを選択して、輪郭ビューにロードします。輪郭ビューで、マウスを左クリックしてリンパ節の境界に沿ってポイントをドロップします。希望のポイント数を設定したら、右になめて輪郭を完成させます。最初の輪郭が完成したら、サムネイルビューを使用して、輪郭を描く次の画像を選択します。必要に応じて、輪郭の間の複数の画像をスキップして、各 3D ボリュームに必要な手動トレースの数を減らします。ボリューム全体が輪郭を描くまでこのプロセスを繰り返し、次に[完了]をクリックします。3Dモードウィンドウのワークスペースで、画像表示領域の下にある体積測定アイコンをクリックしてリンパ節体積の数値を視覚化し、リンパ節体積の3Dレンダリングで表面ビューをアクティブにします。マウスを4-ヒドロキシタモキシフェンで処理すると、CreER酵素活性が誘導され、ゲノムレベルで野生型ブラフから変異型ブラフV600Eへの切り替えを引き起こし、Ptenは失われる。4-ヒドロキシタモキシフェン治療の4週間後、原発性腫瘍は50〜100立方ミリメートルの体積に達し、それらの成長はノギスによってさらに2週間測定することができ、それによって鼠径リンパ節で観察される色素沈着の漸進的な増加を示す。メラニン沈着は、メラノーマ抗原MelanAおよびBraf V600Eの免疫組織化学染色によって確認されるように、転移したメラノーマ細胞の存在に常に起因する。セグメンテーション段階の終わりに、すべての切片はリンパ節の外部輪郭のオーバーレイを示した。4-HT治療後4、5、および6週間で分析された右鼠径リンパ節の3Dレンダリングをここに示します。また、同じ動物の左右の鼠径リンパ節の経時的な体積の増加も定量化した。超音波イメージングと適切な免疫組織化学染色を組み合わせて、がん細胞の存在を分子レベルで確認することをお勧めします。リンパ節に加えて、皮下転移の体積は、超音波画像を用いて経時的に監視することもできる。2週間の時間枠が短すぎて研究中の薬物の効果を理解できない場合は、より末梢誘導部位または腫瘍を起こしにくい遺伝子型を選択する。

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Cancer Research

がん研究

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マウスのリンパ脈管構造の非侵襲的光イメージング

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交感性乳癌モデルを用いたトリプルネガティブ乳癌の研究

このプロトコルは、マウスにおけるKRAS肺腫瘍を誘導するために取られたステップと、超音波画像による形成された腫瘍の定量化を記述する。小さな腫瘍は、初期の時間でBラインとして視覚化されます。後の時点で、相対的な腫瘍体積測定は、超音波ソフトウェアの測定ツールによって達成される。...

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本プロトコルは、マウス甲状腺全体を視覚化し、未分化甲状腺癌の成長を監視するための高周波超音波検査を記載しています。...

遺伝子改変マウスモデルにおける同所性ATC腫瘍の解析のための高解像度超音波検査

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腫瘍形成中の抗原特異的CD8+ T細胞の動態を評価するためのリンパ節転移モデル

学ぶ超高周波超音波イメージングによるBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルでのリンパ節容積測定法。非侵襲的に転移性メラノーマの進行を縦断的にモニタリングし、薬理学的治療効果を評価するための強力な手法です。

メラノーマのBraf/Pten遺伝子操作マウスモデルにおける超高周波超音波イメージングによるリンパ節容積の解析

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