Name: 磁気浮上を用いた細胞密度と抗原特性の定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 25 s
Description: 学ぶ磁気浮上法による血液細胞の密度分離と抗原検出技術。赤血球のRh因子を迅速かつ低侵襲で識別し、貧血や敗血症などの血液疾患診断に応用可能な革新的な検査手法です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

著者らは、細胞外小胞の仕事に協力してくれたゲトゥリオ・ペレイラ博士に感謝したいと考えています。
この研究は、ICGに対する国立衛生研究所の助成金によって支援されました: RO1CA218500, UG3HL147353, およびUG3TR002881.

この研究で使用される実験的なプロトコルは、ベス・イスラエル・ディーコネス医療センター機関審査委員会(IRB)によって承認されました。
1. 機器のセットアップ
注:細胞を浮上させるイメージングでは、Z軸上に磁化された2つの希土類ネオジム磁石を、同じ極を向けて磁場を発生させる必要があります。磁石間の距離は、磁場の強さとターゲットの密度に応じてカスタマイズすることができます。この場合、磁石は長さ50mmの1×1mmのガラス毛管管を挿入するのに十分な1mm空間で分離される。デバイスは、AutoCAD デザインを使用して 3D 印刷されました。
<ol><li>顕微鏡を横に、完全に水平に置きます。 注:標準的な直立位置に置かれた顕微鏡は、凝縮器および目的に関する磁石の位置による浮上物の撮像には直接適していません。この制限は、顕微鏡を横に置くことによってバイパスすることができ、完全に水平に凝縮器は、キャピラリーに光を集中させることができ、そして、対物レンズはケーラーの照明要件を維持しながら、磁石の間に浮上する細胞をイメージする。</li>
	<li>2または3のラボジャックを使用して、ブレッドボードテーブルの上にスタンドをサポートし、レベルを付けます。</li>
	<li>振動を抑えるために、ゴム製の湿らせた足でブレッドボードテーブルを支えます。</li>
	<li>ステージを取り外し、浮上装置(y軸)と2つの単軸の移動段階の高さを調整するためのコンパクトなラボジャックに置き換えます。焦点(z軸)を調整するための1つ、および毛細管管をスキャンするための2番目の1。</li>
	<li>2つのミニシリーズ光ポストを使用して、磁気浮上装置をラボジャックに取り付けます。</li>
</ol>2. 抗体のカーボキシミクロ粒子/ビーズへの結合(PolyAnによるプロトコルから改変)
注: Rh(+)検出には低密度ビーズ(1.05 g/mL)のみをコーティングする必要がありますが、細胞外小胞の検出のために高密度および低密度ビーズの両方をコーティングします。
<ol><li>1 mg 相当のビーズ懸濁液を取り出し、0.5 mLの活性化バッファー(50 mM MES(MW195.2、9.72 mg 1 mL))pH 5.0および0.001%ポリソルベート-20に加えます。</li>
	<li>12 μLの新鮮な1.5 M EDC(MW 191.7、0.28755 g 1 mL)、0.3 Mスルフォ-NHS(MW 217.14、0.0651 g 1 mL)の12 μLを氷冷水に加えます。</li>
	<li>軌道シェーカーにチューブを置き、室温で1時間激しく振ってビーズ上のカルボキシル基を活性化します。</li>
	<li>カップリングバッファー(10x PBS、または0.1 Mリン酸pH 7-9)を0.5 mL添加して1時間後に活性化を停止します。</li>
	<li>ペレットは、10分間20,000 x g で遠心分離機でビーズをペレット化するか、ビーズをペレット化できない場合は0.45 μm遠心管フィルターを使用します。上清またはフロースルーを吸引する。</li>
	<li>ステップ2.5の場合と同様に、10倍PBSの1mLでビーズを3回洗浄します。</li>
	<li>mgビーズ当たり25μgの抗体を計算し、必要な抗体と活性化ビーズを混合して、10X PBSで0.7〜1.0 mg/mLの最終抗体濃度を得ます。</li>
	<li>低速でセットチューブロッカーにチューブを配置します。カップリングのために一晩室温で穏やかにチューブをロールします。</li>
	<li>ステップ2.5を繰り返し、10倍PBSの1mLでビーズを2回洗います。</li>
	<li>緩衝液pH 8.0で0.5mLの1 Mエタノールアミン(98%ストック=16.2 M)で、穏やかに振りながら室温で1時間ポリソルベート-20で洗浄します。</li>
	<li>ステップ2.5を繰り返し、DPBSの1mLに1回ビーズを洗います。ビーズは必要になるまで4°Cで200 μLのDPBSに貯蔵することができます。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。</li>
</ol>3. Rh(+)検出のための血液の採取と準備
<ol><li>ワンクリックランシングデバイスを使用して、Rh(+)ドナーの指を刺し、10 μLの血液を1mLのDPBSに集めます。</li>
	<li>蛍光性形質膜染色でRh+細胞を染色する。必要に応じて、Rh+細胞の1 mL懸濁液に1μLの蛍光色素を加えます(1:1000希釈)。</li>
	<li>蛍光色素を37°Cで15分間インキュベートします。</li>
	<li>ペレット細胞を15sで5,600xgで紡糸し、1mLのDPBSを用いて3回洗浄した。 カルシウムとマグネシウム(HBSS++)を使用してHBSSの1 mLで再中断します。</li>
	<li>ワンクリックランシング装置を使用して、Rh(-)ドナーの指を刺し、2μLの血液を採取します。 注:2つ以上の条件を準備する場合は、各チューブにRh(-)血液の1 μLを追加するのに十分な血液を収集します。</li>
