Name: RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: 学ぶRNAシーケンスデータの差次発現解析手法。limma、EdgeR、DESeq2の3つのRパッケージを用いて、胆管がんデータを解析し、発現変動遺伝子を同定する方法を解説。研究者が適切な統計手法を選択するための実践的ガイドとして活用できる。

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この研究は、中国国立自然科学財団(グラント第81860276)と国家主要研究開発プログラム(グラント2018YFC1003200)の主要特別基金プロジェクトによって支援されました。

注:R-studioプログラムを開き、Rファイル"DEGs.R"をロードし、ファイルは補助ファイル/スクリプトから取得することができます。
1. データのダウンロードと前処理
<ol><li>がんゲノムアトラス(TCGA)からコリンジオカルシノーマ(CHOL)のハイスループットシーケンシング(HTSeq)カウントデータをダウンロードしてください。このステップは、次の R コードで簡単に実現できます。<ol>
<li>R パッケージをインストールするには、[ 実行 ] をクリックします。</li>
		<li>[ 実行 ] をクリックして R パッケージを読み込みます。 if(!必要な名前空間(「バイオックマネージャー」、静かに=真)) + インストール.パッケージ(「バイオックマネージャー」) バイオクマネージャー::インストール(c(「TCGAbiolinks」、"要約実験")</li>
		<li>作業ディレクトリを設定します。 図書館(TCGAbiolinks) ライブラリ(要約実験) setwd(「C:/ユーザー/リウシイ/デスクトップ」)</li>
		<li>がんの種類を選択します。 がん< - "TCGA-CHOL"</li>
		<li>"GDCquery.R" ファイルから R コードを実行して、データをダウンロードします。ファイル "GDCquery.R" は補助ファイル/スクリプトから取得できます。 ソース(「補足ファイル/スクリプト/GDCquery.R」) ヘッド(cnt) ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##ENSG00000000003 4262 ##ENSG00000000005 1 ##ENSG00000000419 1254 ##ENSG00000000457 699 ##ENSG00000000460 239 ##ENSG00000000938 334 注: 実行後、CHOLHTSeq カウント データはダウンロードされ、"cnt" という名前が付けられ、行はアンサンブル遺伝子 ID を表し、列はサンプル ID を表します。サンプル ID の 14 から 15 桁目の数字に注意してください。01から09までの数字は腫瘍を示し、10から19の範囲は正常組織を示す。</li>
	</ol>
</li>
	<li>アンサンブル遺伝子 ID を遺伝子シンボルに変換します。<ol>
<li>注釈ファイルをストレージ パスに従って R にインポートします。注釈ファイル (gencode.v22.annotation.gtf) は補助ファイルから取得できます。 gtf_v22 <- rtracklayer::インポート('補足ファイル/gencode.v22.annotation.gtf')</li>
		<li>「gtf_v22から R コードを実行します。補足ファイル/スクリプトから取得できる R" ファイル: ソース("補足ファイル/スクリプト/gtf_v22。R")</li>
		<li>アンサンブル遺伝子IDを遺伝子シンボルに変換する関数「ann」を適用します。 cnt=ann(cnt,gtf_v22)</li>
	</ol>
</li>
	<li>低発現遺伝子のフィルタリング<ol>
<li>R パッケージ "edgeR" をインストールするには、[ 実行 ] をクリックします。 バイオクマネージャー::インストール("エッジR")</li>
		<li>R パッケージ 「edgeR」をロードするには、[ 実行 ] をクリックします。 ライブラリ(エッジR)</li>
		<li>次の R コードを実行して、少なくとも 2 つのサンプルで 1 を超える 100 万個あたりの数 (CPM) 値を持つ遺伝子を保持します。 <行を保持するsums(cpm(cnt)>1)>=2 <- as.matrix(cnt[keep,]) 注: 100 万分の数 (CPM) 値は、異なるシーケンス深度によって生じる偏差を排除するために、読み取り数の代わりに使用されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 「リンマ」による微分発現解析
<ol><li>R パッケージ "limma" をインストールするには、[ 実行 ] をクリックします。 バイオクマネージャー::インストール(「リンマ」)</li>
	<li>R パッケージ 「リンマ」、「エッジR」をロードするには、[ 実行 ] をクリックします。 ライブラリ(リンマ) ライブラリ(エッジR)</li>
	<li>次の R コードを実行して、デザイン マトリックスを作成します。 群 <- substring(colnames(cnt),14,15) # Extract group information グループ [グループ %in% "01"] <- "Cancer" # set '01' as tumor tissue グループ [グループ %in% "11"] <- "Normal" # set '11' as normal tissue 群 <- factor (group, levels = c("Normal","Cancer"))
	<ol><li>設計マトリックスを作成します。 デザイン < - モデル.マトリックス (~グループ) 行名(デザイン) <- コルネーム(cnt)</li>
		<li>DGEList オブジェクトを作成します。 dge <- DGEList(カウント = cnt、グループ = グループ)</li>
		<li>データを正規化します。 dge <- calcNormFactors(dge,メソッド = "TMM")</li>
		<li>次の R コードを実行して、リンマトレンドメソッドベースの微分式分析を実行します。 dge ##An クラス "DGEList" のオブジェクト ##$counts ##TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 ##TSPAN6 4262 ##DPM1 1254 ##SCYL3 699 ##C1orf112 239 ##FGR 334</li>
		<li>CPM 値を計算します。 <- cpm(dge、ログ =TRUE、前の.count=3)</li>
		<li>[ 実行 ]をクリックして線形モデルに適合し、データを予測するか、変数間の関係を推測します。 フィット< - lmFit (ログ、デザイン)</li>
