Name: マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 42 s
Description: 学ぶマイクロ流体デバイスを用いた3Dヒト心臓組織の作製法。hiPSC由来心筋細胞と線維芽細胞をコラーゲンハイドロゲルで包埋し、楕円形マイクロポストで配向を誘導することで、生体心筋に類似した異方性組織を構築します。

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#1653193 NSF CAREERアワード、アリゾナ生物医学研究委員会(ABRC)新調査官賞(ADHS18-198872)、このプロジェクトの資金源を提供してくれたフリン財団賞に感謝します。hiPSCラインSCVI20は、NIH R24 HL117756が出資するスタンフォード心臓血管研究所のジョセフ・C・ウー博士(MD)から入手しました。HiPSCライン、IMR90-4は、WiCell研究所55、56から得られました。

著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

細胞と細胞の相互作用が強化された生体外ヒト心臓組織モデルの形成とバイオミメティック3D構造は、基礎的な心血管研究および対応する臨床応用のために不可欠である。この概説されたプロトコルは、コラーゲンヒドロゲル内にカプセル化された結合性CFを有する幹細胞由来CMの共培養を用いて、天然心筋の複雑な細胞組成および構造をモデル化する役割を果たし、マイクロ流体装置内の3Dヒト異方性心臓組織の開発を説明する。この特定のプロトコルは、ラット由来の心臓細胞とヒト幹細胞分化CMの両方から3D異方性心臓組織形成のために最適化され、検証された装置の特定の構造が、hESCから、そして2種類のhiPSC(SCVI20およびIMR90-4)のために高度に再現可能である20。我々は、他の多くのグループの中で、幹細胞のCM分化の効率が細胞株35、36の間で変化することを発見した。実装された精製プロトコルは、分化収率を上げるのに役立ちます。しかし...

