Name: 非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 42 s
Description: 学ぶAAVベクター注射法を用いた非ヒト霊長類脳の光遺伝学的操作。この正確な技術は、麻酔下および覚醒状態の両方で神経応答を誘導し、視覚処理における神経可塑性の理解に貢献します。

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この研究は、WaNPRC/ITHS P51OD010425(JTT)、国立衛生研究所(NIH)の助成金EY023277(YKの場合はR01)、EY030441(GHの場合はR01)、MH114126(RF1からJTT、Boaz Levi、Ed Lein)、MH120095(JTTおよびGHの場合はUG3)、EY028902(RSの場合はR01)の支援を受け、NIH助成金OD010425(WaNPRCの場合はP51)およびワシントン大学ロイヤルティ研究基金A148416によって可能になりました。著者らは、組織学のYasmine El-ShamaylehとVictoria Omstead、ウイルスベクタークローニングのRefugio Martinez、NHP脳組織処理の支援についてJohn Michに感謝したい。

すべての実験は、実験動物の世話と使用のためのガイドに従って実施され、実験動物資源研究所および実験動物管理国際評価認定協会が推奨する最小要件を超えました。すべての手順は、ワシントン大学の動物管理および使用委員会(UW IACUCプロトコル#4167-01)によって評価および承認されました。5匹の健康なマカク(2匹のマカ カムラッタ、3匹の マカカネメストリナ、オス、4〜11歳)がこの研究に参加しました。滅菌器具と技術は、すべての外科手術を通して使用されました。
1.カニューレを作る(図1A)
<ol><li>各部の準備<ol><li>皮下注射針(30 G、長さ13 mm)の先端をディスクグラインダーで鈍らせます。</li>
		<li>ステンレスチューブ(30G、内径=0.16mm、外径=0.31mm)を、対象の脳領域の深さに合わせた長さにカットします(大脳皮質の背側表面を注入するには25mmが適しています)。ディスクグラインダーを使用して、カットチューブの一方の端を面取りし、もう一方の端を滑らかにします。ブローチでチューブの内側をバリ取りします。</li>
		<li>ポリテトラフルオロエチレン(PFTE)チューブ(内径= 0.23 mm±0.02 mm、壁= 0.23 mm±0.02 mm、1 mmは42 nL±7 nLの流体に相当)を、ロードするベクター溶液の量に適した長さにカットします(1 μLのベクター溶液がチューブの24 mmを占めます)。PTFEチューブの両端を鈍い皮下注射針の挿入によりフレアする。</li>
	</ol></li>
	<li>鈍い皮下注射針をPTFEチューブの一端に約5mm挿入します。ステンレス鋼管の面取りされていない端をもう一方の端に約5 mm挿入します(図1A)。</li>
	<li>インジェクション前のテストを実行します。カニューレの皮下注射針ハブを通してろ過水を注入します。斜めのステンレス鋼管から先端から水が出て、どちらの接合部からも水が漏れていないことを確認します。</li>
</ol>2.麻酔をかけた動物のための注射手順
<ol><li>手術の準備<ol><li>材料表の手順を使用して手術器具および消耗品を滅菌します。</li>
		<li>必要に応じて、脳深部構造を標的にするために頭部MRIを採取します(図2A)。</li>
		<li>手術の直前に、ケタミン(10〜15 mg / kg)で動物を鎮静させ、抗生物質(セファゾリン)と鎮痛薬(徐放性ブプレノルフィンとメロキシカム)を筋肉内投与します。.次に、静脈内(IV)カテーテルを介して伏在静脈または頭静脈にプロポフォールを送達します。</li>
		<li>動物を挿管し、イソフルランガスに移行する。安定した心拍数、血圧、呼吸数、骨格筋の弛緩、眼瞼反射や離脱反射がないことで、適切な麻酔を確認します。</li>
		<li>動物の頭を剃ります。乾燥を防ぐために角膜に人工涙液軟膏を塗ります。</li>
	</ol></li>
	<li>注入領域の準備<ol><li>動物の頭を脳定位固定装置フレームに入れます。ガーゼスポンジで剃った皮膚に外科的スクラブ溶液を塗布し、穏やかな圧力を加えて破片を取り除き、イソプロピルアルコールですすいでください。このプロセスを3回繰り返します。動物を滅菌開窓ドレープで覆います。皮膚を切開し、筋肉を反映します。マニピュレーターを脳定位固定アームに置き、ターゲットの脳領域を狙うように配置し、滅菌したペンで頭蓋骨の開頭位置をマークします。</li>
		<li>定位固定マニピュレーターを取り外し、開頭術を行います。必要に応じて硬膜を切開します(例:溝のランドマークを視覚化するため)。マニピュレータを定位固定装置アームに戻します。</li>
	</ol></li>
	<li>ベクター溶液の負荷(図1C)<ol><li>ベクター溶液をP20ピペッターで滅菌したPCRチューブに、気泡を避けて静かに移します。</li>