		<li>ベイジアンに基づいて T 値、F 値、および対数オッズを計算します。 フィット< - eBayes(フィット、トレンド=真)</li>
		<li>結果表を抽出します。 res_limma< - データとして.フレーム(トップテーブル(フィット、n=Inf)) 頭(res_limma) ## ログFC AveExpr t P.値の adj.P.ヴァルB ##RP11-252E2.2 -4.899493 -2.488589 -20.88052 2.386656e-25 4.931786e-21 47.28823 ##BX842568.1 -4.347930 -2.595205 -20.14532 1.082759e-24 1.118706e-20 45.83656 ##CTC-537E7.3 -5.154894 -2.143292 -19.59571 3.452354e-24 2.216114e-20 44.72001 ##RP11-468N14.3 -6.532259 -2.029714 -19.49409 4.289807e-24 2.216114e-20 44.51056 ##AP006216.5 -4.507051 -2.670915 -19.25649 7.153356e-24 2.956339e-20 44.01704 ##RP11-669E14.4 -4.107204 -2.828311 -18.93246 1.448209e-23 4.987633-20 43.33543 #Theの結果、遺伝子ID、log2折りたたみ値(logFC)、実験中の遺伝子の平均log2発現量(AveExpr)、改変t統計(t)、再発明p値(P.Value)を含む「res_limma」に保存され、偽発見率(FDR)補正されたp値(adj)。P.Val)と微分発現遺伝子の対数オッズ(B) 注: "edgeR" 関数は、サンプルの準備やライブラリの構築とシーケンスによって引き起こされる影響を排除するためにデータを正規化するために使用されました。設計マトリックスの構築では、マトリックスのサンプルIDに実験計画(例えば、組織タイプ:正常または腫瘍組織)を一致させる必要があります。リンマトレンドは、シーケンシング深度が同じデータに適していますが、リンマ・ブームは適しています: (i) サンプルライブラリのサイズが異なる場合。(ii) TMMによって正規化されていないデータ。(iii) データに多くのノイズがあります。正のlogFCは、遺伝子が実験でアップレギュレートされることを意味し、負の数は遺伝子がダウンレギュレートされていることを意味します。</li>
		<li>DEG を識別します。 res_limma$sig <- as.factor() ifelse(res_limma$adj。P.Val < 0.05と腹筋(res_limma$logFC)> 2, ifelse(res_limma$logFC > 2 ,''up'')))#adj.p値は0.05と|log2FC<|>= 2 は、DEG を識別するためのしきい値です。 サマリー(res_limma $sig) ##down上がっていません ##1880 ​17341 1443</li>
		<li>結果表をファイルに出力します。 書き込み.csv(res_limma、ファイル = 'result_limma.csv')</li>
		<li>R パッケージ "ggplot2" をインストールするには、[ 実行 ] をクリックします。 パッケージをインストールする(「ggplot2」)</li>
		<li>R パッケージ "ggplot2" をロードするには、[ 実行 ] をクリックします。 ライブラリ(ggplot2)</li>
		<li>「火山」から R コードを実行します。火山プロットを作成する場合は R" を選択します。ファイル "火山。R"は補助ファイルから取得できます。 ソース("補足ファイル/スクリプト/火山。R") 火山(res_limma"logFC","adj.P.Val",2,0.05) 注: 遺伝子は log2FC と adj-p 値に従って異なる位置にマッピングすることができ、アップレギュレーション DEG は赤で色分けされ、ダウンレギュレーション DEG は緑色で色分けされます。</li>
		<li>[ エクスポート ]をクリックして、火山プロットを保存します。 注:火山プロットは、生成され、異なる形式(例えば、pdf、TIFF、PNG、JPEG形式)でダウンロードすることができます。遺伝子は、log2FCとadj p 値に応じて異なる位置にマッピングすることができ、アップレギュレーションDEG(log2FC > 2、adj p < 0.05)は赤で着色され、ダウンレギュレートされたDEGs(log2FC < -2、adj p < 0.05)は緑色で着色され、非DEGは灰色で着色されます。</li>
	</ol></li>
</ol>3. 「edgeR」による微分表現解析
<ol><li>R パッケージ 「edgeR」をロードするには、[ 実行 ] をクリックします。 ライブラリ(エッジR)</li>
	<li>次の R コードを実行して、デザイン マトリックスを作成します。 グループ<サブストリング(コルネーム(cnt),14,15) グループ [グループ %in% "01"] < - "がん" グループ [グループ %in% "11"] <- "通常" グループ=因子(グループ、レベル= c(「正常」「癌」) デザイン <-モデル.マトリックス(~グループ) 行名(デザイン) = コルネーム(cnt)</li>
	<li>DGEList オブジェクトを作成するには、[ 実行 ] をクリックします。 < - DGEリスト(カウント=cnt)</li>
	<li>データを正規化します。 dge <- calcNormFactors(dge,メソッド = "TMM")</li>
	<li>[ 実行 ] をクリックして、遺伝子発現値の分散を推定します。 dge <- 見積Disp(dge、設計、堅牢性= T)</li>
	<li>[ 実行 ] をクリックして、データをカウントするモデルに適合します。 フィット< - glmQLFit(dge、デザイン)</li>
	<li>統計的検定を実施します。 フィット< - glmQLFTest(フィット)</li>
	<li>結果表を抽出します。結果は、ログフォールド変更値、ログCPM、F、p値、およびFDR補正p値を含む「res_edgeR」に保存されます。 res_edgeR=as.data.frame(フィット、n=インフ)) 頭(res_edgeR) ## ログFC ログ CPM F P値 FDR ##GCDH -3.299633 5.802700 458.5991 1.441773e-25 2.979280e-21 ##MSMO1 -3.761400 7.521111 407.0416 1.730539e-24 1.787993e-20R ##CL1 -3.829504 5.319641 376.5043 8.652474e-24 5.516791e-20 ##ADI1 -3.533664 8.211281 372.6671 1.067904e-23 5.516791e-20 ##KCNN2 -5.583794 3.504017 358.6525 2.342106e-23 9.679455e-20 ##GLUD1 -3.287447 8.738080 350.0344 3.848408e-23 1.194406e-19 #The結果は、ログ折りたたみ変更値(logFC)、ログCPM、F、p値、およびFDR補正p値を含む「res_edgeR」に保存されます。</li>
