Name: マウスの肝内膵島移植中の注入後門脈静脈出血の最小化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: 学ぶマウス肝内膵島移植の改良手術法。ゲルフォームや脂肪組織パッドを用いて門脈静脈出血を最小化し、出血関連死亡を効果的に防止する技術を解説。肝臓がんや肝疾患研究への応用も可能です。

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この研究は、退役軍人省(VA-ORD BLR&D Merit I01BX004536)と国立衛生研究所がHWに#1R01DK105183、DK120394、DK118529を助成した。言語編集のマイケル・リー氏とリンゼイ・スワビー氏に感謝します。

すべての手順は、サウスカロライナ医科大学とチャールストンのラルフHジョンソン医療センターの施設動物ケアおよび使用委員会の承認を得て実施されました。
1. ストレプトゾトシン(STZ)を用いた糖尿病誘導
<ol><li>レシピエントマウス調製:<ol>
<li>すべてのマウスを個別に計量する。</li>
		<li>グルコメーターを用いて尾静脈血サンプルから血糖値を確認する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3つの異なるシナリオに対するSTZ線量決定:<ol>
<li>脂肪肝疾患のマウスの場合、STZ [40mg / kg /日、腹腔内注射]を5日間連続して1回注射する。</li>
		<li>NOD-SCIDマウスの場合、一晩絶食した後、125mg / kgのSTZ、単回注射、すなわち注射する。</li>
		<li>C57BL / 6マウスの場合、225mg / kgのSTZ、単回注射、i.p.</li>
	</ol>
</li>
	<li>STZ (13.5 ミリグラム/mL) の計算: 注:この計算は、体重が30gの5匹のC57BL/6マウスを対象としています。<ol>
<li>総体重:5匹×30g/匹=150g</li>
		<li>必要なSTZ : 150 g x 225 mg/1000g STZ = 33.75 mg</li>
	</ol>
</li>
	<li>STZの準備:<ol>
<li>事前に計算された用量に従ってSTZを計量する。</li>
		<li>秤量したSTZ粉末を氷上の10mLビーカーに移す。</li>
		<li>3mLのクエン酸ナトリウム溶液をビーカーに加え、STZを溶解する。</li>
		<li>よく混ぜ、0.22 μmの細孔を通してろ過滅菌し、調製から10分以内にSTZ溶液を使用してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>STZ注射:<ol>
<li>所望の量のSTZ溶液(マウス1匹に十分)を1mLシリンジにロードする。</li>
		<li>マウス腹部の右下の象限に腹腔内注射を行う。</li>
		<li>注射後5分間マウスを観察し、ケージに戻す前にこの期間中に不快感の兆候がないか確認してください。</li>
		<li>STZ注射後毎日グルコメーターを用いて尾静脈血試料から血糖値を監視する。 注:この実験では、非空腹時血糖値が2日間連続して350 mg/dL>場合、マウスは糖尿病とみなされます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 膵島の準備
注:ヒト膵島は、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(P/S)を添加したCMRL-1066培地中で、100mm細胞培養皿あたり10,000膵島等価数(IEQ)の密度で培養した9。マウス膵島は、同じ密度の10%FBSおよび1%P/Sを有するDMEM中で培養した13。6〜10週齢の雄性NOD-SCIDおよびC57BL/7マウスを市販の供給源から入手した。
<ol><li>培養した膵島を細胞培養皿から緩やかな引っ掻き傷で剥離する。</li>
	<li>1ccシリンジを使用して所望の数の膵島(例えば、300〜350膵島)を手作業で選択し、氷上の滅菌1.5mL微量遠心管に入れる。</li>
	<li>微量遠心機を用いてチューブを10秒間回転させる。</li>
	<li>上清を取り除き、ペレットを失うのを避けるために液体を残します。</li>
	<li>ペレットを200 μLのHBSSに0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)で再懸濁する。</li>
	<li>再懸濁した膵島を0.5mLのインスリン注射器に吸引する。</li>
	<li>シリンジを直立姿勢に置きます。膵島を1分間沈めましょう。</li>
	<li>シリンジを押してすべての気泡を除去し、膵島を含む液体を約100〜150μL残す。</li>
	<li>シリンジヘッドを下げ、シリンジの側面を軽く叩いて、膵島が液体全体に均等に分布するようにします。これで、膵島は注射の準備が整いました。</li>
</ol>3. 膵島移植
<ol><li>マウスを2%イソフルランで全身麻酔下で誘導し、維持する。動物の適切な麻酔を確実にするためにペダル反射の欠如をチェックしてください。</li>
	<li>マウスの腹部領域の毛皮を剃って取り除きます。</li>
	<li>ブプレノルフィンの単回術前用量を投与する(0.1mg / kg i.p.)。</li>
	<li>2%ヨウ素と75%アルコールの3つの交互のワイプで手術領域を消毒する。</li>
	<li>マイクロハサミで開腹を行い、1〜1.5cmの切開を生成します。</li>
	<li>リトラクターで腹腔を開きます。以下に詳述するように、方法Aまたは方法Bのいずれかに従ってください。</li>
</ol>方法A:(ゲルフォームでブリードを止める、図1A)14、15、16
<ol><li>マウスの準備<ol>
<li>切開部の周りに滅菌ガーゼを置きます。</li>
		<li>鉗子を使って腸をそっと引き抜き、ガーゼの上に置きます。</li>
		<li>その場所によって門脈を特定し、それをよく露出させる。</li>
		<li>手術全体を通して暖かい生理食塩水で腸を覆います。</li>
	</ol>
</li>
	<li>膵島プリロードインスリンシリンジ針を十二指腸近くの門脈を通して挿入する(図1B)。これを行うには、穴(ベベル)を下に向けて針を保持し、壁を貫通する前に開口部サーフェスの角度を門脈壁に平行に配置します。<ol>
<li>プランジャーを引いてシリンジに血液(20〜50μL)を吸い込み、最初に膵島を混ぜる。</li>
		<li>膵島を門脈にゆっくりと注入しながら、プランジを引っ張ったり押したりを繰り返します。</li>
		<li>注射部位を覆うようにゲルフォーム(約0.5cm x 0.5cmのサイズ)を置きます。</li>
		<li>門脈から針を引き抜きながら、綿の先端でゲルフォームを押し下げます。</li>
		<li>ゲルを約2分間押し続け、活発な出血がないことを確認します。</li>
		<li>綿の先端をロールオーバーしてゲルフォームから遠ざけ、ゲルフォームが門脈をよく覆うことを確認します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>方法B:(脂肪パッドで出血を止める、図1C)17
<ol><li>門脈を徹底的に露出させる。<ol>
<li>2つの綿の先端を使用して、露出した門脈を左右の両方から保持します。</li>
