Name: 蛍光標識小細胞小胞の取り込み と 脊髄における (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: 学ぶ蛍光標識された小細胞外小胞の脊髄細胞への取り込み可視化法。神経細胞とアストロサイトを用いたin vitroおよびin vivo実験により、疼痛と炎症における治療的応用可能性を評価します。

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この研究は、NIH NINDS R01NS102836とペンシルベニア州保健省ユニバーサル研究強化(CURE)からの助成金によって支えられ、シーナ・K・アジットに授与されました。ブラッドリー・ナッシュ博士の原稿の批判的な読み取りに感謝します。

注:すべての手順は、実験動物のケアと使用のためのNIHガイドに従って行われ、ドレクセル大学医学部の施設動物ケア&使用委員会によって承認されました。時限妊娠CD-1マウスは、アストロサイシン培養のために使用され、すべてのダムは含浸後15日後に受け取られた。12週齢のC57BL/6マウスを 生体内 取り込み実験に使用した。
1. RAW 264.7 マクロファージ細胞からのsEvの分離
<ol><li>10%のエキソソーム枯渇ウウシ胎児血清(FBS)および1%ペニシリンストレプトマイシン(ペンストレップ)を含むDMEMエキソソーム枯渇培地中の75cm2フラスコの培養生264.7細胞を24〜48時間培養する。</li>
	<li>300 mL のコンディション中ミディアムと遠心分離機を 300 × g で 4 °C で 10 分間収集します。</li>
	<li>上清と遠心分離機を2,000×gで20分間4°Cで回収します。 </li>
	<li>上清を遠心管に移し、遠心分離機を4°Cで12,000×gで35分間移動します。</li>
	<li>上清を収集し、0.22 μmのシリンジフィルターを通してフィルターを取ります。</li>
	<li>超遠心チューブと遠心分離機に、4°Cで110,000×gで80分間移します。</li>
	<li>上清(エキソソーム枯渇培地)を保存し、1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)の2mLでペレットを再懸濁し、遠心分離機を110,000×gで4°Cで1時間保存します。 </li>
	<li>ナノ粒子追跡解析(NTA)および透過電子顕微鏡(TEM)またはウェスタンブロッティング用の放射性免疫沈降アッセイ(RIPA)バッファーを使用して、さらに特性評価のためにPBSの100 μLでペレットを再懸濁します。</li>
</ol>2. SEVの特徴付け
<ol><li>ナノ粒子追跡解析(NTA) 注:RAW 264.7細胞からの精製されたSEVのサイズ分布と粒子数/濃度をNTAで測定しました。<ol>
<li>フィルター処理されたPBSでsEvを希釈して、最適な追跡のために視野ごとに20〜60個の小胞を得る。</li>
		<li>一定の流量のシリンジポンプを使用して、希釈したサンプルをフローセルに導入します。</li>
		<li>30 s の 3-5 ビデオを撮影します。シャッタースピードとゲインを設定し、カメラの設定を手動で絞り込んで、表示可能で追跡および解析できる小胞の最大数を設定します。</li>
		<li>各記録間でサンプルを進めて、複製測定を行います。NTA取得後の設定を最適化し、サンプル間の設定を一定に保ちます。</li>
		<li>NTAソフトウェアを使用して各ビデオを分析し、小胞の平均サイズと濃度を取得します。</li>
		<li>一貫性を保つ、同一のシステム設定ですべてのNTA測定を実行します。</li>
	</ol></li>
	<li>ウェスタンブロット<ol>
<li>メーカーの指示に従ってタンパク質アッセイキットを使用して、sEV、細胞ライゼ、エキソソーム枯渇培地中のタンパク質総量を定量化します。</li>
		<li>細胞ライセート調製のために、生264.7細胞を75cm2フラスコで80〜90%コンフルエントになるまで培養する。0.25%のトリプシンで細胞を10〜15分間取り外し、培養培地でトリプシンを中和し、400×gで5分間回転させて細胞をペレット化します。新鮮な成長培地で細胞を再懸濁します。</li>
		<li>ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、1×106細胞を別のチューブに移します。上記と同じ遠心分離条件を使用してPBSで細胞を2回洗浄し、最終的なスピンから細胞ペレットに50μLのリシスバッファー(プロテアーゼ阻害剤カクテルを加えたRIPAバッファー)を加えます。</li>
		<li>細胞を渦を起させ、20分間氷の上に置きます。混合物を4°Cで30分間10,000×gで遠心分離し、上清(すなわち、ライセート)を新鮮なマイクロ遠心チューブに集め、使用するまで−80°Cに保ちます。</li>
		<li>エキソソームで枯渇した培地2 mLを、3 kDaカットオフ遠心フィルターを使用して100 μLに濃縮してから、タンパク質の量を定量化します。sevとリシスバッファーを1:1比、渦を30 sで混合し、氷上で15分間インキュベートしてタンパク質の量を定量化します。</li>
		<li>sEVのタンパク質(2 μg)、RAW 264.7細胞リセート、エキソソーム枯渇培地をサンプルバッファーを減らして混合します。</li>