		<li>斜めの先端を下に向けて、垂直方向の定位固定装置ホルダーにカニューレを取り付けます。1 mLルアーロックシリンジをカニューレの皮下注射針ハブに接続します。</li>
		<li>カニューレの斜角の先端をベクター溶液に浸します。 注意: シリンジはすでに取り付けられているはずです。この時点でそれを添付すると、ベクトル解に気泡が導入されます。</li>
		<li>1mlシリンジで穏やかな負圧を適用することにより、溶液をカニューレに入れます。溶液と空気の間のメニスカスを視覚的に追跡します。</li>
		<li>ベクター溶液がロードされたら、溶液がニードルハブに到達するまで穏やかな負圧を続けます。1 mLシリンジを取り外し、着色されたミネラルオイルを皮下注射針ハブに注入します。 注意: オイルは、針ハブの内壁に沿ってゆっくりと注入して、ベクター溶液で透明なメニスカスを形成し、気泡を避ける必要があります。</li>
		<li>皮下注射針ハブを3方向ルアーロック活栓の2つの開いているポートの1つに取り付けます。 注意: 皮下注射針を閉じたポートに取り付けると、オイルの後ろに不要な空気圧が導入されます。</li>
		<li>皮下注射針ハブに接続されているポートを閉じ、1 mLシリンジに空気を入れて、他の2つのポートのいずれかに取り付けます。最後に、活栓の残りのポートを閉じて、シリンジをカニューレに接続します。</li>
		<li>カニューレにゆっくりと空気を押し込みます。PTFEチューブの鈍い針の先端に着色油が現れたら、溶液と着色油の間の空気を確認します。</li>
		<li>空気が存在する場合は、シリンジに負圧を加えて、着色されたオイルをニードルハブに戻します。気泡を取り除き、斜めのカニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで陽圧を適用します。</li>
		<li>1 mLシリンジを取り外してオイルの後ろの不要な空気圧を解放し、活栓を閉じて、ベクターが重力によってカニューレから出るのを防ぎます。</li>
		<li>プラスチック定規をPTFEチューブにテープで固定して、射出中のメニスカスの動きを測定します(図1B、D、F)。</li>
	</ol></li>
	<li>標的脳領域へのカニューレ挿入(図1B)<ol><li>カニューレを定位固定装置マニピュレーターに取り付けます。</li>
		<li>ポンプチューブ(ルアーロックコネクタで終端)を非滅菌アシスタントから外科医に手動で移します。外科医は、滅菌スリーブの壁を通してルアーロックコネクタをつかみ、2番目の滅菌活栓をコネクタに取り付け、スリーブをしっかりとテープで固定してから、スリーブのカラーを落とし、重力によってチューブに沿って伸びるようにする必要があります。</li>
		<li>カニューレチューブに取り付けられた活栓をエアポンプに取り付けられた活栓に接続します。エアポンプを低圧に設定して電源を入れ、オイルがカニューレを通って進み、カニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで圧力を上げます。</li>
		<li>PTFEチューブのプラスチック定規の位置を調整して、射出中のメニスカスの動きを測定します。</li>
		<li>定位固定装置マニピュレーターでカニューレを押し下げ、先端が表面(硬膜または軟膜)に到達する深さを記録します。</li>
		<li>カニューレを最も深い部位まで運転し、トラックに沿って注入します。表面がくぼみます。表面皮質を注入する場合は、可能であれば手術用顕微鏡または拡大ルーペを使用して、カニューレが表面に浸透していることを視覚的に確認します。</li>
		<li>組織の圧迫によるミスターゲティングを最小限に抑えるには、カニューレをゆっくりと(1 mm / min)、すばやく(0.5 mm / s)駆動し、下部で1〜5分間待つか、最も深い注入部位を500 μmオーバーシュートしてから引っ込めます。</li>
	</ol></li>
	<li>注射<ol><li>0.5 μLのベクター溶液を電動エアポンプで10〜30秒かけて注入します。PTFEチューブ内の着色油とベクター溶液の間のメニスカスを追跡して、注入の流れを確認します。</li>
		<li>1分間待ってから、カニューレをトラックに沿った次の注射部位に引き込みます。</li>
		<li>最後の注入後、ベクター流出を避けるためにカニューレを10分間そのままにします。</li>
		<li>カニューレを引っ込めて、バイオハザード鋭利物の容器に捨てます。</li>
		<li>オプションで、ベクター注入部位の近くに少量(≤1 μL)の蛍光マイクロビーズを注入して、死後の注入部位の識別を容易にします。</li>
		<li>他の場所にある他のベクトル解に対して、必要に応じてこの手順を繰り返します(図2B)。</li>
	</ol></li>
	<li>手術終了<ol><li>硬膜、筋肉、皮膚を縫合します。</li>
		<li>猿を脳定位固定装置フレームから取り外し、すべてのモニターケーブルを取り外します。</li>
		<li>サルをイソフルラン麻酔から外し、嚥下反射が戻った後に抜管します。.</li>