		<li>十二指腸と門脈の間の脂肪組織パッドを特定する。</li>
		<li>門脈に針を挿入する前に、脂肪パッドを貫通してください(図1D)。</li>
		<li>方法Aのパート4.2.1および4.2.2で説明した同様の手順に従って、膵島を注入する。</li>
		<li>綿の先端で脂肪を押し下げながら針を引き抜きます。</li>
		<li>針を外した後、脂肪パッドを1分間押し続けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>門脈からの出血がないことを確認した後、腸を元の位置の腹腔に静かに戻します。</li>
	<li>閉鎖前に0.5mLの温かい生理食塩水(36〜37°C)を腹腔内に放置する。 注:温かい生理食塩水は、手術後の腸の動きと回復を促進し、腸の壊死を防ぎます。</li>
	<li>5-0の縫合糸で筋肉層を閉じます。</li>
	<li>4-0縫合糸で皮膚層を閉じる。</li>
	<li>麻酔から完全に回復するまで、マウスを加熱パッド上の清潔なケージに入れます。</li>
	<li>12時間ごとに鎮痛剤(例えば、ブプレノルフィン0.1mg/kg i.p.)を引き続き投与し、手術後48時間にわたって補助的な熱を提供する。 注:膵島移植手順は、完了するまでに約15〜20分かかります。</li>
</ol>6. 肝臓切片全体のH&E染色と写真
<ol><li>肝臓灌流<ol>
<li>パート3.1で説明したように、マウスを麻酔下に置きます。</li>
		<li>門脈を慎重に露出させ、下大静脈を切断する。</li>
		<li>25G針を備えた20mLシリンジを用いて、門脈を介して20mLの10%パラホルムアルデヒドを用いて肝臓を約5分間手動で灌流する18。 注:肝臓灌流は、肝臓組織から血液を除去し、膵島移植片を乱すことなく肝臓固定を改善することができる。</li>
		<li>灌流された肝臓全体を他の器官から解剖する。</li>
		<li>灌流肝臓組織を10%パラホルムアルデヒドで24時間固定する。</li>
		<li>パラフィンに組織を埋め込む。</li>
		<li>それぞれ5μm厚の組織切片を切り取り、スライドガラスに載せて染色する。</li>
		<li>標準的な方法を用いてH&E、インスリン、フィブリン、および多形核好中球(PMN)染色を行う15,16。</li>
		<li>顕微鏡下で肝臓切片全体をスキャンします。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Pellegrini, S., Cantarelli, E., Sordi, V., Nano, R., Piemonti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+the+art+of+islet+transplantation+and+cell+therapy+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Diabetology%22%5BJournal%5D)">The state of the art of islet transplantation and cell therapy in type 1 diabetes.</a> Acta Diabetology. 53 (5), 683-691 (2016).</li>
<li>Ballinger, W. F., Lacy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantation+of+intact+pancreatic+islets+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Surgery%22%5BJournal%5D)">Transplantation of intact pancreatic islets in rats.</a> Surgery. 72 (2), 175-186 (1972).</li>
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<li>Toyofuku, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+killer+T-cells+participate+in+rejection+of+islet+allografts+in+the+liver+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Natural killer T-cells participate in rejection of islet allografts in the liver of mice.</a> Diabetes. 55 (1), 34-39 (2006).</li>
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<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+enhances+islet+engraftment+by+suppression+of+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin enhances islet engraftment by suppression of instant blood-mediated inflammatory reaction.</a> Diabetes. 66 (4), 970-980 (2017).</li>
<li>Gou, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-1+antitrypsin+suppresses+macrophage+activation+and+promotes+islet+graft+survival+after+intrahepatic+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Alpha-1 antitrypsin suppresses macrophage activation and promotes islet graft survival after intrahepatic islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. , (2020).</li>
<li>Contreras, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+protein+C+preserves+functional+islet+mass+after+intraportal+transplantation%3A+A+novel+link+between+endothelial+cell+activation%2C+thrombosis%2C+inflammation%2C+and+islet+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Activated protein C preserves functional islet mass after intraportal transplantation: A novel link between endothelial cell activation, thrombosis, inflammation, and islet cell death.</a> Diabetes. 53 (11), 2804-2814 (2004).</li>