		<li>95°Cで5分間サンプルを変性させ、5分間氷の上に置き、10,000×gで2分間回転 させます。サンプルを12%トリスグリシンプロテインゲルにロードし、125 Vで45分間ゲルを実行します。</li>
		<li>25Vで25時間、ポリビニリデンジフッ化物(PVDF)膜にタンパク質を移します。</li>
		<li>転写後、ブロックバッファー( 材料表を参照)を使用して、PVDF膜を室温で1時間ブロックします。</li>
		<li>一次抗体を一晩4°Cでシェーカーにインキュベートします。 注:使用された一次抗体は、抗CD81(1:1,000)、抗α-1,3/1,6-マンノシルトランスフェラーゼ(ALG-2)相互作用タンパク質X(Alix)(1:1,000)、抗カルネキシン(1:1,000)、抗グリセアルデヒド3-デアス水素(GAP)でした。</li>
		<li>ブロット3 x 15分を1xトリス緩衝生理食い、0.1%トゥイーン20(TBST)で洗浄し、ヤギ抗マウスIgG-わさびペルオキシダーゼ(HRP)またはロバ抗ウサギIgG-HRPコンジュゲート二次抗体(1:10,000)で室温でインキュベートします。</li>
		<li>ブロットを1x TBSTで3 x 15分洗い、HRP基質を使用してタンパク質を検出します。</li>
		<li>ウェスタンブロットイメージャーを使用して、強化された化学発光によってブロットを分析します。</li>
	</ol></li>
	<li>透過型電子顕微鏡(TEM)<ol>
<li>0.1 Mリン酸緩衝液(PB)に2%パラホルムアルデヒド(PFA)でそれらを再懸濁させることによってsEVを修正します。2 x 15 s の渦。</li>
		<li>きれいなパラフィルムに10 μLのsEV懸濁液を置きます。カーボンコーティングされたフォームバーグリッドを、コーティングされた側がサスペンションに向けてドロップに浮かべる。乾燥した環境で20分間膜を吸収させます。</li>
		<li>PBの滴下にグリッド(膜側を下)を置き、3 x 2分間洗浄します。</li>
		<li>グリッドを5分間1%グルタルアルデヒドの50 μLに移します。</li>
		<li>100 μLの蒸留水で8 x 2分間洗浄します。</li>
		<li>2分間、1%のウラニル酢酸の滴にグリッドを配置することにより、サンプルを対比します。</li>
		<li>パラフィルムで覆われた氷皿に2%メチルセルロース溶液を2%のメチルセルロース溶液と0.2%の酢酸の50 μLでサンプルを埋め込みます。</li>
		<li>ステンレス鋼のループを使用してグリッドを保持し、フィルターペーパーで余分な流体を除去します。</li>
		<li>ループに残った状態で10分間グリッドをエアドライします。</li>
		<li>透過型電子顕微鏡で80kVで観察します。</li>
	</ol></li>
</ol>3. sEVのラベリング
<ol><li>20 μgのsEVを1 mLの希釈液バッファーまたは同じ量のPBSで1 mLの希釈して、希釈液バッファーの1 mLで色素制御を行います。</li>
	<li>PKH67またはPKH26染料3μLを1mLの希釈液バッファーで希釈し、ピペットで混合します。</li>
	<li>希釈したSEVに希釈したPKH染料を加え、ピペットで混ぜます。暗い温度で5分間インキュベートします。染料コントロールの場合は、ステップ3.1から希釈したPBSと希釈した色素を混合します。</li>
	<li>PBSに1%のウシ血清アルブミン(BSA)の2mLを、色素とsEVミックスを用いたチューブに加え、色素を過剰に吸収するコントロールチューブに添加します。</li>
	<li>遠心分離機は4°Cで110,000×gで1時間用いた。 上清を捨て、2mLのPBSでペレットを再懸濁し、遠心分離機を4°Cで110,000×gで1時間停止する。 PBSで洗浄を繰り返し、PBSの等容数でラベル付きのsEVまたは色素制御を再中断します。</li>
	<li>ブラッドフォード法により総タンパク質の量を定量化します。</li>
</ol>4. 神経-2a細胞によるSEVの取り込み
<ol><li>12ウェルプレートに18mmのカバーリップを入れ、10ウェル×10個 のニューロ2a細胞を各ウェルに10%FBSと1%のペンストレップを含む完全なDMEM培地の合計1mLで10個のニューロ-2a細胞を入れます。</li>
	<li>細胞の合流率が80〜90%の場合、培地をDMEMエキソソーム枯渇培地に変更します。線量と時間依存の取り込みのために1、4、24時間の各ウェルに1、5、または10μgの標識されたSEVを加えるか、等量の色素制御を加えます。</li>
</ol>5. 主要な占星術文化
<ol><li>出生後4日に低体温症を誘発して4人の出生後の子犬を麻酔する。</li>
	<li>氷冷ハンクのバランス塩溶液(HBSS)を含む60mmペトリ皿に脳を集め、10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-ピペラジネタンスルホン酸(HEPES)を補います。</li>
	<li>両方の皮質葉を解剖し、髄液を取り除く。殺菌された刃でティッシュをミンチする。</li>
	<li>組織をパパイン/デオキシリボヌクレアーゼI解離緩衝液を含む15mL円錐管に移し、37°Cで20分間インキュベートする。 5分ごとに旋回します。 注:4つのマウスコルチスの場合、HBSSの7.5 U/mLパパインの9 mLは、少なくとも30分間37°Cで活性化され、0.22 μmのシリンジフィルターを通して濾過され、デオキシリボヌクレアーゼIと混合して0.1mg/mLの最終濃度にします。</li>