		<li>術後治療(3〜5日間のメロキシカムおよび7〜10日間のセファレキシン)を提供する。安定した直立座位を維持できるようになるまで、少なくとも10分ごとに動物を監視します。</li>
	</ol></li>
</ol>3.覚醒行動動物に対する手術とAAVベクター注入(図1D)
注:この技術の変形は、以下に説明するように、覚醒して行動するサルの脳に注射するために使用できます。
<ol><li>録音による同時注入<ol><li>注射部位での電気的活動を記録するには、カニューレの外側をエポキシ(底~15 mm)とポリイミドチューブ(残り長さ)でコーティングします。先端からエポキシをこすり落として、先端の金属を明らかにします(インジェクトロード、 図1F)2。あるいは、カニューレと別の細胞外電極を並べてダブルバレルガイドチューブに挿入します(ダブルバレルガイドチューブ、 図1E)。</li>
	</ol></li>
	<li>標的脳領域へのカニューレ挿入。<ol><li>サルを実験ブースに入れ、頭の動きを制限し、標準的な技術を使用して頭蓋に取り付けられた記録チャンバーを清掃します。</li>
		<li>ガイドチューブをマイクロドライブに固定します。注射カニューレをガイドチューブに挿入します。</li>
		<li>先端がガイドチューブから突き出るまでカニューレを進めます。</li>
		<li>活栓を電動エアポンプに接続します。システム機能の適正確認は、エアーポンプで先端からベクター溶液を一滴押し込み、オイルベクター溶液メニスカスの動きを確認します。</li>
		<li>カニューレをガイドチューブに~5mm引き出して、脳へのチューブ挿入中の損傷から保護します。ガイドチューブを脳に挿入します。</li>
		<li>マイクロドライブを使用して、注射する部位にカニューレを駆動します。電気記録(図2C)または刺激のいずれかによって標的部位を特定します。</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2.jpg"> 図1:手術と装置のセットアップ 。 (A)注射カニューレ。カニューレの各部分が示されています。右下の挿入図:カニューレ先端の拡大写真、スケールバー:500μm。 (B)麻酔をかけたサルの手術セットアップ。サルは外科用ドレープの下の定位固定装置フレームに入れられます。人工呼吸器(V)、静脈ライン(IV)、血圧計(BP)、および酸素飽和度モニター(O2)がサルに接続されている。注射カニューレは、定位固定装置マイクロマニピュレーターを用いて標的領域に挿入される。ベクター溶液は、エアコンプレッサー(左下の挿入図、青)に結合された電動エアポンプ(左下の挿入図、茶色)によって注入されます。プラスチック定規(上部挿入図)をPTFEチューブにテープで固定し、射出中の着色油(上部挿入図、赤色)とベクター溶液(上部挿入図、透明)の間のメニスカスの動きを測定します。(C)ベクター溶液をカニューレにロードするためのセットアップ。(D)実験ブースでベクター溶液を注入中のサル。動物の頭は3つの安定化ポストによって所定の位置に保持され、目の位置は強膜サーチコイルシステムによって記録されます。注入カニューレを保持し、微小電極ホルダー/ドライバーを使用してターゲットの深さまで駆動します。注入は、着色油とベクター溶液の間のメニスカスをUSBカメラを通して監視することによって制御される(挿入図)。(E)ダブルバレルガイドチューブインジェクション。ダブルバレルガイドチューブホルダー/ドライバーは、注射カニューレと微小電極を保持します(挿入図を参照)。(F)インジェクトロード。エポキシコートをこすることによって露出したカニューレの先端の金属は、ニューロンへの電気的アクセスを提供します(挿入図、スケールバー:500μm)。(G)レーザー刺激のセットアップ。ダブルバレルガイドチューブホルダー/ドライバーは、光ファイバーと微小電極の両方を保持します(挿入図を参照)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2.jpg"> 図2:AAV注射部位の図。 (A)マカカ・ネメストリナの一次運動野と一次視覚野の注射部位を示す脳矢状切片MR画像。(B)対応するアトラスプレートの背側表面からの眺めは、中央溝(一次運動皮質)および一次視覚野に対するカニューレの配置を示しています。(C)上丘への注入によるユニット記録。注入前に分離されたユニット(右上)は、注入後(右下)に消えました。(D)インジェクショントラック(白い矢印)。スケールバー:500μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
4. 組織学のための脳組織処理
<ol><li>導入遺伝子発現を最大化するために、注射後6〜8週間待ちます。 注:最適な持続時間は、実験で使用された正確なウイルスベクターによって異なります。</li>
	<li>従来の組織学的手法を使用して脳を処理し、形質導入効率と選択性を評価します5,6,7。</li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