<li>Moberg, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+tissue+factor+by+pancreatic+islet+cells+as+a+trigger+of+detrimental+thrombotic+reactions+in+clinical+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Production of tissue factor by pancreatic islet cells as a trigger of detrimental thrombotic reactions in clinical islet transplantation.</a> Lancet. 360 (9350), 2039-2045 (2002).</li>
<li>Melzi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrahepatic+islet+transplant+in+the+mouse%3A+functional+and+morphological+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Intrahepatic islet transplant in the mouse: functional and morphological characterization.</a> Cell Transplantation. 17 (12), 1361-1370 (2008).</li>
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<li>Desai, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+liver+histopathology+on+islet+cell+engraftment+in+the+model+mimicking+autologous+islet+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Effect of liver histopathology on islet cell engraftment in the model mimicking autologous islet cell transplantation.</a> Islets. 9 (6), 140-149 (2017).</li>
<li>Cui, W., Angsana, J., Wen, J., Chaikof, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomal+formulations+of+thrombomodulin+increase+engraftment+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Liposomal formulations of thrombomodulin increase engraftment after intraportal islet transplantation.</a> Cell Transplantation. 19 (11), 1359-1367 (2010).</li>
<li>Cui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombomodulin+improves+early+outcomes+after+intraportal+islet+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Thrombomodulin improves early outcomes after intraportal islet transplantation.</a> American Journal of Transplantation. 9 (6), 1308-1316 (2009).</li>
<li>Proto, C., Grasso, G., Fassio, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatoparenchymal+clearance+of+indocyanine+green+in+infectious+hepatitis%5BTitle%5D)+AND+%22Giornale+di+Malattie+Infettive+e+Parassitarie%22%5BJournal%5D)">Hepatoparenchymal clearance of indocyanine green in infectious hepatitis.</a> Giornale di Malattie Infettive e Parassitarie. 20 (9), 845-851 (1968).</li>
<li>Cabral, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+hepatocytes+and+sinusoidal+endothelial+cells+from+mouse+liver+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of hepatocytes and sinusoidal endothelial cells from mouse liver perfusion.</a> Journal of Visualized Experiments. (132), e56993(2018).</li>
<li>Khatri, R., Hussmann, B., Rawat, D., Gurol, A. O., Linn, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraportal+transplantation+of+pancreatic+islets+in+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Intraportal transplantation of pancreatic islets in mouse model.</a> Journal of Visualized Experiments. (135), e57559(2018).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autologous+mesenchymal+stem+cell+and+islet+cotransplantation%3A+Safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autologous mesenchymal stem cell and islet cotransplantation: Safety and efficacy.</a> Stem Cells Translational Medicine. 7 (1), 11-19 (2018).</li>
</ol>