	<li>上清を吸引し、5 mLの完全なDMEMを加えて酵素活性を不活性化する。慎重に5 mLガラス血清ピペットと炎で磨かれたパスツールピペットで組織を解体するためにトリチュレート。</li>
	<li>細胞懸濁液を40μmの細胞ストレーナーに通し、4°Cで5分間250×gで遠心分離します。 培地を吸引し、完全なDMEMの10mLで細胞を75cm2フラスコに播種する。清澄培地は、めっき後4時間で新鮮なDMEM培地の15mLに交換してください。</li>
	<li>14日間のインビトロの後、フラスコを軌道シェーカーに移し、ミクログリアとオリゴデンドロサイトを320rpmで6時間取り外します。</li>
	<li>残りのアストロサイトを、細胞解離酵素(材料表)の5 mLを用いて、37°Cで10分間トリプシン化する。 5 mLの完全なDMEMを加えて酵素作用を不活性化し、4°Cで5分間250×gで細胞をペレット化します。 </li>
	<li>完全な DMEM でセルを再中断します。シード5×12mm #1.5のカバーリップに10個の4 個の細胞を24ウェルプレートに入れます。</li>
</ol>6. アストロサイトによるSEVの取り込み
<ol><li>アストロサイトが80-90%の合流率に達したら、培地をDMEMエキソソーム枯渇培地に変更します。</li>
	<li>ラベルなしのラベル付きのsEV、等量の色素制御、またはPBSを細胞に1μg加えます。sEV処理後1時間24時間染色用の細胞を使用してください。</li>
</ol>7. 免疫蛍光
<ol><li>細胞をPBS 3xで洗い、室温で10分間PBで4%PFAで固定します。</li>
	<li>固定細胞をPBで3 x 5分洗い、0.1%トリトンX-100をPBで10〜15分間透過させ、PB 3 x 5分で洗浄します。</li>
	<li>室温で1時間PBで5%正常ヤギ血清(NGS)を有する細胞をブロックする。</li>
	<li>一次抗体で細胞をインキュベートする:微小管関連タンパク質2(MAP2A、1:500)のニューロ-2a細胞またはグリア細動酸性タンパク質(GFAP、1:500)の一次アストロサイトの一次アストロサイトの新鮮な5%NGS/PBの一晩穏やかな揺れを伴う。</li>
	<li>PBで3 x 10分を洗浄し、5%NGSでフルオロフォア共役二次抗体(ヤギアンチマウスIgG1、アレクサフルオール594;またはヤギアンチマウスIgG H&L、アレクサフルーター488)を追加し、ロッカーの室温で2時間インキュベートします。</li>
	<li>3 x 10分をPBで洗浄し、1 μg/mLの核染色4',6-ジミディノ-2フェニリンドール(DAPI)を室温で10分間インキュベートします。PBで細胞を再び3倍洗います。</li>
	<li>アンチフェードマウントメディアを使用して、カバーリップを#1スライドに取り付けます。暗闇の中で一晩乾燥させ、共焦点顕微鏡でイメージングするまで4°Cで準備されたガラススライドを保管します。</li>
</ol>8. インビボ の取り込み
<ol><li>5 μgの非標識または標識されたsEVを10 μLのPBSに再懸濁し、または等容積(10 μL)の色素制御(セクション3で作成)をC57BL/6マウスに注入します。</li>
	<li>sEvの6時間および18時間後に、ケタミンの100mg/kg体重および10mg/kg体重のキラジンの腹腔内注射によってマウスを深く麻酔する。</li>
	<li>血液を洗い流すために0.9%生理食音でマウスの心内灌流を行い、続いて作りたての氷冷4%PFA/PBを行う。</li>
	<li>脊髄を解剖し、4°Cで4%PFA/PBに24時間固定する。PB中の30%スクロースで24時間または組織が沈むまで4°Cで組織を凍結保護します。免疫組織化学まで4°Cで組織を保管してください。</li>
</ol>9. 免疫検査
<ol><li>O.C T化合物にL4-L5脊髄を埋め込む。完全に固まるまでドライアイスで凍結します。</li>
	<li>クライオスタットを使用して30μm(脊髄の断面)で組織を切り離し、PBを含む24ウェルプレートにセクションを集める。PBで0.3%トリトンでセクション3 x 5分を洗います。</li>
	<li>5%NGSを有する非特異的結合部位を0.3%のトリトン/PBで2時間室温でブロックする。</li>
	<li>希薄な一次抗体:抗MAP2A(1:500)、GFAP(1:1,000)、Iba1(1:2,000)、0.3%トリトン/PBで5%NGSを有し、シェーカー上の4°Cで一晩4°Cで切片をインキュベートする。</li>
	<li>セクション3 x 5分を0.3%トリトン/PBで洗浄し、二次抗体(ロバアンチラビットIgGアレクサフルオール488、1:500、またはヤギアンチマウスIgGアレクサフルオール488、1:500)を室温で2時間NGS/PBで2時間追加します。</li>
	<li>PBで3 x 5分洗浄し、DAPIの1μg/mLで室温で10分間インキュベートします。PBで3×5分のセクションを洗います。</li>
	<li>細かい絵筆を光顕微鏡で、清潔な粘着スライド(材料表)に取り付けます。</li>
	<li>取り付け媒体でカバースリップを濡らします。室温で暗闇の中で一晩硬化します。</li>
	<li>それぞれのレーザーを用いて共焦点顕微鏡の下での画像。</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示する利益相反はない。