	<li>DEG を識別します。 res_edgeR$sig = as.factor( ifelse(res_edgeR$FDR < 0.05と腹筋(res_edgeR $logFC) > 2, ifelse(res_edgeR$logFC > 2 ,'up','down')、そうではありません) サマリー(res_edgeR$sig) ##down上がっていません ##1578 15965 3121</li>
	<li>結果表をファイルに出力します。 書き込み.csv(res_edgeR、ファイル = 'res_edgeR.csv')</li>
	<li>火山プロットを作成します。 火山(res_edgeR"logFC","FDR",2,0.05)</li>
	<li>[ エクスポート ]をクリックして、火山プロットを保存します。</li>
</ol>4. 「DESeq2」による微分発現解析
<ol><li>R パッケージ "DESeq2" をインストールするには、[ 実行 ] をクリックします。 バイオクマネージャー::インストール(「DESeq2」)</li>
	<li>R パッケージ "DESeq2" を読み込むには、[ 実行 ] をクリックします。 ライブラリ(DESeq2)</li>
	<li>次の R コードを実行して、グループ化係数を決定します。 グループ<サブストリング(コルネーム(cnt),14,15) グループ [グループ %in% "01"] < - "がん" グループ [グループ %in% "11"] <- "通常" グループ=因子(グループ、レベル= c(「正常」「癌」)</li>
	<li>オブジェクトを作成します。 dds <-DESeqDataSet マトリックス (cnt, データフレーム(グループ), デザイン = ~グループ) dds ##class: デセクデータセット ##dim: 20664 45 ##metadata(1): バージョン ##assays(1): カウント ##rownames(20664): TSPAN6 DPM1 ..RP11-274B21.13 LINC01144 ##rowData名(0): ##colnames(45): TCGA-3X-AAVA-01A-11R-A41I-07 .. ##colData名(1): グループ</li>
	<li>解析を実行します。 dds < - DESeq(dds)</li>
	<li>結果表を生成します。 res_DESeq2 < - データフレーム(結果(dds)) 頭(res_DESeq2) ## ベースMean ログ2フォールド変更 lfcSE スタット p値パジ ##TSPAN6 4704.9243 -0.8204515 0.3371667 -2.433370 1.495899e-02 2.760180e-02 ##DPM1 1205.9087 -0.3692497 0.1202418 -3.070894 2.134191e-03 4.838281e-03 ##SCYL3 954.9772 0.2652530 0.2476441 1.071106 2.841218e-01 3.629059e-01 ##C1orf112 277.7756 0.7536911 0.2518929 2.992109 2.770575e-03 6.101584e-03 ##FGR 345.8789 -0.6423198 0.3712729 -1.730047 8.362180e-02 1.266833e-01 ##CFH 27982.3546 -3.8761382 0.5473363 -7.081823 1.422708e-12 1.673241e-11 注: 結果は、正規化された読み取りカウント(baseMean)、ログフォールド変更値(log2FoldChange)、ログフォールド変更標準エラー(lfcSE)、Wald統計(stat)、元のp値(pvalue)、修正されたp値(padj)の平均を含む「res_DESeq2」に保存されます。</li>
	<li>DEG を識別します。 res_DESeq2$sig = as.factor() ifelse(res_DESeq2$padj < 0.05 & abs(res_DESeq2$log2FoldChange) > 2, ifelse(res_DESeq2$log2Foldchange > 2 ,'up','down')、そうではありません) サマリー(res_DESeq2$sig) ##down上がっていません ##1616 16110 2938</li>
	<li>結果表をファイルに出力します。 書き込み.csv(res_DESeq2、ファイル = 'res_DESeq2.csv')</li>
	<li>火山プロットを作成します。 火山(res_DESeq2"log2FoldChange"""padj",2,0.05)</li>
	<li>[ エクスポート ]をクリックして、火山プロットを保存します。</li>
</ol>5. ベン図
<ol><li>R パッケージ "VennDiagram" をインストールするには、[ 実行 ] をクリックします。 パッケージをインストールする(「ベンダイアグラム」)</li>
	<li>R パッケージ "VennDiagram" を読み込むには、[ 実行 ] をクリックします。 図書館 (ベンダイアグラム)</li>
	<li>規制されたDEGのベン図を作成します。 グリッド.新ページ() グリッド.ドロー(ベンダイアグラム(リスト(リンマ=ローネーム(res_ リムマ[res_limma$シグ="アップ"、]) エッジR=行名(res_edgeR[res_edgeR$sig="up",)) DESeq2=行名(res_DESeq2[res_DESeq2$sig== "アップ",[]) NULL、高さ = 3、幅 = 3、単位 = "in"、 col="黒"、lwd=0.3,fill=c(「#FF6666""、#FFFF00"、 "#993366"), アルファ=c(0.5、0.5、0.5)、メイン=「アップ規制されたDEG」)</li>
	<li>[ エクスポート ] をクリックしてベン図を保存します。</li>
	<li>ダウン規制されたDEGsのベン図を作成します。 グリッド.新ページ() グリッド.ドロー(ベンダイアグラム(リスト(リンマ=ローネーム(res_ リンマ[res_limma$sig="down",)) エッジR=行名(res_edgeR[res_edgeR$sig== 「ダウン」、]) DESeq2=行名(res_DESeq2[res_DESeq2$sig="down",)) NULL、高さ = 3、幅 = 3、単位 = "in"、 col="黒"、lwd=0.3,fill=c(「#FF6666""、#FFFF00"、 "#993366"), アルファ=c(0.5、0.5、0.5)、メイン=「ダウン規制されたDEG」)</li>
	<li>[ エクスポート ] をクリックしてベン図を保存します。</li>
</ol>