NHPオプトジェネティクスの進歩により、正確で信頼性の高い頭蓋内注射法の必要性が生まれました。このレポートに記載されている方法の利点は、安価であり、滅菌可能で使い捨てのコンポーネントを使用し、あらゆる深さの多様な脳領域を標的にする能力があることです。また、エアバルブを制御できる速度により、噴射速度と量の制御も可能です。空気圧を一時的に上げて詰まりを取り除き、その後急速に下げて、持続的な圧力によって生成されるその後の過剰噴射を回避できます。使い捨て部品は、注入部位間の相互汚染のリスクを低減します。
この注入プロトコルの重要なステップには、高品質のカニューレを構築し、気泡を導入せずにそれらをロードし、互いに近すぎない注入部位を選択することが含まれます。通常、≥1 cm離れた注射は重複しない領域を形質導入しますが、このヒューリスティックはウイルスの血清型、力価、プロモーター、体積、標的、および検出方法に依存します。直接接続されていない注射部位を選択することで、軸索に沿ったオプシン輸送によって生じる潜在的な交絡因子と、逆行性形質導入のためのいくつかのAAV血清型の傾向を回避します。
この方法は、麻酔をかけたまま脳定位固定フレーム(図3)またはアラートとヘッド固定(図4)でNHPを注入するために使用できます。前者は、定位固定装置座標で注射を標的にできるという利点があり、急性硬膜切開術によるカニューレの浸透を視覚的に確認することができます(覚醒しているサルの硬膜を慢性開頭術で切開すると、感染のリスクが高まります)。後者のアプローチは、生存手術の回数、したがって動物へのストレスを低減し、行動中の電気生理学的記録と互換性があり、注入後の実験のために光ファイバを挿入するために使用されるのと同じ座標フレームおよび機器を使用するという利点を有する。覚醒状態のサルの注射技術は、人工硬膜を介して注射を行うことによってさらに改善される可能性があります13,14,15。これにより、注入部位の直接可視化と、形質導入の成功を示す組織蛍光という追加の利点が得られます。
NHPでは、他のいくつかのAAV注入技術が使用されてきた。 最近、AAVベクターを大きなNHP皮質領域に均一に送達するためのマルチチャネル注入装置が開発された16。同様の結果は、対流増強送達17,18を用いても得ることができる。これらの手法は、形質導入の広がりを最大化することを目的としており、これは重要な目標ですが、私たちの方法が目指す空間精度とは異なるものです。
別の代替方法は、一方の端が鋭い先端に面取りされ、もう一方の端がハミルトンシリンジに取り付けられたホウケイ酸チューブを通してAAVベクターを注入することです5,6。この方法は、この論文で説明されている方法と多くの共通点があります。ウイルスベクターはチューブの長さに保持され、ウイルスの後ろのチューブ内のスペースは染色された油で満たされ、ベクターの流れはオイルベクターメニスカスの動きを介して監視されます。この代替技術は、より少ない機器と準備を必要としますが、負圧によって斜角の先端を通してホウケイ酸チューブにオイルを引き込み、その後同じルートを介してベクターをロードする必要があります。これは必然的に微量の油が脳に届けられる結果になります。さらに、私たちの経験では、ホウケイ酸チューブは、面取りされた場合でも硬膜を貫通するために~350μmの直径を持っている必要があるため、この論文で説明されている薄い金属カニューレよりも大きな機械的損傷を引き起こします(図2D)。30Gチューブが使用されたのは、その臨界座屈荷重が1〜10 cmの長さにもかかわらず硬膜の浸透を媒介するのに十分高いため、PTFEチューブにぴったりとフィットし、閉塞することがめったにないためです。33 Gチューブは目詰まりや曲がりやすく、PTFEチューブとの嵌合がより困難になります。36 Gチューブは、NHP硬膜を貫通するには剛性が不十分です。
別の代替噴射技術は、エアポンプの出力をベクトル装填されたプルガラスピペット19の背面に嵌合させることである。ベクトルは、ポンプからの直接断続的な空気圧によってピペットチップから押し出され、オイルの必要性を排除します。上記のシングルチューブ法と同様に、メニスカスとカニューレ先端の間に材料の接合部がないため、漏れのリスクが軽減されます。しかし、ガラスピペットの鋭いテーパーと繊細な先端は、それらがNHP硬膜を貫通したり、深い構造を標的にしたりするのを防ぎます。