このプロトコルでは、PKH色素によるsEVの標識と脊髄におけるそれらの取り込みの視覚化を示した。PKHの親油性蛍光色素は、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡による細胞の標識に広く用いられている3,5,6,12,24,25.比較的長い半減期と低い細胞毒性のために、PKH色素は、生体内およびインビトロ細胞追跡研究26、27の広い範囲に使用することができる。膜保持性と生化学的安定性に優れているが、sEVで精製されたリポタンパク質汚染物質を用いた蛍光プローブのインターカレーションは、sEVの内部化およ...

小細胞外小胞(sEV)は、50〜150nmのサイズ範囲を有するナノサイズの膜由来小胞である。それらはマルチ・シツル体(MVB)に由来し、MVBと原形質膜の融合時に細胞から放出される。sEVは、miRNA、mRNA、タンパク質、および生理活性脂質を含み、これらの分子は細胞間で細胞間通信の形で伝達される。sEVは、さまざまなエンドサイトー経路によってレシピエント細胞によって内部化することができ、そしてこのレシピエント細胞によるsEVの捕捉は、EVと標的細胞の両方の表面分子の認識によって媒介される1。
sEVは、アクセプター細胞の分子および表現型の変化を引き起こす能力、治療剤としての有用性、および貨物分子または薬理学的薬剤のキャリアとしての可能性のために関心を集めています。そのサイズが小さいため、sEvのイメージングとトラッキングは、特に 生体内 研究や臨床現場では困難です。したがって 、vitro および in vivo2でのバイオディストリビューションと追跡を支援するために、多くの方法が開発され、sEVを画像化しています。
sEV生体分布と標的細胞相互作用を研究する最も一般的な技術は、蛍光色素分子3、4、5、6、7でそれらを標識することを含む。EVは、最初は細胞を画像化するために一般的に使用された細胞膜色素で標識されました。これらの蛍光色素は、一般に、sEv上の目的とする脂質二重層またはタンパク質を染色する。いくつかの親油性染料は、DiR(1,1′-dioctadecyl-3,3,3′、3'テトラメチル酸トリカルボシアニンヨウ化物)、DiL(1、 1′-ジオクタデシル-3,3,3′,3',3'テトラメチル中カルボシアニン過塩素酸塩)およびDiD(1,1′ジオクタデシル-3,3,3,3-テトラメチルインドカルボシアニン4-クロロベンゼンスルホナテン酸塩)8,9,10,11.
PKH67やPKH26などの他の親油性染料は、蛍光性の高い極性ヘッド基と、任意の脂質構造に容易に補間し、長期の色素保持および安定な蛍光12をもたらす長い脂肪族炭化水素尾を有する。PKH色素はまた、VIVO13でEV特性の研究を可能にするEVにラベルを付けることができます。他の多くの色素は、脂質標識染料14およびカルボキシフルオレセインジアセテートスクシニミジルエステル(CFDA-SE)15、16およびカルセインアセトキシメチル(AM)エステル17のような細胞透過性染料を含む、蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーを用いてエキソソームを観察するために使用されてきた。
CNSにおける異なる細胞間のsEV媒介性クロストークの研究は、神経炎症性および神経変性疾患の病因に関する重要な洞察を提供した。例えば、ニューロンからのsEVは、β-アミロイドペプチドおよびリン酸化タウタンパク質を広め、アルツハイマー病19の病因を助けることができる。さらに、赤血球由来のEVは、大量のα-シヌクレインを含み、血液脳関門を越え、パーキンソン病変20に寄与する。sEVが生理学的障壁21 を横断し、生体分子を標的細胞に移す能力は、治療薬をCNS22に送達するための便利なツールとなる。
脊髄内の無数のCNS細胞によるsEV取り込みの視覚化は、様々な細胞源からの外因的に投与されたSEvの治療上の利点の評価と共に、機械学的研究を可能にする。本論文では、マクロファージ由来のsEvにラベルを付け、ニューロン、ミクログリア、アストロサイトによる腰椎脊髄における インビトロ および インビボで の取り込みを画像化し、可視化によるsEV送達を定性的に確認する方法論を説明する。

