Name: 質量分析のための最適な切削温度化合物に包埋されたヒト組織の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: 学ぶ OCT化合物を除去しヒト組織からスフィンゴ脂質を抽出・定量する質量分析プロトコル。バイオリポジトリ試料を用いた脂質解析と疾患研究への応用を解説します。

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研究プロジェクトのサービスとサポートは、VCU Massey Cancer Center Tissue and Data Acquisition and Analysis CoreとVCU Lipidomics and Metabolomics Coreによって提供され、NIH-NCIがんセンター支援助成金P30CA016059からの資金提供を受けて部分的に支援されています。この研究は、国立衛生研究所助成金R21CA232234(サンティアゴリマ)の支援を受けました。

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<li>Ogretmen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid+metabolism+in+cancer+signalling+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid metabolism in cancer signalling and therapy.</a> Nature Reviews. Cancer. 18 (1), 33-50 (2018).</li>
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<li>Weston, L. A., Hummon, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+LC-MS%2FMS+analysis+of+optimal+cutting+temperature+%28OCT%29+compound+removal+for+the+study+of+mammalian+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">Comparative LC-MS/MS analysis of optimal cutting temperature (OCT) compound removal for the study of mammalian proteomes.</a> Analyst. 138 (21), 6380-6384 (2013).</li>
<li>Holfeld, A., Valdés, A., Malmström, P. -U., Segersten, U., Lind, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+proteomic+workflow+for+mass+spectrometric+analysis+of+tissue+samples+preserved+by+different+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Parallel proteomic workflow for mass spectrometric analysis of tissue samples preserved by different methods.</a> Analytical Chemistry. 90 (9), 5841-5849 (2018).</li>
<li>Zhang, W., Sakashita, S., Taylor, P., Tsao, M. S., Moran, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+proteome+analysis+of+fresh+frozen+and+optimal+cutting+temperature+%28OCT%29+embedded+primary+non-small+cell+lung+carcinoma+by+LC-MS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Comprehensive proteome analysis of fresh frozen and optimal cutting temperature (OCT) embedded primary non-small cell lung carcinoma by LC-MS/MS.</a> Methods. 81, 50-55 (2015).</li>
<li>Shah, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+proteomics+using+chemical+immobilization+and+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Tissue proteomics using chemical immobilization and mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 469, 27-33 (2015).</li>
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著者は開示するものは何もありません。

OCTは、バイオリポジトリで使用される一般的な長期凍結保存剤です。しかしながら、OCTは、組織が様々な質量分析プラットフォーム12、13、14、15によって分析されるときにイオン抑制をもたらし、またはサンプルがLC-ESI-MS/MS 11によって分析されるときにシグナルの損失をもたらし得る。凍結保存された組織中のOCTは、ブラッドフォードやBCA11などの計量やタンパク質定量アッセイなどの組織正常化方法にも干渉する可能性があります。ここでは、ヒト組織からOCTを除去し、その後質量分析によって分析するための詳細なプロトコルを提示します。プロトコルは、肺ではない他の組織源を使用するように、または我々が以前に説明したようにマウス組織からのものを使用するように改変され得る<sup class="...

スフィンゴ脂質は、ヒトの代謝および疾患における役割で知られている生理活性代謝物です1,2。それらは、細胞移動、細胞の生存と死、細胞の動き、小胞輸送、細胞の浸潤と転移、血管新生、サイトカインの産生などの複雑な細胞プロセスを調節します1,2,3,4,5,6,7,8,9 .スフィンゴ脂質代謝の調節における欠陥は、癌の開始および進行に寄与し、癌がどれほど攻撃的であるか、および癌がどのように反応し、治療に対する耐性を発達させるかを決定する3,10。したがって、疾患の病因に対するこれらの広範な影響のために、疾患特異的スフィンゴ脂質の変化を正確に確立できる分析方法は重要なツールです。質量分析(MS)は、スフィンゴ脂質の変化を分析するための最も正確で信頼性の高い方法です。
スフィンゴ脂質の変化の分析に使用できるヒト検体は、手術室から前向きに、または組織バイオリポジトリから遡及的に取得できます。手術からの新鮮な組織は、MSまたは他の分析方法によって直接分析することができるので有利である。ただし、組織を前向きに取得するには、管理上、技術上、およびロジスティック上のハードルがあり、統計的検出力に到達するのに十分な標本を収集することは困難な場合があります。バイオレポジトリーから組織を取得することは、遡及的に大量に取得でき、バイオリポジトリは組織学と病理を確認し、標準的な操作手順を使用して組織を極低温で保存し、相関分析に使用できる臨床病理学的データを提供できるため、有利です。しかし、分子的および構造的特徴を維持するために、バイオリポジトリは組織を最適切断温度(OCT)化合物に埋め込むことによって凍結保存することができ、これはデータ正規化アッセイおよび液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)によるスフィンゴ脂質の定量を妨げることを示しました11。.また、OCT化合物の主成分であるポリビニルアルコールおよびポリエチレングリコールが、他のMS分析プラットフォームにおいてイオン抑制をもたらすことも示されている12、13、14、15。したがって、OCT化合物は、MSによるスフィンゴリピドミック分析の前に組織から除去する必要があります。
以前のレポートでは、LC-ESI-MS/MS分析のためのヒト検体からのOCT化合物の除去プロトコル11 と、データ正規化のための組織の計量に使用される方法論11を検証しました。ここでは、スフィンゴリピドミックOCT化合物除去プロトコル(sOCTrP)の手順を詳述し、ヒト肺腺癌腫瘍および正常な隣接非関与組織からの代表的なデータを示します。