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<li>Leng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EBSeq%3A+an+empirical+Bayes+hierarchical+model+for+inference+in+RNA-seq+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EBSeq: an empirical Bayes hierarchical model for inference in RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 29, Oxford, England. 1035-1043 (2013).</li>
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原稿は以前に出版されておらず、他の場所で出版される必要はありません。すべての著者は、重要な知的コンテンツのためにこの原稿の作成に貢献し、最終的な原稿を読んで承認しました。私たちは、利益相反がないことを宣言します。

癌における豊富な異常性転写物は、RNA-seq差動分析5によって容易に同定することができる。しかし、RNA-seq微分発現解析の適用は、R言語と適切な方法を選択する能力を持つ特定のスキルを必要とするため、しばしば制限されています。この問題に対処するために、我々は、3つの最も知られている方法(リンマ、EdgeRおよびDESeq2)とRNA-seqの微分発現解析を適用するためのチュートリアルの詳細な紹介を提供する。これにより、3つの方法すべてにおける類似点と相違点の理解が容易になり、個々のデータに適した方法を選択することができ、複雑な動的生物学的プロセスを理解できるようになります。
ここでは、リンマ、edgeR、DESeq2を通じたRNA-seq微分発現解析の詳細なプロトコルを、(i)データのダウンロードと前処理、(ii-iv)リンマ、edgeR、DESeq2を介した微分発現解析、(v)それぞれ、これらの3つの方法の結果をベン図を通じた比較に示す。
3つの方法は、微分式解析のプロセス...