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra 0.5 mL 遠心フィルター</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z677094</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Alix Antibody Abcam</td><td></td><td>ab186429</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-Calnexin 抗体</td><td>Abcam</td><td>Ab10286</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-CD81 Antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-166029</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH Monoclonal Antibody (14C10)</td><td>Cell Signalingテクノロジー</td><td>2118</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>抗グリア線維性酸性タンパク質抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB360</td><td>IF用 1:500; IHC抗IBA1抗体 1:1000</td></tr><tr><td></td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>1:2000</td></tr><tr><td>抗MAP2A抗体</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MAB378</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>VWR</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>セルストレーナー、40 &mu;m</td><td>VWR</td><td>15-1040-1</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離管</td><td>Thermo Scientific</td><td>3118-0050</td><td>12,000 x g</td></tr><tr><td>カバーガラス、12-mm、#1.5</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72230-01</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス、18-mm、#1.5</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>、Sigma-Aldrich</td><td>D9542-1MG</td><td>1 & マイクロ;g/mL</td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0116</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ I (DNAse I)</td><td>MilliporeSigma</td><td>D4513-1VL</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab16284</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>ロバ アンチウサギ IgG H&L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21206</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Double Frosted Microscope Slides, #1</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-552-5</td><td></td></tr><tr><td>DPBS without Calcium and Magnesium</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Exosome-Depleted Fetal Bovine Serum</td><td>Gibco</td><td>A27208-01</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清(FBS)</td><td>Corning</td><td>35-011-CV</td><td></td></tr><tr><td>FluorChem Mイメージングシステム</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FV3000 共焦点顕微鏡</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP)</td><td>Abcam</td><td>ab6789</td><td>1:10000</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG H&L, Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11001</td><td>1:500</td></tr><tr><td>ヤギ抗マウスIgG1, Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-21125</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>VWR</td><td>02-0121</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>HRP Substrate</td><td>Thermo Scientific</td><td>34094</td><td></td></tr><tr><td>Intercept blocking buffer, TBS</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>927-60001</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli SDS Sample Buffer</td><td>Alfa Aesar</td><td>AAJ61337AC</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glass, #1</td><td>VWR</td><td>48404-454</td><td></td></tr><tr><td>Microm HM550</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NS300 system</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight NTA 3.2 software</td><td>Malvern Panalytical</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neuro-2a Cell Line</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>NC9597281</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19210</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>PKH26</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI26-1KT</td><td></td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>MINI67-1KT</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤</td>カクテル <td>Thermo Scientific</td><td>1862209</td><td></td></tr><tr><td>PVDF 転写膜</td><td>MDI</td><td>SVFX8302XXXX101</td><td></td></tr><tr><td>RAW 267.4 細胞株</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>バッファーSigma-Aldrich</td><td>R0278</td><td></td></tr>塩化<tr><td>ナトリウム</td><td>AMRESCO</td><td>0241-2.5KG</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロストプラスゴールドスライドThermo</td><td>Scientific</td><td>15-188-48</td><td>接着剤スライド</td></tr><tr><td>T-75フラスココー</td><td>ニング</td><td>431464U</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai12デジタル透過電子顕微鏡</td><td>FEI会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Grids</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>FSF300-cu</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Protein Gel, 12%</td><td>Invitrogen</td><td>XP00120BOX</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine SDS Running Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC26755</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Glycine Transfer Buffer</td><td>Invitrogen</td><td>LC3675</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td>cell dissociation enzyme</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327371000</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, 0.25%</td><td>Corning</td><td>25-053-CL</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>超遠心チューブ</td><td>Beckman</td><td>344058</td><td>110,000 x g</td></tr></tbody></table>