非ヒト霊長類(NHP)のオプトジェネティクスは、通常、ウイルスベクターを脳に直接注射することを含みます。このアプリケーションに適したベクターの1つのクラスは、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づいています。これらのベクターは、一本鎖DNAゲノムを囲むタンパク質キャプシドで構成され、プロモーター、オプシン遺伝子、およびオプションで他のタンパク質コード要素および遺伝子調節要素で構成されます。分子クローニングの進歩により、新しいベクターの開発のためのこれらのコンポーネントの操作と組み合わせが容易になりました。その結果、NHPオプトジェネティクスに潜在的に有用なAAVベクターのコレクションは大きく、急速に成長しています。
現在、NHPオプトジェネティクスに対するAAVベクターの有用性は、in vivoでの試験を必要とする。この事実は進歩への実質的な障壁です。動物は控えめに使用する必要があり、1匹の動物で複数のベクターをテストするには、注射部位を神経構造に対して慎重に配置し、ウイルスの拡散に対して十分に分離する必要があります。正確な組織学的評価には、注入が空間的および体積的に正確である必要があります。薬理学的物質1、2、3、4の局所送達のために以前に使用された注射技術は、そのような注射をするために適応されそして単純化された。この注射技術は安価で、使い捨ての滅菌可能なコンポーネントを使用し、麻酔または覚醒中の行動するサルに使用でき、あらゆる深さの多様な脳領域を標的にするために使用できます。次のプロトコルは、使い捨てコンポーネントを製造し、NHP脳に注射を行うための段階的な手順を説明しています。この手法の長所と短所について説明します。