	<li>必要な実験チューブを準備する:ビーズのみ、IgGコントロール、サンプル。<ol>
<li>ビーズ単独:HBSS++174 μL、IgGコントロールビーズ1 μL、高密度ビーズ1 μL(1.2 g/mL)、24 μLの500 mM Gd3+(60 mM)を追加します。</li>
		<li>IgG制御:HBSS++172 μL、IgGコントロールビーズ1μL、高密度ビーズ1μL、Rh-血液1μL、染色Rh+血液懸濁液1μL、500 mM Gd3+の24 μLを加える。</li>
		<li>サンプルチューブは、HBSS++の172 μL、抗RhDコーティングビーズ1 μL、高密度ビーズ1 μL、Rh-血液1μL、染色されたRh(+)血液懸濁液の1 μL、500 mM Gd3+の24 μLを加えます。 注: 高密度ビーズは、参照用に Rh サンプルに追加されます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 細胞分離デモ用PMNの分離
<ol><li>好中球の分離<ol>
<li>クエン酸ナトリウム/クエン酸6mL(0.15M、pH 5.5)と6%デキストラン-70の14 mLを含む60 mLシリンジに静脈血の40 mLを引き込む。</li>
		<li>血液が沈み出るのを50分待ちます。</li>
		<li>フィコル・パケの20mLの上にバフィーコート細胞をゆっくりと重ね、血液採取チューブを通して50mLチューブに押し込み、沈積したRbCsによる汚染を避けます。元の採血管に残存するRBCによる汚染を最小限に抑えるために、新鮮な採血セットを使用することをお勧めします。</li>
		<li>ペレットは、3,000 x gで20分間遠心分離によってバフィーコート細胞をコーティングする。好中球および汚染されたRBCsは管の底にペレットをする。PBMCはフィコル・パクの上に白い層を形成します。</li>
		<li>好中球を新しい50 mLチューブに移します。</li>
		<li>20 mLの0.2%の冷たいNaCl溶液を25秒間インキュベートし、さらに20 mLの1.6%NaClを続けて、残留性RbCを溶解します。NaClの最後の協奏は0.9%(等張)でなければなりません。</li>
		<li>3,000 x gで 10 分間のサスペンションを遠心分離します。</li>
		<li>上清を取り除き、好中球を所望の濃度に再懸濁する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
リンパ球の分離
	<ol>
<li>6ウェル培養プレートに5%の熱不活化血清を用いて、RPMIにPBMCをプレートします。</li>
		<li>37°Cでプレートを1時間インキュベートします。 単球はプレートに付着し、リンパ球は自由に浮遊する。</li>
		<li>リンパ球を含む緩衝液を取り出し、RPMIで2回洗浄します。</li>
		<li>所望の濃度でリンパ球を再中断する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ラベルRBCs、PMN、リンパ球。
	<ol>
<li>各細胞タイプに異なる蛍光色素を付けます。各色素が異なるチャネルで蛍光を発していることを確認します。選択した各色素に対して、製造元の指示に従います。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 補体活性化によるRBC細胞外小胞の生成
<ol><li>EDTAチューブを使用して静脈穿刺を通して全血を得る。</li>
	<li>白血球フィルターを通過し、次いで500 x g で3回遠心分離し、それぞれ10分間赤血球を単離する。HBSS++を洗浄バッファとして使用します。</li>
	<li>1.5 mLチューブに100 μLパックされたRBCのアリコートを作り、HBSS++を追加して体積を1 mLにします。</li>
	<li>HBSS++で0.18 μg/mLの最終濃度にC5b,6を加え、次に渦を加えます。</li>
	<li>室温で15分間ゆっくりとしたシェーカーを着ます。</li>
	<li>0.2 μg/mLの最終濃度にC7タンパク質を加えます。チューブを数回やさしく反転して混ぜます。この時点から前方にボルテックスしないでください。</li>
	<li>チューブを、室温で5分間低速にセットしたチューブシェーカーに置きます。</li>
	<li>0.2 μg/mL の最終濃度に C8 タンパク質を加え、0.45 μg/mL に C9 タンパク質を加えます。チューブを数回やさしく反転して混ぜます。</li>
	<li>37°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>チューブを10,000 x g で10分間遠心します。</li>
	<li>EV含有上清を新しいチューブに集めます。上清を細胞ペレットに近づけすぎないようにしてください。</li>
</ol>6. 磁気浮上装置上の細胞の解析
<ol><li>メーカーの指示に従って機器の起動を実行します。</li>
	<li>チューブがいっぱいになるまで、サンプル50 μLをキャピラリーチューブに積み込みます。キャピラリーチューブの端部をキャピラリーシーラントで密封し、気泡がないことを確認します。</li>
	<li>上部磁石と底部磁石の間のホルダーにキャピラリーチューブを積み込みます。最適な表示のためにステージとフォーカスを調整します。 注:セル/ビーズは、密度とGd3+の濃度に基づいて磁気平衡位置に到達するために5〜20分の任意の場所を取ることができます。Gd3+の濃度が高いほど、時間が短くなります。</li>
</ol>

