非ヒト霊長類脳における麻酔および覚醒行動のための光遺伝学のためのAAVベクターの注射
2021年8月4日
現在実施されているように、非ヒト霊長類のオプトジェネティクスは、脳へのウイルスベクターの注射を必要とします。最適な注入方法は、信頼性が高く、多くのアプリケーションにとって、死後の組織学で容易かつ明確に特定される任意の深さの個々の部位を標的にできる必要があります。これらの特性を有する注入方法が提示される。
多くの遺伝子治療および神経科学的研究は、非ヒト霊長類の脳へのAAVベクターの注射を含む。これらの研究が成功するためには、注射技術が信頼できるものでなければなりません。当社の注入技術は瞬時に正確です。
この手順は、麻酔をかけた動物や覚醒している動物への注射に適しています。私たちの自家製カニューレは取り扱いが簡単で低コストです。手順を実演するのは、私の研究室のエンジニアリング技術者であるケビン・メイです。
はじめに、ディスクグラインダーで30ゲージの13ミリメートル皮下注射針の先端を鈍らせます。次に、ステンレス鋼管をターゲット脳領域の深さに応じた長さに切断します。ディスクグラインダーを使用して、カットチューブの一方の端を面取りし、もう一方の端を滑らかにします。
ブローチでチューブの内側をバリ取りします。次に、PTFEチューブを、ロードするベクター溶液の量に適した長さに切断します。鈍い皮下注射針を挿入してチューブの両端をフレアします。
鈍い皮下注射針をPTFEチューブの一方の端に約5ミリメートル挿入します。次に、ステンレス鋼管の面取りされていない端をもう一方の端に約5ミリメートル挿入します。皮下注射針ハブからろ過水を注入してカニューレをテストします。
面取りされたステンレス鋼管の先端から水がスムーズに出ていること、およびどちらの接合部からも水が漏れていないことを確認します。カニューレをテストした後、オートクレーブバッグに入れ、オートクレーブ滅菌します。ベクター溶液をP-20ピペッターで滅菌したPCRチューブに静かに移し、気泡の形成を防ぎます。
次に、斜めの先端を下に向けてカニューレを垂直方向の定位固定装置ホルダーに取り付けます。次に、1ミリリットルのルアーロックシリンジをカニューレの皮下注射針ハブに接続します。面取りされた先端をベクトル溶液に浸します。
次に、1ミリリットルのシリンジで穏やかな負圧を加え、溶液と空気の間のメニスカスを視覚的に追跡しながら、溶液をカニューレに入れます。ベクター溶液がロードされたら、溶液がニードルハブに到達するまで穏やかな負圧を続けます。次に、1ミリリットルの注射器を取り外し、気泡が入らないように注意しながら、皮下注射針ハブの内壁に沿って着色された鉱物油をゆっくりと注入します。
皮下注射針ハブを、3方向ルアーロック活栓の2つの開いているポートの1つに取り付けます。次に、ポートを閉じます。1ミリリットルのシリンジに空気を入れ、他の2つのポートのいずれかに取り付けます。
最後に、活栓の残りのポートを閉じて、シリンジをカニューレに接続します。シリンジを取り付けると、空気が活栓に押し込まれ、この空気を空いているポートにシャントすると、ベクター溶液がカニューレに押し戻されるのを防ぎます。シリンジからカニューレにゆっくりと空気を押し込みます。
PTFEチューブの鈍い針の先端に着色油が現れたら、溶液と着色油の間の空気を確認します。ベベルカニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで、陽圧をかけ続けます。次に、活栓を閉じて、ベクトルが重力によってカニューレから出ないようにします。
ベクター溶液がロードされたら、カニューレを定位固定装置マニピュレーターに貼り付けます。次に、活栓を電動エアポンプに接続するには、非滅菌アシスタントからポンプチューブを取り出します。滅菌スリーブの壁を通してルアーロックコネクタをつかみます。
スリーブの襟を落とし、重力によってチューブに沿って伸びるようにします。次に、活栓を固定し、スリーブをルアーロックコネクタにしっかりとテープで固定します。次に、エアポンプを低圧に設定してエアポンプとカニューレをテストしてから、オイルがカニューレを通って進み、カニューレの先端にベクター溶液の滴が見えるまで、エアポンプをオンにして圧力を上げます。
プラスチック定規をPTFEチューブにテープで固定して、射出中のメニスカスの動きを測定します。次に、先端が表面に達するまで脳定位固定マニピュレーターでカニューレを押し下げ、深さを記録します。カニューレを最も深い部位まで運転し、トラックに沿って注入します。