組織工学的アプローチは広く探求されており、近年、再生医療および疾患モデリング1,2における生体内臨床所見に付随する。特に、ヒト原発性心臓組織を調達し、生理学的に関連する生体内サロゲートを産生する際の固有の困難のために、インビトロ心臓組織モデリングに重点が置かれていたので、心血管疾患(CVD)1,3の複雑なメカニズムの基本的な理解を制限する。従来のモデルは、しばしば2D単層培養アッセイを含む。しかし、心筋のネイティブな風景と複雑な細胞相互作用の両方を模倣するために3D環境内で心臓細胞を培養することの重要性は、4,5を大きく特徴づけられてきた。さらに、これまでに生産されたほとんどのモデルには、幹細胞から分化したCMの単一培養が含まれています。しかし、心臓は複雑な3Dアーキテクチャ7内の複数の細胞タイプ6で構成され、3D in vitroモデル内の組織組成の複雑さを改善し、ネイティブ心筋の細胞構成体をよりよく模倣する重要な必要性を保証する。
現在までに、多くの異なるアプローチが心筋8のバイオミメティック3Dモデルを生成するために探求されてきた。これらのアプローチは、生成された力のリアルタイム計算を可能にする実験的なセットアップから、薄膜に播種されたモノカルチャーCM(筋肉薄膜(MTFとみなされる)9)から、自立性カンチレバー(設計心臓組織(EHT))の間に浮遊する3Dヒドロゲルマトリックスの心臓細胞の共培養まで多岐にわたる。他のアプローチは、心筋異方性を模倣するマイクロモールディング技術の実施に焦点を当て、組織パッチ11内の突出マイクロポストの間に浮遊する3Dヒドロゲル中の単培養CMから、インデントマイクログルーブ12、13の間に播種された単一培養CMに。これらの方法のそれぞれに固有の長所と短所があり、したがって、意図された適用および対応する生物学的問題と一致する技術を利用することが適切である。
幹細胞由来のCMの成熟を高める能力は、成人様心筋組織の正常なインビトロ工学と、その後の知見を臨床解釈に翻訳するために不可欠である。このため、成熟したCMの方法は、2Dと3D14、15、16の両方で広く探求されてきました。例えば、EHTに組み込まれた電気刺激、表面地形によるCMの強制アライメント、シグナル伝達キュー、共培養からの成長因子、および/または3Dヒドロゲル条件などは、細胞形態、カルシウム処理、肉体構造、遺伝子発現、収縮力の少なくとも1つでCM成熟を支持する変化を招く。
これらのモデルのうち、マイクロ流体プラットフォームを利用するアプローチは、勾配の制御、限られた細胞入力、および最小限の必要な試薬など、本質的に一定の利点を保持します。さらに、多くの生物学的複製は、マイクロ流体プラットフォームを用いて一度に生成することができ、目的の生物学的機構をより良く解剖し、統計的パワー17、18、19を支持して実験サンプルサイズを増加させる役割を果たすことができる。さらに、マイクロ流体デバイスの製造プロセスでフォトリソグラフィーを使用すると、微細およびナノレベルでの正確な特徴(例えば、地形)を作成することができ、これは、組織再生および疾患モデリングにおける異なる用途に対して、周囲の細胞構造およびマクロレベル組織アーキテクチャ18、20、21、22を強化するメソスコピックキューとして機能するマイクロレベルおよびナノレベルでの正確な特徴を作成する。
我々は、先ず、表面地形を組み込んだ新規3D心臓組織オンチップモデルの開発を実証し、自然楕円形のマイクロポストの形態で、ヒドロゲルカプセル化された共培養心臓細胞を相互接続された異方性組織20に整列させた。培養の14日後、マイクロ流体デバイス内に形成された組織は、単層および3D等方性対照23と比較した場合に、その表現型、遺伝子発現プロファイル、カルシウム処理特性、および医薬応答においてより成熟している。本明細書に記載されているプロトコルは、この3D共培養を作成するための方法を概説し、 hiPSC由来のCMを用いたマイクロ流体装置内のヒト心臓組織(すなわち異方性)を具体的に説明する具体的には、HIPSCをCMに向けて区別および精製し、確立された共培養集団を産生するためにCMを用いてhCFを補充し、コラーゲンハイドロゲル内にカプセル化した細胞集団をマイクロ流体デバイスに挿入し、その後の3D組み立てられたtf結果として得られた3D工学的マイクロ組織は、基礎生物学研究、CVDモデリング、医薬品試験など、さまざまな用途に適しています。