すべての著者は、利益相反がないと宣言します。

この研究では、出血を予防し、マウスIIT中のマウス死亡率を低下させる可能性のある2つの改善された手順が実証されている。この研究により、研究者は、移植後の即時血液媒介性炎症反応を研究する上でユニークな膵島移植モデルを視覚化することができます。IITモデルは、膵島移植に応答した膵島細胞の生存と肝虚血傷害を研究するための特徴的なモデルです19。ここでは、以前の研究に基づいて手順を洗練させ、合併症誘発マウスの早期死亡率を低下させた。方法A14,15,16および方法B8,9の両方が複数の研究で使用された。我々は、膵島が肝臓全体に分布していることを示し、移植直後の移植片では、IITに典型的に関連する好中球浸潤および血栓症が顕著であった。
マウス肝...

門脈を介した門脈内膵島移植(IIT)は、臨床現場でヒト膵島移植に最も一般的に使用される方法である。マウスIITモデルは、膵島移植を研究し、膵島移植の有効性を高めることができる有望な介入アプローチをテストする絶好の機会を提供します1。IITは1970年代に初めて記載され、いくつかのグループ1、2、3、4、5によって使用されました。それは20006,7年にヒト膵島移植のブレークスルーの後に人気を取り戻しました。 しかし、ほとんどの膵島移植研究は、その容易な成功のために実験的な膵島移植のための好ましい部位として腎臓カプセルを使用した。それどころか、IITはより技術的に困難であり、膵島移植研究にはあまり使用されていません8,9。しかし、IITとは異なり、腎臓カプセルの下に移植された膵島は、血栓症、炎症、および肝組織虚血を特徴とする即時の血液媒介性炎症反応に罹患しないため、肝臓に移植された膵島よりも優れた機能を有する。したがって、腎臓カプセルモデルは、ヒト膵島移植において膵島が遭遇するストレスを完全に模倣していない可能性がある10,11,12。
マウスにおけるIITの主な合併症の1つは、移植後の注射部位からの出血であり、これは異なるマウス系統間で死亡率の10〜30%を引き起こす可能性がある12。この論文では、出血をより迅速かつ確実に止め、IIT後のマウスの死亡率を減らすために、2つの洗練されたアプローチが開発されました。これらの洗練された詳細を視覚的に実証することは、研究者がこの技術的に困難な手順の重要なステップを特定するのに役立ちます。さらに、レシピエントの肝臓における膵島移植片の位置は、移植膵島を有するヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色肝臓組織(全切片)の組織学的検査によって決定された。

<table><tbody><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン v/v</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>23426796</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 針付きシリンジ</td><td>AHS</td><td>AH01T</td><td></td></tr><tr><td>20 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>301031</td><td></td></tr><tr><td>25G x 5/8 インチ皮下注射針</td><td>BD</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>アルコール調製パッド、滅菌</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-363-750</td><td></td></tr><tr><td>動物麻酔システム</td><td>VetEquip、株式会社</td><td></td><td></td>901806</tr><tr><td>ブプレノルフィン塩酸塩、注射</td><td>Par Sterile Products, LLC</td><td>NDC 42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管、15 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>0553859A</td><td></td></tr><tr><td>CMRL-1066</td><td>Corning</td><td>15110CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、絶対 (200 プルーフ)、分子生物学グレード</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>BP2818500</tr><tr><td>極細マイクロ解剖はさみ4 "まっすぐで鋭い</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5882</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>FreeStyle&nbsp;グルコースメーター</td><td>アボット</td><td>ライト</td><td></td></tr><tr><td>フリースタイル 血糖値テストストリップ</td><td>アボット</td><td>ライト</td><td></td></tr><tr><td>ゲルフォーム (吸収性ゼラチンスポンジ、USP)</td><td>ファルマシア &Upjohn Company</td><td>34201</td><td></td></tr><tr><td>Graefe鉗子4 "超繊細な先端</td><td>Roboz Surgical Instrument Co.</td><td>RS-5136</td><td></td></tr><tr><td>加熱パッドAmazon</td><td></td><td>B07HMKMBKM</td><td></td></tr><tr><td>Hegar-Baumgartnerニードルホルダー5.25インチ</td><td>ロボズ手術器具株式会社</td><td>RS-7850</td><td></td></tr><tr><td>インスリン注射器 27ゲージ針付き</td><td>BD</td><td>879588</td><td></td></tr><tr><td>ヨウ素準備パッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>19-027048</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ピラマル クリティカルケア</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン (P/S)</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン縫合糸 4-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8683</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン縫合糸 5-0</td><td>Med-Vet International</td><td>MV-8661</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム、0.9% 静脈内溶液</td><td>VWR</td><td>2B1322Q</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトゾシン (STZ)</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>外科用ドレープ、滅菌済み</td><td>Med-Vet International</td><td>DR1826</td><td></td></tr><tr><td>組織カセット</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>22-272416</td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの肝内膵島移植中の注入後門脈静脈出血の最小化