<ol><li>Tasoglu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Levitational+Image+Cytometry+with+Temporal+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Levitational Image Cytometry with Temporal Resolution.</a> Advanced Materials. 27 (26), 3901-3908 (2015).</li>
<li>Durmus, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+levitation+of+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Magnetic levitation of single cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (28), 3661-3668 (2015).</li>
<li>Knowlton, S., Yu, C. H., Jain, N., Ghiran, I. C., Tasoglu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smart-Phone+Based+Magnetic+Levitation+for+Measuring+Densities%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Smart-Phone Based Magnetic Levitation for Measuring Densities.</a> PLoS One. 10 (8), 0134400(2015).</li>
<li>Ashkarran, A. A., Suslick, K. S., Mahmoudi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetically+Levitated+Plasma+Proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Magnetically Levitated Plasma Proteins.</a> Analytical Chemistry. 92 (2), 1663-1668 (2020).</li>
<li>Yaman, S., Tekin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Susceptibility-Based+Protein+Detection+Using+Magnetic+Levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Magnetic Susceptibility-Based Protein Detection Using Magnetic Levitation.</a> Analytical Chemistry. 92 (18), 12556-12563 (2020).</li>
<li>Abrahamsson, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Powders+Containing+Illicit+Drugs+Using+Magnetic+Levitation%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Internation+Edition+in+English%22%5BJournal%5D)">Analysis of Powders Containing Illicit Drugs Using Magnetic Levitation.</a> Angewandte Chemie Internation Edition in English. 59 (2), 874-881 (2020).</li>
<li>Trajkovic, K., Valdez, C., Ysselstein, D., Krainc, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+cell+density+alter+protein+markers+of+multiple+cellular+compartments%2C+confounding+experimental+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in cell density alter protein markers of multiple cellular compartments, confounding experimental outcomes.</a> PLoS One. 14 (2), 02117227(2019).</li>
<li>Hart, A., Edwards, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyant+density+fluctuations+during+the+cell+cycle+of+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Buoyant density fluctuations during the cell cycle of Bacillus subtilis.</a> Archives of Microbiology. 147 (1), 68-72 (1987).</li>
<li>Poole, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluctuations+in+buoyant+density+during+the+cell+cycle+of+Escherichia+coli+K12%3A+significance+for+the+preparation+of+synchronous+cultures+by+age+selection%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+General+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Fluctuations in buoyant density during the cell cycle of Escherichia coli K12: significance for the preparation of synchronous cultures by age selection.</a> The Journal General Microbiology. 98 (1), 177-186 (1977).</li>
<li>Cass, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density-dependent+fluctuations+in+membrane+permeability+in+logarithmically+growing+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Density-dependent fluctuations in membrane permeability in logarithmically growing cell cultures.</a> Experimental Cell Research. 73 (1), 140-144 (1972).</li>
<li>Grover, W. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single-cell+density%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Measuring single-cell density.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (27), 10992-10996 (2011).</li>
<li>Bryan, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+single+cell+mass%2C+volume%2C+and+density+with+dual+suspended+microchannel+resonators%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Measuring single cell mass, volume, and density with dual suspended microchannel resonators.</a> Lab on a Chip. 14 (3), 569-576 (2014).</li>
<li>Gomer, R. H., Jang, W., Brazill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+density+sensing+and+size+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Development%2C+Growth+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Cell density sensing and size determination.</a> Development, Growth and Differentiation. 53 (4), 482-494 (2011).</li>
<li>Neurohr, G. E., Amon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relevance+and+Regulation+of+Cell+Density%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Relevance and Regulation of Cell Density.</a> Trends in Cell Biology. 30 (3), 213-225 (2020).</li>
<li>Maric, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+gradients+in+proliferation+and+differentiation+of+embryonic+rat+CNS+accessed+by+buoyant+density+fractionation%3A+alpha+3%2C+beta+3+and+gamma+2+GABAA+receptor+subunit+co-expression+by+post-mitotic+neocortical+neurons+correlates+directly+with+cell+buoyancy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anatomical gradients in proliferation and differentiation of embryonic rat CNS accessed by buoyant density fractionation: alpha 3, beta 3 and gamma 2 GABAA receptor subunit co-expression by post-mitotic neocortical neurons correlates directly with cell buoyancy.</a> European Journal of Neuroscience. 9 (3), 507-522 (1997).</li>