<table><tbody><tr><td><ストロング>装備:</ストロング> 固定装置セット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>アイテム</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>六角レンチ</td><td>BONDHUS</td><td>10936</td><td>ステラ</td></tr><tr><td>ド カニューレホルダー</td><td>KOPF</td><td>1770</td><td>ステラド</td></tr><tr><td>キャリア(マニピュレーター)</td> <td>KOPF</td><td>1404</td><td>ステラド</td></tr><tr><td>キャリアプラットフォーム</td><td>KOPF</td><td>1430</td><td>NA</td></tr><tr><td>キャリアスタンド</td><td>KOPF</td><td>1449</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>目・耳・口バー</td><td>KOPF</td><td>1430</td><td>NA</td></tr><tr><td>脳定位固定下 KOPF</td><td></td><td>1210</td><td>NA</td></tr><<tr><td>ストロング>装備:</ストロング> カニューレ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>アイテム</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1mL ルアーロックシリンジ</td><td>BD</td><td>309628</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>カニューレ*</td><td>(自家製 - 下記参照)</td><td>NA</td><td>スチーム (オートクレーブ)</td></tr><tr><td>着色油**</td><td>（(自家製 - 下記参照)</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td>エレベーター (チューブラック用)</td><td>コールパーマー</td><td>UX-08057-10</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>フィルターチップ</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>23-404</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>蛍光マイクロビーズ</td><td>Lumafluor</td><td>R170</td><td>NA</td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td>NA</td></tr><tr><td>PCR チューブ</td><td>Olympus Plastics</td><td>22-161</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>Stopcock</td><td>Cole-Parmer</td><td>3060004</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>チューブラック</td><td>自家製</td><td>NA</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>ベクター溶液</td><td>(自家製)</td><td>NA</td><td>NA</td></tr><tr><td><ストロング>装備:</ストロング>電動エアポンプセット</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>アイテム</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>電動エアポンプ</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ</td><td>PV830NA</td><td></td></tr><tr><td>フットペダル</td><td>ワールドプレシジョンインスツルメンツ</td><td>3260NA</td><td></td></tr><tr><td>チューブ</td><td>カバーEZドレープ</td><td>A400-1000NA</td><td>(滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>Equipment: 一般手術ツール</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Item</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Beaker</td><td>MEDLINE</td><td>azlon</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>Burrs</td><td>STRYKER</td><td>277-10-235</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>Double Pronged tissue pick</td><td>Fine Science Tools</td><td>18067-11</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>Drapes</td><td>MEDLINE</td><td>DYNJP3004</td><td>NA(滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>ドレッシング鉗子</td><td>Miltex</td><td>6-118</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>ドリル</td><td>STRYKER</td><td>Q9R-5400</td><td>NA</td></tr><tr><td>ドリルビット</td><td>STRYKER</td><td>277-82-87</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>MEDLINE</td><td>NON26334</td><td>NA(滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>止血蚊鉗子</td><td>Miltex</td><td>7-2, 7-4</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>ライトハンドル</td><td>SKYTRON</td><td>ステラXL</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>ニードルホドラー</td><td>ミルテックス</td><td>8-2</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>ペリオスティールエレベーター</td><td>ミルテック</td><td>ス 18-1968</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>ロンゲール</td><td>ミルテック</td>ス <td>17-4800</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>サリーヌ</td><td>バクスター</td><td>2F7122</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>メス</td><td>バードパーカー</td><td>372610</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>ハサミ</td><td>ミルテックス</td><td>5-12, 5-114</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>センリトラクター</td><td>ミルテック</td>ス <td>28065</td><td>ステラッド</td></tr><tr><td>滅菌手袋</td><td>MEDLINE</td><td>Triumph Micro</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>サクション</td><td>meddela</td><td>200-4869</td><td>NA</td></tr><tr><td>サクションチップ</td><td>MEDLINE</td><td>DYNDFR12S</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>サクションチューブ</td><td>COVIDEN</td><td>8888301614</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>手術用ガウン</td><td>MEDLINE</td><td>DYNJP2002S</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>手術用ペン&定規</td><td>MEDLINE</td><td>DYNJSM03</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>縫合</td>糸 <td>COVIDEN</td><td>SL-635</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>組織鉗子</td><td>Miltex</td><td>6-114</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>タオルクランプ</td><td>Miltex</td><td>7-504</td><td>STERRAD</td></tr><tr><td>ウッドスワブ</td><td>MEDLINE</td><td>MDS202095</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td><ストロング>備品:</ストロング> *カニューレ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><ストロング>アイテム</ストロング></td><td></td><td></td><td></td></tr>皮<tr><td>下注射針</td><td>EXELINT INTERNATIONAL</td><td>26437</td><td>NA (滅菌パッケージ)</td></tr><tr><td>ステンレス鋼管</td><td>K-TUBE</td><td>K30R</td><td>NA</td></tr><tr><td>PTFEチューブ</td><td>ZEUS</td><td>216200</td><td>NA</td></tr><<tr><td>strong>機器: **着色油</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Item</Liquid></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquidキャンドル染料濃縮物</td><td>プレミアムクラフト</td><td>レッド/ピンク</td><td>NA</td></tr><tr><td>鉱油</td><td>Vi-Jon</td><td>S0883</td><td></td></tr><tr><td></td> NA <td>STERRAD:低温過酸化水素ガスプラズマ</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのaavベクターの注射

Injections of AAV Vectors for Optogenetics in Anesthetized and Awake Behaving Non-Human Primate Brain

光遺伝学的技術は神経科学研究に革命をもたらし、神経学的遺伝子治療にも同じことをする準備ができています。しかし、オプトジェネティクスの臨床使用には、ヒトと神経学的に類似しているため、動物モデル、理想的には非ヒト霊長類(NHP)で安全性と有効性を実証する必要があります。神経科学や医学に役立つ可能性のあるベクター候補の数は膨大であり、これらのベクターをテストするためのハイスループット手段はまだ存在しません。したがって、死後の組織学を通じて明確に識別できるNHP脳へのウイルスベクターの複数の空間的および体積的に正確な注入を行う技術が必要です。本明細書に記載されるのは、このような方法である。注射用カニューレは、ポリテトラフルオロエチレンとステンレス鋼管の結合で構成されています。これらのカニューレはオートクレーブ可能で使い捨てで、最小負荷量が少ないため、高価で高濃度のウイルスベクター溶液の注入に最適です。不活性な赤く染められた鉱物油がデッドスペースを満たし、ベクター溶液で目に見えるメニスカスを形成し、注入速度と量を瞬時に正確に測定できます。オイルはカニューレの後部に装填され、ベクターとの同時注入のリスクを軽減します。カニューレは10分でロードでき、注射は20分で行うことができます。この手順は、覚醒または麻酔をかけた動物への注射に最適です。高品質のウイルスベクターを送達するために使用すると、この手順は光遺伝学的タンパク質の堅牢な発現を生成し、NHPの神経活動と行動の光学制御を可能にします。