Minimizing Post-Infusion Portal Vein Bleeding during Intrahepatic Islet Transplantation in Mice

肝臓は現在、臨床現場でヒト膵島の主要な移植部位として受け入れられているが、膵島はほとんどのげっ歯類の前臨床膵島移植研究において腎臓カプセルの下に移植される。このモデルは、マウスの肝内膵島移植が技術的に困難であり、高い割合のマウスが外科的合併症、特に移植後の注射部位からの出血で死亡する可能性があるため、一般的に使用される。この研究では、注入後の門脈出血の発生率を最小限に抑えることができる2つの手順が実証されている。第1の方法は、吸収性止血ゼラチンスポンジを注射部位に適用し、第2の方法は、脂肪組織を出血を止めるための物理的障壁として使用することによって、まず脂肪組織を通って膵島注射針を貫通し、次いで門脈に浸透させることを含む。どちらの方法も、出血誘発マウスの死を効果的に防止することができた。肝内膵島移植の代表的な特徴である膵島分布と移植後の膵島血栓症の証拠を示す全肝臓切片が提示された。これらの改善されたプロトコルは、肝内膵島移植手順を改良し、実験室が前臨床環境で膵島の生存と機能を研究するための手順を設定するのに役立つ可能性がある。

我々は、門脈を介して同系および異系膵島移植を行った。膵島移植機能は、両方の膵島移植モデルにおいて用量依存的に観察された。C57BL/6マウスを用いた同系膵島移植モデルでは、250匹の膵島を移植すると、マウスが高血糖に戻る前に一過性正常血糖が生じた。500膵島を受けたマウスは、移植後30日を超えて正常血糖に達し、維持した(図2A)。両群のマウスは体重の増加を示した(図2B)。
同様に、ヒト膵島対糖尿病NOD-SCIDマウス膵島移植モデルにおいて、体重45、85、または140 IEQs/kgを移植した場合の膵島移植機能を比較した。ノルモ血糖は、45 IEQ/g(〜225-275膵島/マウス)のヒト膵島を移植した場合に達成できなかった。膵島数が85 IEQ/g(~400-450膵島/マウス)に増加したとき、レシピエントの35.7%(10/28)は移植後60日目に正常血糖(p = 0.02対45 IEQ/g群)を達成した。さらに、ヒト膵島140IEQ/g(~600~650...

ここでは、マウスにおける門脈内膵島移植(臨床的には関連性はあるが技術的に困難な外科的処置)を成功裏に実施するための洗練された外科的処置を提示する。

Although the liver is currently accepted as the primary transplantation site for human islets in clinical settings, islets are transplanted under the ...