<li>Maric, D., Maric, I., Barker, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyant+density+gradient+fractionation+and+flow+cytometric+analysis+of+embryonic+rat+cortical+neurons+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Buoyant density gradient fractionation and flow cytometric analysis of embryonic rat cortical neurons and progenitor cells.</a> Methods. 16 (3), 247-259 (1998).</li>
<li>Wolff, D. A., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+HeLa+cells+by+colloidal+silica+density+gradient+centrifugation.+I.+Separation+and+partial+synchrony+of+mitotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Separation of HeLa cells by colloidal silica density gradient centrifugation. I. Separation and partial synchrony of mitotic cells.</a> Journal of Cell Biology. 55 (3), 579-585 (1972).</li>
<li>Bienz, K., Egger, D., Wolff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus+replication%2C+cytopathology%2C+and+lysosomal+enzyme+response+of+mitotic+and+interphase+Hep-2+cells+infected+with+poliovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Virus replication, cytopathology, and lysosomal enzyme response of mitotic and interphase Hep-2 cells infected with poliovirus.</a> Journal of Virology. 11 (4), 565-574 (1973).</li>
<li>Baldwin, W. W., Kubitschek, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyant+density+variation+during+the+cell+cycle+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Buoyant density variation during the cell cycle of Saccharomyces cerevisiae.</a> Journal of Bacteriology. 158 (2), 701-704 (1984).</li>
<li>Yurinskaya, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymocyte+K%2B%2C+Na%2B+and+water+balance+during+dexamethasone-+and+etoposide-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Thymocyte K+, Na+ and water balance during dexamethasone- and etoposide-induced apoptosis.</a> Cellular Physiology and Biochemistry. 16 (1-3), 15-22 (2005).</li>
<li>Wyllie, A. H., Morris, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-induced+cell+death.+Purification+ad+properties+of+thymocytes+undergoing+apoptosis+after+glucocorticoid+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hormone-induced cell death. Purification ad properties of thymocytes undergoing apoptosis after glucocorticoid treatment.</a> American Journal of Pathology. 109 (1), 78-87 (1982).</li>
<li>Morris, R. G., Hargreaves, A. D., Duvall, E., Wyllie, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hormone-induced+cell+death.+2.+Surface+changes+in+thymocytes+undergoing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Hormone-induced cell death. 2. Surface changes in thymocytes undergoing apoptosis.</a> American Journal of Pathology. 115 (3), 426-436 (1984).</li>
<li>Benson, R. S., Heer, S., Dive, C., Watson, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+cell+volume+loss+in+CEM-C7A+cells+during+dexamethasone-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of cell volume loss in CEM-C7A cells during dexamethasone-induced apoptosis.</a> American Journal of Physiology. 270 (4), Pt 1 1190-1203 (1996).</li>
<li>Zipursky, A., Bow, E., Seshadri, R. S., Brown, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+density+and+volume+in+normal+subjects+and+in+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Leukocyte density and volume in normal subjects and in patients with acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 48 (3), 361-371 (1976).</li>
<li>Huber, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+the+buoyant+density+distribution+of+normal+and+malignant+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">A comparative study of the buoyant density distribution of normal and malignant lymphocytes.</a> British Journal of Haematology. 40 (1), 93-103 (1978).</li>
<li>Griwatz, C., Brandt, B., Assmann, G., Zanker, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+immunological+enrichment+method+for+epithelial+cells+from+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An immunological enrichment method for epithelial cells from peripheral blood.</a> Journal of Immunological Methods. 183 (2), 251-265 (1995).</li>
<li>Andersen, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Implementation+of+Magnetic+Levitation+to+Quantify+Leukocyte+Size%2C+Morphology%2C+and+Magnetic+Properties+to+Identify+Patients+with+Sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Shock%22%5BJournal%5D)">A Novel Implementation of Magnetic Levitation to Quantify Leukocyte Size, Morphology, and Magnetic Properties to Identify Patients with Sepsis.</a> Shock. , (2018).</li>
<li>Felton, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+quantification+of+subtle+changes+in+red+blood+cell+density+using+a+cell+phone%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+Chip%22%5BJournal%5D)">Detection and quantification of subtle changes in red blood cell density using a cell phone.</a> Lab on a Chip. 16 (17), 3286-3295 (2016).</li>
<li>Goldmacher, V. S., Tinnel, N. L., Nelson, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+that+pinocytosis+in+lymphoid+cells+has+a+low+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evidence that pinocytosis in lymphoid cells has a low capacity.</a> Journal of Cellular Biology. 102 (4), 1312-1319 (1986).</li>
</ol>