蛍光標識小細胞小胞の取り込み と 脊髄における

Uptake of Fluorescent Labeled Small Extracellular Vesicles In Vitro and in Spinal Cord

小細胞外小胞(sEV)は、全ての細胞によって分泌され、体液中に存在する50〜150nmの小胞である。sEVは、RNA、タンパク質、脂質などの生体分子をドナーからアクセプター細胞に移し、細胞間の主要なシグナル伝達メディエーターを作ります。中枢神経系(CNS)では、sEVは神経免疫相互作用を含む細胞間シグナル伝達を媒介することができる。sEV機能は 、in vitro と in vivoの両方のレシピエント細胞におけるラベル付きSEVの取り込み追跡によって研究することができます。本論文では、PKH膜色素を用いたRAW 264.7マクロファージ細胞のコンディション媒体からのsEVの標識について説明する。これは、Neuro-2a細胞と一次アストロサイトによって複数の時点で標識されたSEVの異なる濃度の取り込み を示しています。また、共焦点顕微鏡で可視化されたマウス脊髄ニューロン、アストロサイト、およびミクログリアでの脳内に送達されたsEVの取り込みも示されている。代表的な結果は、異なる細胞によるsEvの取り込みにおける時間依存的な変動を示し、脊髄へのsEv送達の成功を確認するのに役立つ。

遠心分離を介してRAW 264.7コンディショムドメディアからsEvを分離した後、NTAを使用して精製されたSEVの濃度およびサイズ分布を決定しました。RAW 264.7由来のsEVの平均平均サイズは140nmであり、ピーク粒子サイズは121.8nmであり、光散乱測定における最も検出可能な粒子が50〜150nmのエキソソームまたはsEvのサイズ範囲内に収まっていることを確認した(図1A)。細胞外小胞2018(MISEV2018)23の研究のための最小限の情報で示唆されているように、我々は、異なるEV集団から存在または除外されるべきタンパク質のセットを分析した。sEV、細胞ライセート、およびエキソ枯渇培地のウェスタンブロッティングは、sEV由来タンパク質サンプルにsEVマーカータンパク質アリックス、CD81、GAPDHが含まれていることを実証した。細胞ライセート分率を、sEVに存在しなかった小胞体含量タンパク質、カルネキシンで濃縮した。したがって、カルネキシンは細胞汚染の陰性マーカーとして役立った(<strong class="xf...

マクロファージ由来の小細胞外小胞にPKH色素を標識し、髄腔内送達後の インビトロ および脊髄での取り込みを観察するプロトコルについて述べています。

Small extracellular vesicles (sEVs) are 50-150 nm vesicles secreted by all cells and present in bodily fluids. sEVs transfer biomolecules such as RNA, ...