ここで説明する外科的注射法を用いてNHP脳へのin vivo定位固定装置注射による導入遺伝子発現を実証するために、異なる神経型における超黄色蛍光タンパク質-2(SYFP2)の発現を駆動するエンハンサーを含む2つのベクターを選択しました8,9。ウイルスベクターをPHP.eBキャプシド10にパッケージ化し、ヨージキサノール遠心分離で精製した後、qPCRで測定した高力価(&gt;1E13ウイルスゲノム/ mL)まで濃縮しました。皮質を通る10トラックに沿った10の深さのそれぞれに0.5 μLの容量を注入し、合計注入量は5 μL/トラックでした。図3A-Cは、PVALBサブクラス特異的AAVベクターCN2045を成人雄マカカ・ネメストリナの一次視覚野に注射してから113日後に抗GFP免疫染色によるSYFP2発現を示す。SYFP2導入遺伝子は、皮質深部に散在する多数の非錐体ニューロンで堅牢に検出され、ほとんどのSYFP2発現ニューロンはPVALB7に対しても免疫反応性を示しました。図3Dは、L5ニューロンサブクラス特異的AAVベクターCN2251の注射後64日目の一次運動皮質における天然SYFP2発現を示す。SYFP2で標識されたニューロンはすべて、体細胞が第5層に限定され、特徴的な厚い頂端樹状突起を有する明確な錐体形態を有する。これらのデータは、AAVベクターを標的とする細胞型の定位固定装置注射によるNHP脳内の新皮質ニューロンの選択された集団における導入遺伝子発現の正確な制御を明確に示しています。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2.jpg"> 図3:NHP脳に注入されたAAVベクターによって媒介される細胞型特異的SYFP2発現の例 。 (A)PVALBサブクラス特異的AAVベクターの注射後113日目のマカク初代視覚野からの固定切片の落射蛍光顕微鏡写真。スケールバー:1ミリメートル。 (B,C) Aに示す四角地領域の高倍率画像。(B)アンチGFPシグナル。(C)アンチPVALB信号。スケールバー:250μm。 (D)層5の境界外サブクラス特異的AAVベクターの注射後64日目のマカク一次運動皮質からの固定切片における天然SYFP2蛍光の落射蛍光顕微鏡写真。スケールバー:500μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
神経生理学的および行動的光遺伝学的操作に対するこの注射技術の有用性を実証するために、それぞれ異なるサル(Macaca mulatta)で3つの実験が行われました。最初の実験(図4A-D)では、チャネルロドプシン-2導入遺伝子(AAV1-hSyn1-ChR2-mCherry)を保有するAAVベクターを左上丘(SC)に注入した。ベクターを19の深さで250 μmごとに注入し、合計12 μL注入しました。第2の実験(図4E−G)では、3μLのAAV1−hSyn−ArchT−EYFP溶液を網状被蓋骨核(NRTP)に注入した。第3の実験(図4H−K)において、24μLのAAV9−L7−ChR2−mCherry溶液を小脳皮質6に注入した。各注射の6〜8週間後、光ファイバーとタングステン電極がダブルバレルガイドチューブを介して脳に挿入されました(図1G)。
図4B は、青色光(450nm)に対するSCニューロンの応答を示す。40mWでの連続光(1.2秒)は、一連の連続した活動電位を生成しました(図4B、上)。持続時間1msの光パルスは、40mWで活動電位を呼び起こすことができませんでしたが(図4B、中央)、2.7±0.6msの遅延で、テストされた唯一の他の電力レベルである160mWで活動電位を確実に呼び起こしました(図4B、下)。パルス列(160 mW、周波数:300 Hz、デューティサイクル:15%、持続時間:300-ms)は、平均遅延97 ± 32 ms、平均振幅10.4°、平均角度47°(上向きおよび右向き; 図4C)。
SC11,12の閾値以下の電気刺激を使用してサッカードゲインを修正した研究と一致して、15°、18°、および20°の左向きおよび下向き(225°)のサッカード後のSCの光刺激は、サッカードゲインを徐々に減少させました(図4D)。このゲインの減少は、適応前のゲイン(黒い円)に戻るために~250回の試行(緑色の円)を必要とし、長期的な可塑性の基礎を確認しました。
2番目の実験(図4E)では、NRTPから小脳皮質(小葉VIcおよびVII)の動眼朱虫(OMV)への苔状線維突起が光学的に抑制されました。図4Fは、OMV(挿入図)における蛍光標識された苔状繊維およびロゼットを示す。黄色のレーザー光(589 nm)が光ファイバーを介してOMVに配信され、近くのタングステン電極を使用してプルキンエ細胞の活動を記録しました。図4Gは、NRTP投影の光遺伝学的不活性化の前(灰色)および後(オレンジ色)の単純なスパイク活性を示しています(図4G、上)。不活性化前、プルキンエ細胞は12°右向きのサッカードに対してダブルバーストパターンを示しました(図4G、中央、灰色)。不活性化中、発火率は減少し、バースト一時停止パターンに変化しました(図4G、中央、オレンジ)。これら2つの応答パターンを比較すると、プルキンエ細胞への苔状線維入力が、2番目のバーストを駆動することによってサッカード減速段階に影響を与えることが示唆されます(図4G、中央、緑)。右向きのサッカードの変動性は、光遺伝学的不活性化中に減少し、サッカードメトリックの試行間の変動の一部は、苔状の繊維によって運ばれるシグナルの変動性によるものであるという考えと一致しています(図4G、下、オレンジ)。
第3の実験(図4H)において、OMVのプルキンエ細胞を光遺伝学的に刺激した(図4I)。一連の短い光パルス(1.5 msパルス、65 mW、50 Hz)は、単離されたプルキンエ細胞の単純なスパイク活性を増加させました(図4J、上)。個々の1.5msの光パルスは、&gt;1の単純なスパイクを頻繁に誘発しました(図4J、下)。サッカード(10 ms光パルス、60 mW)中に発生するタイミングの光遺伝学的単純スパイク活性化、サッカード振幅の増加(図4K)、眼球運動バーストジェネレーターに対するプルキンエ細胞の抑制解除の役割が確認されました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2.jpg"> 図4:覚醒中のサルで行われた3つの光遺伝学的実験の要約。 (A-D)実験1、汎神経細胞興奮:ウイルス注入、レーザー刺激、およびユニット記録を上丘(A)で行った。(B)レーザー刺激によって誘発される代表的なユニット活動。(C)、眼球運動の水平(上)および垂直(中央)成分、およびレーザー刺激によって引き起こされる単位活動(下)のラスタープロット。(D)レーザー刺激によって誘発されるサッカード適応の代表的なセッション。刺激(100 0.5 msレーザーパルス)は、各サッカード(挿入図)の80ミリ秒後に送達されました。サッカードゲイン(サッカード振幅/目標振幅)は、試行全体で徐々に減少しました。.(E-G)実験2、経路特異的阻害:ウイルスベクターを網状突起髄核に注入し、眼球運動虫にレーザー刺激と単位記録を行った(E)。(F)標識された苔状の繊維(スケールバー:1 mm)とそのロゼット(挿入図、スケールバー:100 μm)を示す眼球運動虫の組織学的セクション。(G)プルキンエ細胞活性(上:ラスター、中央:平均発火率)とレーザー刺激の有無にかかわらず視覚的に誘導されたサッカードの軌跡(下)。灰色:レーザーオフトライアル、オレンジ:レーザーオントライアル、緑:グレーとオレンジの違い。(H-K)実験3、細胞種特異的活性化:ウイルス注入、レーザー刺激、および単位記録を眼球運動虫(H)で行った。(i)標識されたプルキンエ細胞を示す眼球運動虫の組織学的切片。スケールバー:100μm。 (J)レーザー刺激によって誘発されたプルキンエ細胞の単純なスパイク活性。上:14回の試行からのラスタープロット。下:単一の代表的な試験からの電圧トレース。(K)レーザー刺激の有無にかかわらず視覚的に誘導されたサッカードの軌跡。サッカード中の10ミリ秒の光パルスは、サッカードの振幅を増加させた。レーザーオン試験での個々のサッカード軌道(シアン)とその平均(青)。レーザーオフ試験での個々のサッカード軌道(ライトグレー)とその平均(ダークグレー)。光波長は実験1、3では450nm、実験2では589nmであった。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62546/62546fig4v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