著者らは開示する矛盾はない。

勾配遠心分離は、現在、そのユニークな密度に基づいて細胞下の成分を単離するための標準的な技術です。しかし、このアプローチでは、特殊な勾配媒体と遠心分離機装置を使用する必要があります。ここで提示される磁気浮上アプローチは、循環細胞の形態学的および機能的特性の詳細な調査を可能にし、細胞の操作を最小限に抑え、循環細胞への近く in vivo アクセスを提供する。
しかし、磁気浮上を使用する場合、いくつかの点は言及する価値があります。まず、イメージングに使用される顕微鏡は、セットアップに時間がかかるため、顕微鏡を部分的に分解し、磁石とキャピラリーチューブと正確に整列した光学系と完全に水平に配置する必要があります。第二に、毛細血管ガラスと焦点の動きを調整するために使用されるラボジャックと並進ステージは、3つの軸のそれぞれで正確な位置と自由な動きを必要とします。セットアップ全体の最も重要なアライメントは、トップとボトムの磁石が重力ベクトルと完全に水平になるように、移動段階で磁気浮上装置を取り付けることです。これらの要件からの逸脱は、磁力と重力の間に角度を作り出し、細胞を毛細管の...

磁気浮上は、細胞タイプ1、2、3、タンパク質4、5、オピオイド6を分離、分析、同定するために開発された技術であり、その特異的な密度と常磁特性のみに基づいて開発された技術です。細胞密度は、その代謝率および分化状態7、8、9、10、11、12、13、14に直接関連する各細胞型の固有の固有の性質である。定常状態の間、そして様々な細胞プロセスの間に、細胞密度の微妙で一過性の変化を定量化することは、細胞生理学および病理生理学に対する比類のない洞察を与えることができる。細胞密度の変化は、細胞分化15、16、細胞周期進行9、17、18、19、アポトーシス20、21、22、23、および悪性変換24、25、26に関連付けられる.したがって、細胞密度の特定の変化の定量化は、異なるタイプの細胞間で区別するとともに、異なる活性化プロセスを経て同じタイプの細胞を区別するために使用することができる。これにより、密度の動的変化が変化した細胞代謝の指標となる特定の細胞サブ集団を標的とする実験が可能になる。変化する環境7に応じて細胞の密度を変化させる可能性が確立されたので、その密度に関連して細胞の運動を完全に理解することが不可欠であり、現在の方法では12を提供しない可能性がある。一方、磁気浮上は、細胞およびその特性28の動的評価を可能にする。
細胞は、永久的な磁気双極子モーメントを持たないという対磁性の意味です。しかし、外部磁場にさらされると、適用された磁場の反対方向に、弱い磁気双極子モーメントが細胞内に生成されます。したがって、細胞が常磁性溶液に懸濁され、強い垂直磁場にさらされると、磁源から離れて浮上し、主に個々の密度に依存する高さに停止します。不均一磁場の最小値に限定された物体の直径磁気浮上は、次の2つの基準が満たされている場合に可能です:1)粒子の磁気感受性は周囲の媒体よりも小さくなければならない、そして2)磁力は粒子の浮力のバランスを取るのに十分な強さでなければならない。両方の基準は、磁気バッファー内のRBCsを懸濁させることによって、および小さく、安価で、市販の永久磁石1を用いて強い磁場勾配を作成することによって満たすことができる。重力の方向に沿った軸上の磁気的に閉じ込められた粒子の平衡位置は、その密度(バッファの密度に対する相対)、磁気感受性(バッファの磁気感受性に対する相対)、および適用された磁場の署名によって決定されます。溶液の密度と磁気特性はシステム全体で一定なので、細胞の固有密度特性は細胞の浮上高さを決定する主要な要因となり、密度の低い細胞と比較してより密度の高い細胞が低くなります。このアプローチでは、密度測定に正確な比比分析を使用できる 2 つの密度参照ビーズ(1.05 および 1.2 g/mL)のセットを使用します。磁気溶液の濃度を変更することで、循環細胞の密度が細胞特異的であるため、細胞特異的であるため、BVCからRbcsなどの異なる細胞集団を分離することができ、分離プロトコルやその他の細胞操作の必要性が取り除かれます。
生物学研究で使用される検出方法の大半は、線形信号を定量化しやすい特定の結合事象の外挿に依存しています。これらの読み出し方法は複雑な場合が多く、特殊な機器や専門の科学担当者が関与します。細胞または細胞外小胞の形質膜上に見出される抗原の検出を目的としたアプローチ、または血漿に可溶性である、1つまたは2つの抗体被覆ビーズのいずれかを使用して、本明細書に記載される。ビーズは、互いに異なる密度で、尋問対象のビーズとは異なる密度でなければなりません。任意の特定の生体流体中の標的抗原の存在は、検出ビードに結合している抗原陽性細胞の浮上高さの特異的で測定可能な変化に翻訳される。可溶性抗原または細胞外小胞の場合、それらは捕捉および検出ビーズの両方に結合し、ビーズ細胞複合体ではなくビーズ複合体を形成する。浮上高さの変化は、ビーズ細胞またはビーズの複合体の新しい密度に依存します。生体流体中の抗原の存在を示す複合体の浮上高さの変化に加えて、複合体の数も標的の量に依存し、磁気浮上も抗原検出24のための定量的アプローチを行う。