RNA-シーケンシング(RNA-seq)は、多くの利点(例えば、高いデータ再現性)を有するトランスクリプトミクスで最も広く使用されている技術の1つであり、複雑な生物学的プロセス1,2の機能とダイナミクスについての理解を劇的に高めています。異なる生物学的文脈下での異常転写物の同定は、RNA-seq分析の重要なステップである。RNA-seqは、病因と関連する分子機構と生物学的機能を深く理解することを可能にします。したがって、微分分析は、腫瘍3、4、5の診断、予後および治療に対して価値があると考えられてきた。現在、RNA-seqの微分発現解析、特にリンマ、DESeq2およびEdgeR1、6、7のために、よりオープンソースのR/バイオ伝導体パッケージが開発されている。しかし、差分分析には、R言語を持つ特定のスキルと、医学教育のカリキュラムに欠けている適切な方法を選択する能力が必要です。
このプロトコルでは、がんゲノムアトラス(TCGA)から抽出された胆管癌(CHOL)RNA-seqカウントデータに基づいて、最も知られた方法の3つ(リンマ8、EdgeR9およびDESeq210)を、それぞれRプログラム11によって実施し、CHOLと正常組織との間のDEGsを同定した。リンマ、EdgeR、DESeq2の3つのプロトコルは似ていますが、分析のプロセス間で異なるステップがあります。例えば、正規化された RNA-seq カウントデータは、EdgeR および limma8,9に必要ですが、DESeq2 は独自のライブラリーの不一致を使用して、正規化10ではなくデータを修正します。さらに、edgeRはRNA-seqデータに特に適しており、リムマはマイクロアレイおよびRNA-seqに使用されます。線形モデルは、DEG12を評価するためにlimmaによって採用され、edgeRの統計は経験的ベイズ推定、正確なテスト、一般化線形モデルおよび準尤度検定を含む負の二項分布に基づいている。
要約すると、それぞれリンマ、DESeq2、EdgeRを用いたRNA-seq微分発現解析の詳細なプロトコルを提供します。この記事を参照することにより、ユーザーは簡単にRNA-seqの微分分析を行い、データに適切な微分分析方法を選択することができます。

<table><tbody><tr><td>R</td><td></td><td>バージョン3.6.2</td><td>フリーソフト</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td></td><td></td><td>フリーソフト</td></tr></tbody></table>

rnaシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、deseq2

Three Differential Expression Analysis Methods for RNA Sequencing: limma, EdgeR, DESeq2