脊髄内の異なる細胞によるsEvとも呼ばれる小さな細胞外小胞の取り込みも視覚化することで、sEVの正常な送達を確認できる。これにより、ローデンモデルの様々なソースから、子宮内投与されたsEvの機械学的および治療的研究が可能になります。このプロトコルは、軽度の脊髄内の細胞によるsEV取り込みを視覚化するために使用することができ、脊髄障害、痛みおよび炎症におけるsEVとその貨物分子の役割を評価するのに役立ちます。この手順は、私が、スアン・ルオ・ア・nd・ジュチェン・リン博士の研究室の2人の大学院生と共に実証されます。12ウェルプレートに18ミリメートルのカバースリップを入れてから始め、10%FBSと1%ペンストレップを含む完全なDMEMの合計1ミリリットルで各ウェルにニューロ2a細胞をプレートします。細胞数の流暢度が80〜90%に達すると、各ウェルのDMEMエキソソーム枯渇培地に培地を変更し、標識されたSEVの1、5または10マイクログラムを追加します。1時間、4時間、24時間。色素制御の等容積でウェルの残りの部分への用量および時間依存の取り込みのため。60ミリメートルで出生後の子犬の脳を収集し、氷冷ハンクスバランス塩溶液を含むペトリ皿は、10ミリモルヘップを補い、皮質葉の両方を解剖し、髄歯を取り除きます。その後、殺菌されたブレードで組織をミンチします。ペパネまたはデオキシリボ核1つの解離バッファーを含む15ミリリットルの円錐管に組織を移し、摂氏37度で20分間インキュベートし、5分ごとにチューブを渦巻き、上清を吸引し、5ミリリットルの完全なDMEMをチューブに加えます。酵素活性を不活性化するには、5ミリリットルガラス血清ピペットと炎磨き牧草地ピペットで組織を解化するために慎重に評価してみてください。細胞懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーを通し、250倍Gの細胞を摂氏4度で5分間遠心分離し、培地を吸引し、75平方センチメートルのフラスコで完全なDMEMの10ミリリットルの細胞を見る。めっきの4時間後、上天性および培地を15ミリリットルの新鮮なDMEM培地に交換してください。ビトロで14日後にミクログリアとオリゴデンドロサイトを取り外し、フラスコを320RPMで6時間軌道シェーカーに移す。5ミリリットルの細胞解離酵素を摂氏37度で10分間使用してください。トリップインするには、残りのアストロサイトを、酵素作用を不活性化するために、5ミリリットルの完全なDMEMを加え、250倍Gで細胞を4°Cで5分間ペレットする。完全なDMEMで細胞を再懸濁し、24ウェルプレートの12ミリメートル番号1.5カバースリップのセルを見ます。PBSを使用して細胞を3回リンスし、室温で10分間PBSで4%のパワーホルムアルデヒドまたはPFAでそれらを固定します。固い細胞をPBSで5分間3回洗浄し、PBSで0.1%トリトンX 100を10〜15分間透過させます。その後、PBSでの使用を繰り返します。PBSで5%正常ヤギ血清またはNGSを室温で1時間使用して細胞をブロックし、GFAP抗体を用いたニューロ-2a細胞とGFAP抗体の一次アストロサイトを、新鮮な5%NGSで1〜500比または穏やかな揺れを伴う摂氏4度のPBSで一晩インキュベートする。細胞をPBSで3回洗浄した後、5%NGSにフルオロフォア共役二次抗体を加える。ロッカーの光から保護された室温で2時間インキュベートします。PBSで洗浄を繰り返し、室温で10分間、DAPIの1ミリリットルあたり1マイクログラムで細胞をインキュベートします。もう一度、PBSで細胞を3回洗います。アンチフェードマウント媒体を使用して、カバースリップをナンバー1スライドに取り付け、暗闇の中で一晩乾燥させ、コンフォーカル顕微鏡でイメージングするまで準備されたガラススライドを摂氏4度で保存します。脊髄を解剖し、24時間摂氏4度でPBSで4%PFAに固定します。前にPBSで30%スクロースの組織を24時間、または組織が沈むまで摂氏4度で保存し、免疫組織化学になるまで摂氏4度で保存し、Oct化合物でL4 L5脊髄を浸透させ、完全に固まるまでドライアイスで凍結する前に行う。クライオスタットを使用して30マイクロメートルで組織を切り離し、PBSを含む24ウェルプレートにセクションを収集します。セクションをPBSで0.3%トリトンでそれぞれ5分間3回洗浄し、室温で2時間0.3%トリトンPBSで5%MGSを使用して非特異的結合部位をブロックします。シェーカーで摂氏4度で一晩セクションをインキュベートします。セクションをPbsで0.3%トリトンで5分間3回洗浄します。次に、二次抗体の適切な濃度を加える。テキスト原稿によると、室温で2時間インキュベートし、PBSのみを使用して切片を洗浄し、室温で10分間、DAPIの1ミリリットルあたり1マイクログラムでインキュベートする。次に、PBSを軽顕微鏡で繰り返し、細かいペイントブラシで透明な粘着スライドにセクションを取り付けます。取り付け媒体でカバースリップを湿らせ、室温で暗闇の中で一晩硬化し、それぞれのレーザーで共焦点顕微鏡下で画像を取得し、RA2 6 4 0.7誘導sEVの平均平均サイズは140ナノメートルであり、ピーク粒子径は121.8ナノメートルであった。エキソソームまたはsEVSのサイズ範囲内に入る最も検出可能な粒子と。50~150ナノメートルで、sEv、細胞リサートおよびエキゾ枯渇した培地のウェスタンブロッティングは、sEV由来タンパク質サンプルにsEVマーカータンパク質Alix CD81およびGAPDHが含まれていることを実証した。細胞リセートを小胞体で濃縮し、居住タンパク質カルネキシンはこのようにカルネキシンは、sEVに存在しなかった細胞汚染の陰性マーカーとして機能した。sEvの取り込みは1時間で起こり、1、5、10マイクログラムのsEVでは、4時間、4、5、10マイクログラムのsEvで蛍光後を検出できることが観察された。第一次アストロサイトによるPKH26標識sEvの取り込みを検討し、PKH26標識sEVが24時間に起こり、6時間で最大蛍光が観察され、注射後の細胞アストロサイトおよびミクログリア細胞におけるsEVから最大蛍光が生じた。コントロール、ラベルなしのSEV、染料を含めることで、アンバウンド染料パッチコーストのOpry danceの特定のラベリングにより、最近の風偽陽性信号にコードを作成します。seVの取り込みは、レシピや細胞、組織への生体分子貨物の移動を調査し、生体分子や標的遺伝子の発現レベルの変化を決定することによって確認することができます。行動研究も行い、sEV送達の機能的影響を調べることができる。