<table><tbody><tr><td>2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸水和物</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>M-2933</td><td>(MES)活性化バッファーの成分</td></tr><tr><td>、50x2.5x1mm磁石、ニッケル(Ni-Cu-Ni)メッキ、グレードN52、厚さ5mm(0.197インチ)で磁化</td><td>K&J Magnetics</td><td></td><td>の磁気浮上装置に使用する注文の磁石</td></tr><tr><td>毛細管の密封剤(Critoseal)</td><td>Leica Microsystems</td><td>267620</td><td>毛細管の端を覆うのに使用</td></tr><tr><td>遠心分離管フィルター(Corning Costar Spin-X)</td><td>シグマAldrich</td><td>CLS8163</td><td>ビーズを洗うのに使用</td></tr><tr><td>コンパクトラボジャック</td><td>Thorlabs</td><td>LJ750</td><td>磁気浮上装置の調整に使用</td></tr><tr><td>DPBS、カルシウムなし、マグネシウムなし</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>ビーズ懸濁液用溶液</td></tr><tr><td>エタノールアミン</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9508-100ML</td><td>ビーズの洗浄ステップ中に使用</td></tr><tr><td>蛍光原形質膜染色 (CellMask Green)</td><td>Invitrogen</td><td>C37608</td><td>Rh+細胞の染色に使用</td></tr><tr><td>ガドテリドール注射</td><td>ProHance</td><td>NDC 0270-1111-03</td><td>ガドリニウム(Gd3+);細胞を懸濁するために使用される磁気溶液</td></tr><tr><td>HBSS++</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td>サンプル調製用溶液</td></tr><tr><td>ヒトC5b,6複合体</td><td>補体技術株式会社</td><td>A122</td><td>RBC Evs</td></tr><tr><td>ヒトC7タンパク質</td><td>補体技術株式会社</td><td>A124</td><td>RBC Evs</td></tr><tr><td>ヒトC8タンパク質</td><td>補体技術株式会社</td><td>A125</td><td>RBCを生成するために使用されますEvs</td></tr><tr><td>Human C9 protein</td><td>Complement Technology, Inc</td><td>A126</td><td>RBC Evs</td></tr><tr><td>Mini Series Post Collar</td><td>Thorlabs</td><td>MSR2</td><td>磁気浮上装置をラボジャックに固定するために使用</td></tr><tr><td>N-(3-ジメチルアミノプロピル)-N&prime;-エチルカルボジイミド塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E1769-10G</td><td>(EDC); 抗体カップリング反応に使用</td></tr><tr><td>正常なウサギIgGコントロール</td><td>R&D Systems</td><td>AB-105-C</td><td>制御条件としてビーズのコーティングに使用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (10X Solution, pH 7.4)</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td>カップリング緩衝液の成分、洗浄ステップに使用</td></tr><tr><td>ポリソルベート 20 (Tween 20)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7949-500ML</td><td>活性化緩衝液の成分</td></tr><tr><td>ポリスチレン カルボキシルポリマー</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PC06004</td><td>抗体カップリングに使用されるトップ密度ビーズ(1.05 g/mL)</td></tr> ウサギ<tr><td>RhDポリクローナル抗体</td><td>Invitrogen</td><td>PA5-112694</td><td>赤血球中のRh因子のデクテクション用ビーズのコーティングに使用</td></tr><tr><td>研究用顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>プロビスAX-70</td><td>顕微鏡 磁気浮上装置の取り付けと浮上細胞の表示に使用</td></tr><tr><td>ゴム製減衰脚</td><td>Thorlabs</td><td>RDF1</td><td>ブレッドボードテーブルを支えるために使用</td></tr><tr><td>スクエアボロチューブ</td><td>VitroTubes</td><td>8100-050</td> Maglev <td></td></tr><tr><td>Sulfo-NHS</td><td>Thermoscientific</td><td>24510</td>にサンプルをロードするために使用される <td>抗体カップリング反応に使用</td></tr><tr><td>トランスレーショナルステージ</td><td>Thorlabs</td><td>PT1</td><td>キャピラリーチューブのフォーカシングとスキャンに使用</td></tr></tbody></table>

磁気浮上を用いた細胞密度と抗原特性の定量化

Quantification of Cellular Densities and Antigenic Properties using Magnetic Levitation

この方法は、密度と磁気特性に基づいて細胞と粒子を分離する磁気浮上の原理に基づいて開発されました。密度は細胞型識別性であり、その代謝率、分化、および活性化状態に直接関連する。磁気浮上により、循環血液細胞を分離し、画像化、特徴付け、密度や磁気特性に基づいて貧血、鎌状赤血球病、循環腫瘍細胞を検出するワンステップアプローチが可能になります。このアプローチは、それぞれ、捕獲および検出抗体でコーティングされた低密度および高密度ビーズのセットを使用して、溶液中に存在する可溶性抗原を検出するのに適しています。抗原が溶液中に存在する場合、それはビーズの2つのセットを橋渡しし、抗体コーティングされたビーズの列の間に浮上する新しいビーズ複合体を生成します。溶液中の標的抗原の濃度の増加は、より低い濃度の抗原と比較してより多くのビーズビーズ複合体を生成し、したがって標的抗原の定量的測定を可能にする。磁気浮上は、サンプル調製時間の短縮と古典的な読み出し方法への依存性の欠如のために他の方法に有利である。生成された画像は、スマートフォンやタブレットなどの標準的な顕微鏡やモバイルデバイスを使用して簡単にキャプチャおよび解析できます。