現在実施されているように、非ヒト霊長類のオプトジェネティクスは、脳へのウイルスベクターの注射を必要とします。最適な注入方法は、信頼性が高く、多くのアプリケーションにとって、死後の組織学で容易かつ明確に特定される任意の深さの個々の部位を標的にできる必要があります。これらの特性を有する注入方法が提示される。

非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射

Optogenetic techniques have revolutionized neuroscience research and are poised to do the same for neurological gene therapy. The clinical use of ...

多くの遺伝子治療および神経科学的研究は、非ヒト霊長類の脳へのAAVベクターの注射を含む。これらの研究が成功するためには、注射技術が信頼できるものでなければなりません。当社の注入技術は瞬時に正確です。この手順は、麻酔をかけた動物や覚醒している動物への注射に適しています。私たちの自家製カニューレは取り扱いが簡単で低コストです。手順を実演するのは、私の研究室のエンジニアリング技術者であるケビン・メイです。はじめに、ディスクグラインダーで30ゲージの13ミリメートル皮下注射針の先端を鈍らせます。次に、ステンレス鋼管をターゲット脳領域の深さに応じた長さに切断します。ディスクグラインダーを使用して、カットチューブの一方の端を面取りし、もう一方の端を滑らかにします。ブローチでチューブの内側をバリ取りします。次に、PTFEチューブを、ロードするベクター溶液の量に適した長さに切断します。鈍い皮下注射針を挿入してチューブの両端をフレアします。鈍い皮下注射針をPTFEチューブの一方の端に約5ミリメートル挿入します。次に、ステンレス鋼管の面取りされていない端をもう一方の端に約5ミリメートル挿入します。皮下注射針ハブからろ過水を注入してカニューレをテストします。面取りされたステンレス鋼管の先端から水がスムーズに出ていること、およびどちらの接合部からも水が漏れていないことを確認します。カニューレをテストした後、オートクレーブバッグに入れ、オートクレーブ滅菌します。ベクター溶液をP-20ピペッターで滅菌したPCRチューブに静かに移し、気泡の形成を防ぎます。次に、斜めの先端を下に向けてカニューレを垂直方向の定位固定装置ホルダーに取り付けます。次に、1ミリリットルのルアーロックシリンジをカニューレの皮下注射針ハブに接続します。面取りされた先端をベクトル溶液に浸します。次に、1ミリリットルのシリンジで穏やかな負圧を加え、溶液と空気の間のメニスカスを視覚的に追跡しながら、溶液をカニューレに入れます。ベクター溶液がロードされたら、溶液がニードルハブに到達するまで穏やかな負圧を続けます。次に、1ミリリットルの注射器を取り外し、気泡が入らないように注意しながら、皮下注射針ハブの内壁に沿って着色された鉱物油をゆっくりと注入します。皮下注射針ハブを、3方向ルアーロック活栓の2つの開いているポートの1つに取り付けます。次に、ポートを閉じます。1ミリリットルのシリンジに空気を入れ、他の2つのポートのいずれかに取り付けます。最後に、活栓の残りのポートを閉じて、シリンジをカニューレに接続します。シリンジを取り付けると、空気が活栓に押し込まれ、この空気を空いているポートにシャントすると、ベクター溶液がカニューレに押し戻されるのを防ぎます。シリンジからカニューレにゆっくりと空気を押し込みます。PTFEチューブの鈍い針の先端に着色油が現れたら、溶液と着色油の間の空気を確認します。ベベルカニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで、陽圧をかけ続けます。次に、活栓を閉じて、ベクトルが重力によってカニューレから出ないようにします。ベクター溶液がロードされたら、カニューレを定位固定装置マニピュレーターに貼り付けます。次に、活栓を電動エアポンプに接続するには、非滅菌アシスタントからポンプチューブを取り出します。滅菌スリーブの壁を通してルアーロックコネクタをつかみます。スリーブの襟を落とし、重力によってチューブに沿って伸びるようにします。次に、活栓を固定し、スリーブをルアーロックコネクタにしっかりとテープで固定します。次に、エアポンプを低圧に設定してエアポンプとカニューレをテストしてから、オイルがカニューレを通って進み、カニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで、エアポンプをオンにして圧力を上げます。プラスチック定規をPTFEチューブにテープで固定して、射出中のメニスカスの動きを測定します。次に、先端が表面に達するまで脳定位固定マニピュレーターでカニューレを押し下げ、深さを記録します。カニューレを最も深い部位まで運転し、トラックに沿って注入します。接触すると表面がくぼみます。組織の圧迫によるミスターゲティングを最小限に抑えるには、カニューレを押し下げ、最も深い注射部位を500マイクロメートルオーバーシュートします。その後、ゆっくりと引っ込めます。他の選択肢は、カニューレをゆっくりと下げるか、すばやく運転して底で1〜5分間待つことです。カニューレが最も深い注入部位に配置されたら、電動エアポンプを使用して、0.5マイクロリットルのベクター溶液を10〜30秒間注入します。PTFEチューブ内の着色油とベクター溶液の間のメニスカスを追跡して、注入の流れを確認します。1分間待った後、カニューレをトラックに沿って次の注射部位に引っ込めます。最後の注入後、ベクター流出を避けるためにカニューレを10分間そのままにしておきます。次に、カニューレを引っ込めて、バイオハザード鋭利物の容器に捨てます。チャネルロドプシンII導入遺伝子を保有するAAVベクターを左上丘に注入し、続いて40ミリワットの連続的な青色光で刺激すると、一連の連続した活動電位が生じました。1ミリ秒の光パルスは、40ミリワットで活動電位を呼び起こすことができませんでしたが、160ミリワットで確実にそれらを呼び起こしました。視覚誘導サッカードによって引き起こされる上丘の光刺激は、サッカードの獲得を徐々に減少させた。この変化の遅さは、光遺伝学的に誘発された可塑性と一致しています。網状被蓋骨核へのAAV注射後の眼球運動虫への黄色レーザー光の送達は、小脳への入力である苔状線維の活動を抑制した。この抑制は、小脳の出力であるプルキンエ細胞活性を低下させた。光遺伝抑制の間、発火速度は減少し、バースト細孔パターンに変化し、プルキンエ細胞への苔状線維入力の抑制が第2バーストを駆動することによってサッカード減速段階に影響を与えることが示唆された。チャネルロドプシンは、眼球運動虫のプルキンエ細胞でのみ発現した。短い光パルスの送達は、単離されたプルキンエ細胞の単純なスパイク活性を増加させた。1.5ミリ秒の1つの光パルスが、複数の単純なスパイクを頻繁に呼び起こしました。サッカード中に起こるタイミングの光遺伝学的単純スパイク活性化はサッカード振幅を増加させ、眼球運動バースト発生器に対するプルキンエ細胞の抑制解除の役割を確認した。カニューレ内の気泡は、オイルベクターメニスカスを破壊し、注入量の決定を複雑にし、流量の微調整を妨げる可能性があります。これらの理由から、気泡のないベクトル溶液をロードすることは、この手順にとって重要です。注射の6〜8週間後に、光遺伝学的操作を行い、脳組織を組織学的分析のために処理することができます。この技術により、研究者は少数の動物で多くのベクターをテストすることができ、その結果、新しいベクターの開発と検証が容易になります。現在特に関心があるのは、特定のニューロン型を標的とするベクターの開発です。

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Research

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オンラインMRI画像のガイダンスの下でレソスマカクの皮質への光遺伝学アデノ関連ウイルスベクターの対流強化された配信

マウス脳スライスにおける長距離入力の光遺伝学的刺激のための生体内脳内立体注射

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。...

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

脳スライスにおける求心性経路の光遺伝学的活性化と揮発性麻酔薬による応答の調節

ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。...

エクスビボ 内側前頭前野から外側嗅内皮質への長距離シナプス伝達と可塑性の光遺伝学的調べ

くも膜下ウイルスの注入を使用するアデノ随伴ウイルスの広範な送達のための新しい技術が記載されています。この方法は、マウス新皮質ニューロンの表層への広範な形質導入を保証するだけでなく、非選択的プロモーターを使用した場合でも、第5層錐体ニューロンにおける導入遺伝子の選択的発現をもたらします。...

AAV2のくも膜下注射によるマウス新皮質ニューロンの広範な形質導入

学ぶAAVベクター注射法を用いた非ヒト霊長類脳の光遺伝学的操作。この正確な技術は、麻酔下および覚醒状態の両方で神経応答を誘導し、視覚処理における神経可塑性の理解に貢献します。

非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射

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