uptake-fluorescent-labeled-small-extracellular-vesicles-vitro-spinal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

我々は、ニューロンまたはポリエチレン吸引ピペットを使用して、任意の神経管に蛍光カルシウム感受性色素を高濃度に導入するための簡単​​かつ低コストの手法を説明します。...

神経、地帯、および蛍光色素で脊髄根の逆行ローディング

このビデオでは、細胞外小胞またはEVの細胞内取り込みを視覚化し定量化するアッセイを実演します。このアッセイは、共焦点顕微鏡を用いた3D蛍光イメージングを利用し、細胞表面に付着したEVと内在するEVを区別することができます。...

細胞外小胞取り込みアッセイ:3D蛍光イメージング技術を使用して細胞外小胞の細胞取り込みを可視化および定量化する方法

このビデオでは、ニューロン小胞が特定の蛍光タンパク質で標識され、その動きを視覚化する方法を示しています。まず、蛍光タンパク質をコードするプラスミドをトランスフェクション剤とインキュベートし、次にニューロンの培養物に導入します。その後、ニューロンの画像を取得して分析し、小胞の動きを追跡します。...

蛍光イメージングによるニューロンの小胞運動の可視化

マウス脊髄を撮像するための新規のex vivo調製。このプロトコルは、脊髄全体生細胞の相互作用の二光子イメージングを可能にする。...

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169...

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

この作品は、熱帯熱マラリア原虫感染赤血球によるリリース細胞小胞 (Ev) の役割を調査するプロトコルについて述べる.特に、我々 は EVs...

マラリア感染時の細胞の小胞の機能評価

ここでは、変形性関節症のモデルとして使用される軟骨外植の移動および取り込みをモニタリングするために、血小板リセート由来の細胞外小胞にラベルを付けるプロトコルを提示する。...

軟骨外植木における移動と取り込みモニタリングのための細胞外小胞の標識

シナプス伝達に必要な細胞内事象を視覚化するために、2つの関連する方法が記載されている。これらのプロトコルは、 in vitro...

筋萎縮性側索硬化症のモデルにおけるシナプス機能のリアルタイム蛍光測定

細胞外小胞(EV)は細胞生物学と細胞間コミュニケーションに貢献します。細胞の取り込みEVを可視化・定量化するための実用的なアッセイが必要です。現在のプロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスによるEV単離に続く共焦点顕微鏡 による 3次元蛍光イメージングを利用してEV取り込みアッセイを提案している。...

共焦点顕微鏡イメージング解析による細胞外小胞取り込みアッセイ

このビデオでは、E13ラット背側脊髄から交連神経細胞を細かく分析し、文化に方法を示しています。解離交連ニューロンの軸索成長とガイダンスの細胞および分子メカニズムを研究するのに便利です。...

胚の脊髄から交連ニューロンの解剖と文化

学ぶ蛍光標識された小細胞外小胞の脊髄細胞への取り込み可視化法。神経細胞とアストロサイトを用いたin vitroおよびin vivo実験により、疼痛と炎症における治療的応用可能性を評価します。

蛍光標識小細胞小胞の取り込みと脊髄における

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蛍光標識小細胞小胞の取り込み と 脊髄における

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蛍光標識小細胞小胞の取り込みと脊髄における