RNAシーケンシング(RNA-seq)は、遺伝子改変と複雑な生物学的プロセスとの関係を明らかにし、腫瘍の診断、予後、および治療に大きな価値を持つため、トランスクリプトミクスで最も広く使用されている技術の1つです。RNA-seqデータの微分分析は異常転写を同定するために非常に重要であり、リンマ、EdgeRおよびDESeq2は微分分析のための効率的なツールである。しかし、RNA-seq微分解析には、R言語を持つ特定のスキルと、医学教育のカリキュラムに欠けている適切な方法を選択する能力が必要です。
本明細書において、リンマ、DESeq2およびEdgeRを介して、脈管癌(CHOL)と正常組織の間で、それぞれ微分発現遺伝子(DEG)を同定するための詳細なプロトコルを提供し、その結果は火山プロットおよびベン図に示される。リンマ、DESeq2およびEdgeRの3つのプロトコルは類似しているが、分析のプロセス間で異なったステップを有する。たとえば、線形モデルは limma の統計に使用され、負の二項分布は edgeR および DESeq2 で使用されます。さらに、正規化された RNA-seq カウント データは、EdgeR と limma に必要ですが、DESeq2 には必要ありません。
ここでは、リンマ、EdgeR、DESeq2の3つの差分解析方法の詳細なプロトコルを提供します。3つの方法の結果は部分的に重なっています。3 つのメソッドには独自の利点があり、メソッドの選択はデータのみに依存します。

火山プロットとベン図が特に使用されている微分表現解析の結果を可視化するための様々なアプローチがあります。リンマは、cholと正常組織の間の3323 AGを|logFC|≥2およびadjで同定した。P.Val &lt;0.05 しきい値として、その中で1880はCHOL組織でダウンレギュレートされ、1443 はアップレギュレートされた (図 1a)。一方、edgeR は 1578 のダウンレギュレーション DEG と 3121 のアップレギュレーション DEG を特定しました (図 1b)。DESeq2 は、1616 のダウンレギュレーション DEG と 2938 のアップレギュレーション DEG を特定しました (図 1c)。これら3つの方法の結果を比較すると、1431個のアップレギュレーションDEGと1531個のダウンレギュレートDEGが重なっていた(図2)。
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RNAシーケンシングの微分発現解析方法の詳細なプロトコルが提供されました: リンマ, エッジ, DESeq2.

RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2

RNA sequencing (RNA-seq) is one of the most widely used technologies in transcriptomics as it can reveal the relationship between the genetic alteration ...