接触すると表面がくぼみます。組織の圧迫によるミスターゲティングを最小限に抑えるには、カニューレを押し下げ、最も深い注射部位を500マイクロメートルオーバーシュートします。その後、ゆっくりと引っ込めます。
他の選択肢は、カニューレをゆっくりと下げるか、すばやく運転して底で1〜5分間待つことです。カニューレが最も深い注入部位に配置されたら、電動エアポンプを使用して、0.5マイクロリットルのベクター溶液を10〜30秒間注入します。PTFEチューブ内の着色油とベクター溶液の間のメニスカスを追跡して、注入の流れを確認します。
1分間待った後、カニューレをトラックに沿って次の注射部位に引っ込めます。最後の注入後、ベクター流出を避けるためにカニューレを10分間そのままにしておきます。次に、カニューレを引っ込めて、バイオハザード鋭利物の容器に捨てます。
チャネルロドプシンII導入遺伝子を保有するAAVベクターを左上丘に注入し、続いて40ミリワットの連続的な青色光で刺激すると、一連の連続した活動電位が生じました。1ミリ秒の光パルスは、40ミリワットで活動電位を呼び起こすことができませんでしたが、160ミリワットで確実にそれらを呼び起こしました。視覚誘導サッカードによって引き起こされる上丘の光刺激は、サッカードの獲得を徐々に減少させた。
この変化の遅さは、光遺伝学的に誘発された可塑性と一致しています。網状被蓋骨核へのAAV注射後の眼球運動虫への黄色レーザー光の送達は、小脳への入力である苔状線維の活動を抑制した。この抑制は、小脳の出力であるプルキンエ細胞活性を低下させた。
光遺伝抑制の間、発火速度は減少し、バースト細孔パターンに変化し、プルキンエ細胞への苔状線維入力の抑制が第2バーストを駆動することによってサッカード減速段階に影響を与えることが示唆された。チャネルロドプシンは、眼球運動虫のプルキンエ細胞でのみ発現した。短い光パルスの送達は、単離されたプルキンエ細胞の単純なスパイク活性を増加させた。
1.5ミリ秒の1つの光パルスが、複数の単純なスパイクを頻繁に呼び起こしました。サッカード中に起こるタイミングの光遺伝学的単純スパイク活性化はサッカード振幅を増加させ、眼球運動バースト発生器に対するプルキンエ細胞の抑制解除の役割を確認した。カニューレ内の気泡は、オイルベクターメニスカスを破壊し、注入量の決定を複雑にし、流量の微調整を妨げる可能性があります。
これらの理由から、気泡のないベクトル溶液をロードすることは、この手順にとって重要です。注射の6〜8週間後に、光遺伝学的操作を行い、脳組織を組織学的分析のために処理することができます。この技術により、研究者は少数の動物で多くのベクターをテストすることができ、その結果、新しいベクターの開発と検証が容易になります。
現在特に関心があるのは、特定のニューロン型を標的とするベクターの開発です。
概要
本研究では、光遺伝学的応用に不可欠な、非ヒト霊長類の脳へのAAVベクター導入のための信頼性が高く即時的な注入技術を提示します。この手法により特定の脳領域へのターゲティングが可能となり、上丘への刺激に成功したことで、顕著な電気生理学的変化と可塑性に関する知見が得られました。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 光遺伝学
- 遺伝子治療
背景
- 光遺伝学には、ウイルスベクターの精密かつ確実な導入が必要です。
- 注入技術は、脳領域の正確な標的設定と特定を可能にするものである必要があります。
- 従来の手法では有効性や精度が不足している場合があり、改良された技術が必要とされています。
研究目的
- 非ヒト霊長類におけるAAVベクターの信頼性の高い注入手順を開発すること。
- オプトジェネティクス刺激が神経応答に及ぼす影響を探索すること。
- 覚醒時および麻酔下の被験者の両方に適用可能な手法を確立すること。
使用した手法
- 本研究では、ベクター溶液を注入するために自作のカニューレを使用した。
- 作製には、30ゲージの皮下注射針とステンレス製チューブを用いた。
- この手法では、溶液の調製、充填、および注入に関する細心の工程が含まれている。
- ベクター溶液の注入は、電動エアポンプを用いて精密に制御して行われた。
- 注入中および注入後の電気生理学的反応をモニタリングした。
主な結果
- AAVベクターの注入により、光刺激に反応して有意な活動電位の生成が認められた。
- 電気生理学的な変化は、サッカード反応における光遺伝学的に誘導された可塑性を示唆している。
- ベクターの注入の結果、神経活動パターンの変化を示す小脳出力の抑制が観察された。
結論