磁気浮上は、物体の密度、磁気シグネチャ、常磁性溶液の濃度、および2つの強い希土類磁石によって生み出される磁場の強さに応じて、異なる浮上高さで異なる密度の物体に焦点を当てます。2つの磁石が互いの上に置かれると、浮上サンプルは、ケーラーの照明を維持したまま、その側面に向けられた顕微鏡を使用することによってのみ見ることができる(図1)。各細胞型が到達した最終的な浮上高さは、常磁性溶液の濃度を変えることで簡単に修正できます。図2は、ガドリニウムの種々の濃度を用いて異なる循環血液細胞の分離を示す。密度が異なる 2 つのビード タイプ(1.05 および 1.2 g/mL)は、密度浮上高さとサイズ参照を提供するために使用されました。特定の細胞型の浮上高さは、その固有の密度に依存するので、磁気浮上は、重要な操作24を伴わずに目的の細胞を単離する直接的な手段を提供する。このプロトコルの主な目的は、循環赤血球上の膜結合抗原(この場合はRh因子)の存在を検出する磁気浮上の能力を実証することであ...

この論文では、固定密度の捕捉ビーズの浮上高さの変化を定量化することによって、可溶性または膜結合性の抗原の存在を特異的に検出できる磁気浮上ベースの方法について述べる。

The described method was developed based on the principles of magnetic levitation, which separates cells and particles based on their density and magnetic ...

この技術により、短期間で操作をほとんどまたはまったく行なうだけで、密度のみに基づいて様々なプロセスを経て様々な細胞タイプと細胞を分離することが可能になります。この方法の主な利点は、それが最小限の侵襲的な、少量を必要とし、高速な結果を提供し、古典的な読み出しに依存せず、専門の人員が必要とされないことです。この技術は、例えば貧血や敗血症などの複数の疾患を検出するために適用することができる。1回クリックランシング装置を使用して、アカゲサス因子陽性血液ドナーの指を刺し、1ミリリットルのDPBSで10マイクロリットルの血液を採取する。アカゲサス因子陽性細胞の1ミリリットルの懸濁液に1マイクロリットルの蛍光色素を加えて、細胞膜を蛍光染色し、37°Cで15分間インキュベートします。ペレットは、Gを5,600回Gで15秒間回転させて、1ミリリットルのDPBSを用いてペレットを3回洗浄した。カルシウムとマグネシウムで1ミリリットルのHBSSでペレットを再懸濁します。ワンクリックランシングデバイスを使用して、アカゲサス因子陰性血液ドナーの指を刺し、2マイクロリットルの血液を収集します。ビーズのみを含む実験チューブを調製するには、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSの174マイクロリットル、IgGコントロールビーズの1マイクロリットル、1ミリリットル密度あたり1.2グラムの重いビーズの1マイクロリットル、500ミリモルガドリニウムの24マイクロリットルを追加します。IgGを含む実験用制御チューブを調製するには、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSの172マイクロリットル、IgGコントロールビーズの1マイクロリットル、重いビーズの1マイクロリットル、アカゲサス因子陰性血液の1マイクロリットル、染色されたアカゲザル因子陽性血液懸濁液の1マイクロリットル、および500ミリモルガドリニウムの24マイクロリットルを加える。サンプル実験管を調製するには、カルシウムとマグネシウムを含むHBSSの172マイクロリットル、抗RhDコーティングビーズの1マイクロリットル、重いビーズの1マイクロリットル、アカゲザル因子陰性血液の1マイクロリットル、染色されたアカゲザル因子陽性血液懸濁液の1マイクロリットル、および500ミリモルガドリニウムの24マイクロリットルを加えます。磁気浮上装置をセットアップします。そして、チューブが満たされるまで、サンプルの50マイクロリットルをキャピラリーチューブに積み込みます。毛細管の端部を毛細管シーラントで密封し、気泡がないことを確認します。上と下の磁石の間のキャピラリーホルダーにキャピラリーチューブを置き、最適な視聴のためにステージとフォーカスを調整します。細胞とビーズが磁気平衡位置に落ち着くまで約5~20分待ちます。このプロトコルを用いて、血液細胞は、磁気浮上装置を用いて浮上高さに応じて分離した。密度の高さとサイズの参照を提供するために、低密度および高密度のビーズが使用されました。多形核細胞を21ミリモルガドリニウムイオン濃度で赤血球の上方に浮上した。古い血液細胞は、60ミリモルガドリニウムイオン濃度で浮上した。赤血球、多形核細胞、リンパ球は、その固有の密度に基づいて40ミリモルガドリニウムイオン濃度で分離した。IgGおよび抗RhD抗体被覆ビーズを用いて赤血球上でアゲージ因子抗原を検出した。IgG対照試料ではビーズ赤細胞複合体は生成されなかったが、アキサス因子陽性ビーズによって捕捉された蛍光染色された赤血球が検出された。抗RhBとアカゲウス因子陽性細胞との結合により、非結合ビーズと陰性赤血球の間欠密度で中心にビーズ細胞複合体が作成された。また、発光蛍光を観察することによって複合体形成を確認した。Cr1およびCD47用の抗体でコーティングされた高密度ビーズと低密度ビーズの間に形成されたBビーズ複合体は、細胞外小胞由来の赤血球の存在を示す。気泡を導入せずに毛細血管をキャッピングすることは最も困難なステップであり、練習が必要です。この方法は、特に赤血球病に焦点を当てた血液学の洞察を提供することができます。