RNAシーケンシングの3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジ、DESeq2。RStudio プログラムを開き、R ファイル DEG をロードします。ファイルは補助ファイルから取得できます。1。データのダウンロードと前処理.1.1.がんゲノムアトラスから、胆管癌のハイスループットシーケンシングカウントデータをダウンロードします。このタブは、次のコードで簡単に実行できます。[実行] をクリックして R パッケージをインストールします。[実行] をクリックして R パッケージを読み込みます。作業ディレクトリを設定します。がんの種類を選択します。GDCquery ファイルから R コードを実行して、データをダウンロードします。ファイル GDCquery は補助ファイル/スクリプトから取得できます。実行後、コリンジオカルシノマRNAシーケンシングカウントデータをダウンロードしてCNTと名付けることができ、行はアンサンブル遺伝子IDを表し、カラムはシンボルIDを表します。シンボル ID の 14 ~ 15 桁目の数字に注意してください。01から09の範囲の範囲は腫瘍を示し、10〜19は正常組織を示す。遺伝子シンボルに対するアンサンブル遺伝子IDの会話。注釈ファイルを R にインポートします(そのストレージ パスに従って)。注釈ファイルは、補助ファイルから取得できます。gtf v22 ファイルから R コードを実行します。補助ファイル/スクリプトから取得できます。イン"機能を適用し、アンサンブル遺伝子IDを遺伝子シンボルに変換します。低発現遺伝子をフィルター処理します。パッケージ edgeR をインストールするクリックして実行する R パッケージ edgeR"次の R コードを実行して、少なくとも 2 つのサンプルの 1 より大きい 100 万個あたりの値を持つ遺伝子を保持します。2。limmaを介した微分式分析「Rパッケージリンマをインストールするには実行をクリックしてください」「Rパッケージlimma"edgeR"をロードするには、次のRコードを実行して設計マトリックスを作成します。グループ情報を抽出します。01"を腫瘍組織として設定する。11"を正常組織として設定する。設計マトリックスを作成します。DGEList オブジェクトを作成します。データを正規化します。次の R コードを実行して、リンマトレンドメソッドベースの微分式分析を実行します。CPM 値を計算します。[実行]をクリックして線形モデルに適合し、データを予測するか、変数間の関係を推測します。ベイジアンに基づいて T 値、F 値、および対数オッズを計算します。結果表を抽出します。微分式解析の結果は、log2の折り返し変更値を含むres_limma」に保存されます。実験における遺伝子の平均log2発現量。改変されたT統計量、P値、偽発見率がp値を補正し、微分発現遺伝子の対数オッズを補正した。遺伝子の発現を確認します。したがって、調整されたP値が0.05未満、および2以上のログ偽変化の絶対値は、微分発現遺伝子をスクリーニングするための閾値である。結果は、正常組織と比較して、1,443個の遺伝子が上調節され、1,880個の遺伝子がコリンジオカルシノマ組織でダウンレギュレートされていることを示している。結果表をファイルに出力します。Rパッケージggplot2をインストールするには実行をクリックしてRパッケージggplot2"火山ファイルからRコードを実行して火山プロットを作成し、ファイル火山は補助ファイルから取得することができます。遺伝子は、log2の折り返し変化と調整されたP値に従って異なる位置にマッピングすることができます。したがって、アップレギュレートされた微分発現遺伝子は赤色で着色される。下降制御された微分発現遺伝子は緑色で着色されています。「エクスポート」をクリックして火山プロットを保存します。3。edgeRを介した微分式分析「実行をクリックして R パッケージ edgeR をロードする」次の R コードを実行して、設計マトリックスを作成します。[実行] をクリックして DGEList オブジェクトを作成し、データを正規化します。[実行]をクリックして、遺伝子発現値の分散を推定します。[実行] をクリックして、データをカウントするモデルに適合します。統計的検定を実施します。結果表を抽出します。結果は、ログフォールド変更値、logCPM、F、p値、および修正されたp値の偽検出率を含むres edgeRに保存されます。遺伝子の発現を確認します。結果res edgeR」は、正常組織と比較して、3、121個の遺伝子がアップレギュレートされ、1,578遺伝子がコリンジオカルシノ組織でダウンレギュレートされていることを示している。結果表をファイルに出力します。火山プロットを作成します。[エクスポート]をクリックして、火山プロットを保存します。4。DESeq2による微分式解析R パッケージ DESeq2 をインストールするには、[実行] をクリックして R パッケージ DESeq2"次の R コードを実行して、手探り係数を決定します。DESeq2 データ・セット・オブジェクトを作成します。解析を実行します。結果表を生成します。結果は、正規化された読み取り回数の平均、ログフォールド変更値、ログフォールド変更標準矢印、溶接統計量、元のP値、および修正されたP値を含むreseq2に保存されます。DEG を識別します。結果はDESeq2は正常組織と比較すると、2938個の遺伝子がアップレギュレートされ、1,661遺伝子がコリンジオカルマ組織でダウンレギュレートされていることを示している。結果表をファイルに出力します。火山プロットを作成します。[エクスポート]をクリックして、火山プロットを保存します。5。ベン図。[実行] をクリックして、R パッケージのベン図をインストールします。[実行] をクリックして、R パッケージベン図を読み込みます。アップレギュレーションされた微分発現遺伝子のベン図を作成します。バン図を保存するためにエクスポートをクリックし、ダウンレギュレートされた微分発現遺伝子のベン図を作成します。[エクスポート] をクリックしてベン図を保存します。6。代表結果。図1は、リンマ、エッジ、DESeq2によって獲得されたすべての遺伝子の火山プロットを示しています。負の対数 p 値は、ログ折りたたみの変化に対してプロットされます。赤い点は、アップレギュレートされた微分発現遺伝子を表し、緑色の点は、ダウンレギュレートされた差動発現遺伝子を表します。リンマは、遺伝子を1880個のダウンレギュレーションされた差動発現遺伝子と、胆管癌組織における1443個のアップレギュレートされた微分発現遺伝子を同定する。EdgeRは、1578個のダウンレギュレーションされた微分発現遺伝子と、3,000121のアップレギュレートされた微分発現遺伝子を同定します。DESeq2は、1,000611個のダウンレギュレーションされた微分発現遺伝子と、2938個のアップレギュレートされた微分発現遺伝子を同定します。図2は、ベン図は、リンマエッジRとDESeq2からの結果の分裂の間で重複を示す。これら3つの方法、1,000431のアップレギュレートされた微分発現遺伝子と、1,531個のダウンレギュレートされた微分発現遺伝子が重複している結果を比較します。7.結論: このプロトコルでは、R パッケージ、limma、edgeR、および DESeq2 を使用して、カウント データのシーケンスの異なる種類の詳細なプロトコルをここに提供しました。3つの方法は、分析のプロセスの中で同様のスタッフを持っています。そして、これらの3つの薬から部分的に重複しています。3つの薬にはいずれも独自の利点があります。そして、選択はデータの時間に依存します。私の現在のデータがある場合、limmaは優先順位を持って与えられるべきですが、生成シーケンシングデータ、edgeR、およびDESeq2が好ましいです。