肝臓は、ヒト膵島の臨床現場での移植のための主要な部位である。マウスの肝内膵島移植は技術的に困難であり、高い割合のマウスが外科的合併症、特に出血で死亡する可能性がある。この研究では、我々が示した2つの方法は両方とも、出血誘発マウスの死を効果的に防止することができる。我々の手法は、がん細胞、間葉系幹細胞、肝細胞を肝臓に直接注射することで、肝がんなどの肝疾患の研究に応用できます。まず、人間の島文化を穏やかな引っ掻き傷で切り離します。1立方センチメートルのシリンジを使用して、氷上の滅菌1.5ミリリットルの微量遠心チューブに300〜350個の膵島を選びます。すべての膵島がピッキングされたら、チューブを10秒間遠心分離して細胞を沈降させる。ペレットの損失を防ぐために少量の上清を除くすべてを捨て、5%BSAを含む200マイクロリットルHBSSに膵島を再懸濁する。再懸濁した膵島を5ミリリットルのインスリンシリンジにロードし、シリンジの針先を1分間回して、膵島をプランジャーに落ち着かせます。プランジャーを押し下げて気泡を取り除き、約100〜150マイクロリットルの溶液をシリンジに入れ、穏やかなタッピングでシリンジを反転させて膵島を均等に分配します。ペダル反射に対する反応がないことを確認した後、乾燥を防ぐために目に軟膏を塗布する。麻酔をかけたマウスの腹部を剃って毛皮を取り除き、2%ヨウ素と75%アルコールの3つの交互の拭き取りで手術領域を消毒する。次に、腹部に1〜1.5センチの切開を行い、腹腔を開く。切開部の周りに滅菌ガーゼを置き、鉗子または綿の先端を使用して腸をガーゼに静かに移します。その後、生理食塩水に浸したガーゼで腸を覆い、門脈を露出させる。ゲルフォームを使用して膵島移動誘発出血を止めるには、針を斜めにして針を保持し、門脈壁に平行な開口部で針先を位置決めしてから、針を門脈に挿入します。プランジャーを引っ込めて20~50マイクロリットルの血液をシリンジに吸い込み、膵島と混合してから、プランジャーを押し下げたり引っ込めたりしながら、膵島を門脈に注入します。すべての膵島が送達されたら、注射部位の上に約5×5センチメートルのゲルフォームを置く。綿の先端を使用してゲルフォームを押し下げ、門脈から針を取り除きます。ゲルを所定の位置に約2分間保持し、ゲルフォームを転がして門脈を覆うことを確認します。出血が止まったら、腸を元の位置の腹腔に静かに戻し、500マイクロリットルの暖かい生理食塩水を腹腔に注入する。縫合糸を使用して筋肉と皮膚の層を閉じます。その後、マウスを加熱パッド上の清潔なケージに入れ、麻酔から完全に回復するまで監視し、12時間ごとに鎮痛剤を投与し、48時間加熱する。脂肪パッドを使用して膵島移動誘発出血を止めるには、実証されているように門脈を露出させた後、2つの綿の先端を使用して露出した静脈を左右に保持し、十二指腸と門脈の間の脂肪組織パッドを見つけます。門脈に挿入する前に、針先で脂肪パッドを貫通する。実証されているように、膵島を門脈に注入する。すべての膵島が届けられたら、静脈から針を外しながら、綿の先端で脂肪組織を約1分間押します。その後、腸を腹腔に戻し、実証されているように残りの術後ケア手順を実行します。膵島移植の効果は用量依存的であり、同系膵島移植後30日目に500膵島が転移すると正常な血糖が観察されるが、250膵島が移植されると一過性正常血糖のみが観察され、マウスは移植後10日目までに高血糖に戻る。両方の群で体重の増加が観察され、ヒト膵島を糖尿病性NOD-SCIDマウスに移植すると同一の応答が観察され、膵島等価物の数が多いが、より少ない数ではない場合に正常血糖が観察される。移入後に出血したマウスの大部分は手術後に死亡するが、出血のないマウスは生存する。移植後28日目に、インスリン染色は、主に血管に近い肝臓全体にヒト膵島が均一に分布していることを明らかにする。インスリンに加えて、フィブリンおよび多形核細胞濾過も移植ヒト膵島内で観察される。肝内膵島移植は、門脈に大きな穴をあけ、出血を引き起こすことがあります。私たちの2つの改善された手順を使用すると、出血を防ぎ、膵島移植後の死亡率を減らすことができます。門脈内膵島移植モデルは、臨床的ヒト膵島移植を模倣することができる。私たちの洗練された手順は、レシピエントの生存率を高め、移植後のさらなる膵島機能研究を可能にします。

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前眼室におけるヒト膵島移植および寄与宿主細胞のイメージングと定量

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エクスビボ マウスの門脈を通る肝臓灌流

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学ぶマウス肝内膵島移植の改良手術法。ゲルフォームや脂肪組織パッドを用いて門脈静脈出血を最小化し、出血関連死亡を効果的に防止する技術を解説。肝臓がんや肝疾患研究への応用も可能です。

マウスの肝内膵島移植中の注入後門脈静脈出血の最小化

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