quantification-cellular-densities-antigenic-properties-using-magnetic

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオは、磁気浮上装置を使用して血液サンプル中のアカゲザル(Rh)因子の検出を示しています。磁場は、密度に基づいてビーズと血液細胞を整列させ、浮上させます。サンプルを抗Rh抗体で処理すると、中密度のビーズ細胞複合体が形成され、Rh陽性とRh陰性の赤血球の分化が可能になります。...

磁気浮上法によるヒト血液試料中のアカゲザル因子の検出

このビデオは、異なるセットに染色されたカルボキシル化磁性ポリスチレン微小球を使用した多重化された定量的細菌検出を示しています。この手順には、ビーズ-バクテリア複合体の形成、磁気分離、およびフローベースの分析が含まれ、同じ反応ウェル内の複数のバクテリアの正確かつ同時定量が可能になります。...

色素標識磁性ミクロスフェアを用いたマルチプレックス定量的細菌検出

リンパ球は、適応免疫応答の主要なプレーヤーです。ここでは、in vitroおよびin...

単離とマウスリンパ球の活性化

私たちは、スマートフォン互換デバイスと組み込みイメージングと処理を備えたデバイスの両方で、自動イメージングと分析を組み合わせた磁気浮上技術を紹介します。これは、鎌状赤血球症の診断と白血球と赤血球の分離という2つの生物医学的応用が実証された細胞の密度分布を測定するために適用されます。...

病の診断のためのポータブルイメージングおよび分析と相まって磁気浮上

ウイルスまたは細胞外小胞は、表面抗原を認識する抗体に結合した15nmの磁性ナノ粒子で免疫捕捉されました。捕捉されたビリオンまたは小胞は、他の表面抗原に対する蛍光抗体で標識されました。得られた複合体を高磁場中で分離し、蛍光でトリガーされる従来のフローサイトメーターで分析しました。...

ビリオンの抗原性スペクトルと細胞外ベシクルを分析するためのフローVirometry

機能的および表現型分析のために、抗原反応性B細胞を検出し、豊かに磁性ナノ粒子を使用するシンプルで効果的な方法が記載されています。...

表現型および機能解析のためのレア抗原特異的B細胞の検出および濃縮

抗原特異的 T 細胞は特性またはその極低周波による治療を利用しにくい。本明細書で我々 はこれらの細胞を豊かにする抗原特異的 T 細胞に結合することができます磁性粒子を開発するためのプロトコルを提供し、それらをいくつか展開する特性評価および治療の両方の 100...

豊かにし、磁性ナノ粒子でまれな抗原特異的 T 細胞を展開

ここでは、原発性ヒト単球単球単球の分離に関するプロトコルと、マクロファージおよび樹状細胞への分化、および上皮細胞を有する多細胞ヒト肺モデルへの組み立てのためのプロトコルを提示する。免疫細胞からなる共培養物の生物学的応答は、単球または解凍された単球から分離し、炎症促進性刺激に曝露した際に、比較される。...

危険評価のための上皮細胞と原発性免疫細胞からなる多細胞ヒト歯槽モデル

酸化鉄ナノ粒子は、非水性ゾルゲル法を介して合成され、アニオン性短分子またはポリマーでコーティングされる。ヒト幹細胞内部の磁気ナノ粒子の組み込みや生体変換をモニタリングするための磁気測定の使用は、振動試料磁力計(VSM)を用いて実証されています。...

磁気測定を用いて細胞の組み込みとそれに続く化学的合成酸化鉄ナノ粒子の生分解をモニタリングする

ここでは、ビーズ支持脂質二重層を用いた合成抗原提示細胞の段階的再構成のためのプロトコルと、活性化T細胞からのシナプス出力を調べるためのそれらの使用を提示する。...

T細胞免疫シナプスの粒子出力を研究するためのビーズ担持脂質二重層の調製

学ぶ磁気浮上法による血液細胞の密度分離と抗原検出技術。赤血球のRh因子を迅速かつ低侵襲で識別し、貧血や敗血症などの血液疾患診断に応用可能な革新的な検査手法です。

磁気浮上を用いた細胞密度と抗原特性の定量化

さらに動画を探す