- 提案された注入技術により、霊長類モデルにおける光遺伝学研究のための精密なターゲティングが可能になります。
- これらの知見は、視覚処理に関連する神経メカニズムと可塑性の理解に寄与します。
- 注入精度の向上は、将来の遺伝子治療への応用に重要な意味を持ちます。
よくある質問
業界における重要性
非ヒト霊長類（NHP）の脳におけるAAVベクターの信頼性が高く空間的に精密な導入は、トランスレーショナルな光遺伝学および神経系遺伝子治療の開発を実現するための重要な基盤となります。本手法は、NHPにおける再現性のあるベクター投与という課題を解決し、臨床応用の前段階における強固なターゲット検証およびメカニズムのリスク低減を支援します。限られた動物コホート内でマルチプレックスなベクター試験を促進できる能力は、CNS治療パイプラインにおけるポートフォリオの効率性と予測の信頼性に直接的に寄与します。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 疾患に関連する非ヒト霊長類（NHP）システムにおいて、光遺伝学的なコンストラクトおよびベクターの向性を厳格に検証することが可能になります。
- 制御された光変調と電気生理学的な読み出しを通じて、神経細胞標的の機能的バリデーションをサポートします。
- 候補ベクターの精密な空間的および容量的な導入を可能にすることで、メカニズム的なリスク低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 検証済みのNHP脳領域を調製し、後続の光遺伝学および電気生理学的アッセイに供する。
- 注入量と注入速度を標準化し、実験回数間の再現性を向上させる。
- ベクター発現と機能的アウトカムの定量的な評価を可能にし、ベクター候補のスクリーニングに役立てる。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 非ヒト霊長類（NHP）においてヒトに関連する神経回路をモデル化することで、トランスレーショナルなバイオマーカー戦略と整合させます。
- 高忠実度システムを用いることで、ベクターの探索から前臨床検証までの連続性を確保します。
- 治療用コンストラクトの堅牢かつ組織学的に検証可能なデリバリーと発現を可能にし、生物学的リスクを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
この注入技術は、中枢神経系（CNS）の遺伝子治療および光遺伝学プログラムにおける、初期探索、ターゲット検証、および前臨床モデル開発のインターフェースを統合するものです。
- 探索生物学： 非ヒト霊長類（NHP）における精密な神経回路操作を可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明を支援します。
- スクリーニング： 再現性のある定量的なベクター投与を実現し、候補コンストラクトの比較評価を可能にします。
- 分析： 注入量、注入速度、および死後の組織学的確認などの測定可能なアウトプットを提供します。
- トランスレーショナルリサーチ： NHPにおいてヒトに近い神経応答をモデル化することで、基礎研究と前臨床検証を橋渡しします。
- 組織的な再利用： 多様なベクターとターゲットの組み合わせに適応可能な、標準化された拡張性のあるプロトコルを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：CNSターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値：非ヒト霊長類（NHP）におけるベクター試験の再現性、標準化、およびスループットを向上させます。
- 戦略的価値：堅牢な前臨床データの生成を可能にすることで、go/no-go判断の質と資本配分を改善します。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けおよびCNS遺伝子治療アセットの推進を支援します。
実施上の検討事項
- 正確なターゲット設定のためには、定位固定手術および非ヒト霊長類（NHP）の神経解剖学に関する専門知識が必要です。
- 専用のカニューレ作製設備、注入器具、および組織学的解析インフラへのアクセスが不可欠です。
- 再現性とデータの比較可能性を確保するために、チーム間での厳格な標準化が必要です。
- 必要に応じてプロトコルを変更することで、さまざまな脳領域やベクタータイプに適応させることが可能です。
- 注入の精度を維持し、流れの遮断を防ぐため、気泡を慎重に除去することが極めて重要です。