<table><tbody><tr><td>0.65 mL 遠心分離管</td><td>VWR</td><td>87003-290</td><td></td></tr><tr><td>1 mm 生検パンチ</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm 生検パンチ</td><td>VWR</td><td>95039-088</td><td></td></tr><tr><td>15 mL ファルコンチューブ</td><td>VWR</td><td>89039-670</td><td></td></tr><tr><td>18x18mm カバーガラス</td><td>VWR</td><td>16004-308</td><td>カバーガラスは、高倍率イメージング</td></tr><tr><td>を可能にするために、No.1である必要があります4% パラホルムアルデヒド</td><td>ThermoFisher</td><td>101176-014</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェル フラット ボットム組織培養プレート</td><td>VWR</td><td>82050-844</td><td></td></tr><tr><td>B27 マイナス インスリン</td><td>LifeTech</td><td>A1895602</td><td></td></tr><tr><td>B27 プラス インスリン</td><td>LifeTech</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>CHIR99021</td><td>VWR</td><td>10188-030</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I、ラットテール</td><td>コーニング</td><td>47747-218</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F12</td><td>サーモフィッシャー</td><td>11330057</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>サーモフィッシャー</td><td>21600069</td><td></td></tr><tr><td>E8</td><td>サーモフィッシャー</td><td>A1517001</td> 自社製<td>も可能</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>VWR</td><td>45001-122</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FGM3</td><td>VWR</td><td>10172-048</td><td></td></tr><tr><td>GFR-マトリゲル</td><td>VWR</td><td>47743-718</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Σ</td><td>G8898-500G</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ血清</td><td>VWR</td><td>10152-212</td><td></td></tr><tr><td>hESC-マトリゲル</td><td>コーニング</td><td>BD354277</td><td></td></tr><tr><td>IPA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IWP2</td><td>Σ</td><td>I0536-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>VWR</td><td>82003-820</td><td></td></tr><tr><td>MTCS Σ</td><td></td><td>440299-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>シグマ</td><td>S5881-500G</td><td></td></tr><tr><td>ペン/連鎖球菌</td><td>VWR</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿(150x15mm)</td><td>VWR</td><td>25384-326</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿(60x15mm)</td><td>VWR</td><td>25384-092</td><td></td></tr><tr><td>フェノールレッド</td><td>シグマ</td><td>P3532-5G</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>サーモフィッシャー</td><td>MT10040CM</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 マイナスグルコース</td><td>VWR</td><td>45001-110</td><td></td></tr><tr><td>シリコンウェーハ (100mm)</td><td>大学ウェーハ</td><td>1196</td><td></td></tr><tr><td>乳酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>L4263-100ML</td><td></td></tr><tr><td>SU8 2075</td><td>Microchem</td><td>Y111074 0500L1GL</td><td></td></tr><tr><td>SU8 現像液</td><td>サーモフィッシャー</td><td>NC9901158</td><td></td></tr><tr><td>シルガード エラストマー</td><td>エセックス ブラウネル</td><td>DC-184-1.1</td><td></td></tr><tr><td>T75 フラスコ</td><td>VWR</td><td>82050-856</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100</td><td>シグマ</td><td>T8787-100ML</td><td></td></tr><tr><td>トリプル</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12604021</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA (0.5%)</td> <td>サーモフィッシャー</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>シグマ</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>幹細胞技術</td><td>72304</td><td></td></tr><tr><td>EVG620 アライナー</td><td>EVG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プラズマクリーナー PDC-32G</td><td>ハリック プラズマ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ツァイス AxioObserver Z1 顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ライカ SP8 共焦点顕微鏡</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マイクロ流体プラットフォーム内での3d組織化ヒト心臓組織の開発

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

世界的に主要な死因は心血管疾患(CVD)として持続する。しかし、心筋の生理学的および生物学的複雑さをモデル化することは、心筋、 インビトロ で達成することは悪名高い困難である。主に、障害は、大人であるか、または成人のような型を示し、心筋の細胞複雑さと複雑な3Dアーキテクチャをうまく再現できる人間の心筋細胞(CM)の必要性にあります。残念ながら、倫理的な懸念と利用可能な一次患者由来のヒト心臓組織の欠如のために、CMの最小限の増殖と組み合わせることで、実行可能なヒトCMの調達は心臓組織工学の限界ステップであった。この目的のために、ほとんどの研究はヒトCMの主要な供給源としてヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)の心臓分化に移行し、心臓組織モデリングのための インビトロ アッセイ内にhiPSC-CMを広く組み込むことになった。
本研究では、マイクロ流体装置内で3D成熟した幹細胞由来ヒト心臓組織を開発するためのプロトコルを示す。HiPSC由来のCMから3D インビトロ 異方性心臓組織オンチップモデルの生産を具体的に説明し、視覚的に実証する。我々は、主にCMに対して選択する精製プロトコル、ヒトCF(hCF)とCMを混合することによって定義された比率を有する細胞の共培養、およびコラーゲンベースのヒドロゲル内でのこの共培養の停止を記述する。我々はさらに、周囲の細胞とヒドロゲルマトリックスの高度な整列を誘導する表面地形として機能するずらした楕円マイクロポストを埋め込んだ、明確に定義されたマイクロ流体装置内の細胞を含むヒドロゲルの注入を実証し、天然心筋のアーキテクチャを模倣する。我々は、提案された3D異方性心臓組織オンチップモデルが基礎生物学研究、疾患モデリング、およびスクリーニングツールとしての使用を通じて、医薬品試験に適していると考える。