three-differential-expression-analysis-methods-for-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このプロトコルは、トロンビン処理の有無にかかわらず、ヒト肺微小血管内皮細胞にトランスクリプトームのプロファイルへのRNA-seqの、強力な次世代DNAシーケンシング技術を適用するための完全かつ詳細な手順を示します。このプロトコルは、異なる試薬又は病気の状態によって影響を受ける様々な細胞や組織に一般化できる。...

RNA-seqのトロンビン処理におけるトランスクリプトームの解析と制御ヒト肺微小血管内皮細胞

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。...

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

インデックス化されたcDNAライブラリの調製、カスタムプローブによるハイブリダイゼーションとキャプチャ、および遺伝子発現、突然変異、および遺伝子融合のための選択された転写物を調べるためのデータ解析を含む、標的RNAシーケンシングベースの方法について説明します。Targeted...

遺伝子発現およびゲノム変化を特徴づけるために、RNAシーケンシングアッセイをターゲットに

このプロトコルは、ゼブラフィッシュの胚は、幼虫から全体のトランスクリプトーム解析手法を提案またはセルを並べ替えられます。我々 には、RNA の隔離、RNASeq データの経路解析と遺伝子発現変動の qRT PCR...

サンプル準備およびゼブラフィッシュから RNASeq による遺伝子発現データの解析

このプロトコルは、チップ seq、4sU seq、総 RNA シーケンス、およびリボソームが細胞および細胞のためプロファイリングの組合せの使用を説明します。転写因子のバインド、 de novo転写、RNA...

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

ここで提示されるヒト一次角化細胞のインビトロ分化法は、RNA-seq分析による分子レベルでの特徴付けによる接触阻害による。...

RNA-Seq解析によるヒト原発性角化細胞のインビトロ分化の特徴

本手法はホルマリン固定パラフィン埋め込み(FFPE)RNAサンプルから得ることができる配列データの質と量を改善するステップを説明する。我々は、FFPE-RNAサンプルの品質をより正確に評価し、シーケンシングライブラリを準備し、FFPE-RNAサンプルからのデータを分析するための方法論を説明する。...

分解されたFFPE-RNAサンプルのシーケンシングと分析の最適化

DiCoExpress は、品質管理から共発現までの RNA-Seq 分析を実行するために R に実装されたスクリプトベースのツールです。DiCoExpressは、最大2つの生物学的要因まで完全でアンバランスな設計を処理します。このビデオチュートリアルでは、DiCoExpressのさまざまな機能について説明します。...

DiCoExpress による多因子 RNA-Seq 実験の解析

選択的スプライシング(AS)および選択的ポリアデニル化(APA)は、転写産物アイソフォームとその産物の多様性を拡大します。ここでは、バルクRNA-seqを分析するためのバイオインフォマティクスプロトコルと、実験条件によって変化するASおよびAPAを検出および視覚化するための3'エンドシーケンシングアッセイについて説明します。...

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

現在の研究では、バルクRNAシーケンシング実験からのケースサンプルと対照サンプルを比較することによって生成された細胞内シグナル伝達経路のプロファイルに基づいて治療標的を予測し、優先順位を付けるRスクリプトであるPathway2Targetsアルゴリズムを実行するためのプロトコルについて説明しています。...

ヒト差次発現遺伝子リストを使用して、ダウンストリーム経路濃縮解析とターゲットの優先順位付けを実行する

このプロトコルにより、バイオインフォマティクスの経験が限られているウェットラボ生物学者のためのRNA-seq実験の初期品質管理が可能になります。...

Rup(RNA-seq Usability Assessment Pipeline) - 真核生物におけるバルクRNA-seq実験の品質管理

学ぶRNAシーケンスデータの差次発現解析手法。limma、EdgeR、DESeq2の3つのRパッケージを用いて、胆管がんデータを解析し、発現変動遺伝子を同定する方法を解説。研究者が適切な統計手法を選択するための実践的ガイドとして活用できる。

RNAシーケンシング用の3つの微分発現解析方法:リンマ、エッジャー、DESeq2

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