HIPSCから高精製されたCMの集団を得るために、Lian分化プロトコル33 とトーヤマ精製ステップ34 の組み合わせを含む改変バージョンが使用される(実験タイムラインについては 図1A を参照)。ヒポプサはコロニー様で、〜85%コンフルエントで、CM分化の開始時に、通過の3〜4日後に文化全体に均等に広がる必要があります(図1B)。具体的には、0日目には、hiPSCコロニーはSOX2およびNanogを含む多能性転写因子の高い発現を有するべきである(図1C)。このプロトコルに基づいて、幹細胞の分化と精製プロセスが成功した証拠が 図1Dで実証され、CMの密なコロニーが肉体αアクチニンを発現し、周囲の非CMを最小限に抑えている。さらに、hCFは高いビメンチン発現を有する線維芽細胞形態を維持しなければならない(<s...

このプロトコルの目的は、生体整血、コラーゲンベースのヒドロゲル、心臓組織工学、薬物スクリーニング、および疾患モデリングにおける応用のために、心臓線維芽細胞(CF)と共培養された幹細胞由来心筋細胞で構成される、高度に整列したヒト心臓組織の三次元(3D)微小流体モデルの開発を説明し、実証することである。

マイクロ流体プラットフォーム内での3D組織化ヒト心臓組織の開発

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...

心血管疾患は、世界中で死亡の第一の原因です。従来のインビトロモデルは、単層文化に依存しています。しかし、心臓、具体的には心筋または心筋は、その3D異方性および細胞組成において複雑である。したがって、細胞構成成分と心筋の構造の両方をよりよく模倣するために、in vitroモデル内の組織組成の複雑さを改善することが重要です。本研究では、新規微小流体装置内での3D成熟幹細胞由来ヒト心臓組織の開発プロトコルを示す。この装置は、周囲のヒドロゲル内包心臓細胞の高い整列を誘導する自然楕円形のマイクロポストを備えた3Dメイン組織チャネルを組み込んでいます。メインチャネルは、組織全体に栄養拡散を可能にする注入ポートを備えたメディアチャネルによって横たわっています。マイクロ流体デバイスの取り扱いに必要なケアのために、このプロトコルの視覚的表現は、組織のアライメントを強化するためのマイクロポストが埋め込まれたマイクロ流体デバイス内に3D心臓組織を適切に確立するのに役立ちます。ヒト心筋線維芽細胞を解離するには、まずインキュベーターからフラスコを取り出す。バイオセーフティキャビネットの中に入れて、フラスコから使用済みのメディアを吸引し始めます。その後、3つのPBS 1XのMLを取り、フラスコを洗います。キャップを閉じ、底部がPBSで適切にコーティングされるようにフラスコを旋回します。PBSを吸引する。37度のトリプシンの3つのMLを取り、フラスコに追加します。その後、フラスコを傾け、底部が完全にコーティングされるように旋回します。その後、インキュベーターを4〜6分間入れます。3つのMLsを取り、フラスコにそれを追加することによって、FGM3でトリプシンを中和します。溶液を上下にピペットして、フラスコの背面に残っている細胞を取り除きます。15 MLファルコンチューブにセル懸濁液を回収します。細胞懸濁液を10マイクロリットル取り、ヘモサイトメーターで分配し、顕微鏡で細胞を数えます。250Gで細胞懸濁液を4分間遠心分離する。遠心分離後、上清を吸引し、細胞ペレットを乱さないよう注意する。新鮮なFGM3で細胞ペレットを再懸濁し、ML懸濁液あたり所望の7500万個の細胞を作ります。細胞を再サスペンドし、ゆるくフィットしたキャップでチューブを下に置きます。心筋細胞を解離するには、インキュベーターからプレートを取り出し、培地を吸引する。PBSの6つのMLを取り、各井戸にPBSのMLが1つあるように井戸を洗います。PBSを吸引し、プレートに取り付けた細胞を邪魔しないように注意する。6つのウェルプレートの各井戸に1つのMLがあるように、温めたtrypLE Expressの6つのMLを追加します。細胞をtrypLEで10分間インキュベートします。10分後、RPMIとB27プラスインスリンの6つのMLでtr

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Bioengineering

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