<table><tbody><tr><td>1 mLポリプロピレンピペットチップ</td><td>NA</td><td>NA</td><td>検体回収に使用</td></tr><tr><td>1.5 mLポリプロピレン遠心チューブ</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>10 mL 三角フラスコ</td><td>VWR</td><td>89091-116</td><td>チューブと組織の計量に使用</td></tr><tr><td>AB Sciex Analyst 1.6.2</td><td>Sciex</td><td>NA</td><td>MSデータを分析および統合するソフトウェア</td></tr><tr><td>ギ酸アンモニウム</td><td>フィッシャーScientific</td><td>A11550</td><td>LC移動相用</td></tr><tr><td>分析スケール</td><td>NA</td><td>0.1mgの精度を持つ</td><td>NA</td>スケール</tr><tr><td>ボトルトップディスペンサー</td><td>ザルトリウス</td><td>LH-723071</td><td>溶媒の分注に使用</td></tr><tr><td>C12-セラミド(d18:1/C12:0);N-(ドデカノイル)-スフィング-4-enine</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>LM2212</td><td>内部標準</td></tr><tr><td>C12-グルコシルセラミド(d18:1/12:0);N-(ドデカノイル)-1-&β;-グルコシルスフィング-4-eine</td><td>Avanti極性脂質</td><td>LM2511</td><td>内部標準</td></tr><tr><td>C12-ラクトシルセラミド(d18:1/12:0);N-(ドデカノイル)-1-&szlig;-ラクトシルスフィング-4-エン</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>LM2512</td><td>内部標準</td></tr><tr><td>C12-スフィンゴミエリン&nbsp;(d18:1/C12:0), N-(ドデカノイル)-スフィング-4-エニン-1-ホスホコリン</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>LM2312</td><td>内部標準</td></tr><tr><td>クロロホルム OMNISOLV 4L</td><td>VWR</td><td>EM-CX1054-1</td><td></td></tr><tr><td>ClickSeal バイオコンテインメント 蓋</td><td>Thermo Scientific</td><td>75007309</td><td>遠心分離中のバイオハザードエアレゾールを防止するため</td></tr><tr><td>Conflikt</td><td>Decon Labs</td><td>4101</td><td>除染剤</td></tr><tr><td>CTO-20A / 20ACカラムオーブン</td><td>島津</td><td></td><td>NALC</td></tr><tr><td>d17:1-スフィンゴシン;&nbsp;(2S,3R,4E)-2-アミノヘプタデク-4-エン-1,3-ジオール</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>LM2000</td><td>内部標準</td></tr><tr><td>d17:1-スフィンゴシン-1-リン酸; ヘプタデカスフィング-4-エニン-1-リン酸</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>LM2144</td><td>内部標準</td></tr><tr><td>DGU20A5R脱気装置</td><td>島津</td><td>製作所NA</td><td></td></tr><tr><td>ディスポーザブル培養チューブ 13x100mm</td><td>VWR</td><td>53283-800</td><td>13x100 mm スクリュートップチューブ</td></tr><tr><td>温水浴</td><td>NA</td><td>NA</td><td>一晩の脂質抽出用</td></tr><tr><td>ホモジナイザー 150</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>15-340-167</td><td>トリーツ組織</td></tr><tr><td>ホモジナイザー プラスチック使い捨て発電機 プローブ</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>15-340-177</td><td>均質化用</td></tr><tr><td>キムワイプ キム</td><td>テック</td><td>34120</td><td>芯を作るために使用される実験室グレードの組織</td></tr><tr><td>メタノール LC-MS グレード 4L</td><td>VWR</td><td>EM-MX0486-1</td><td></td></tr><tr><td>Nexera LC-30 ADバイナリポンプシステム</td><td>島津</td><td>NA</td><td>LC-MS用</td></tr>永久<tr><td>マーカーVWR</td><td>52877-310</td><td></td><td></td></tr><tr><td>フェノールねじ閉鎖、キンブルチェイス(使い捨て培養チューブ用キャップ)</td><td>VWR</td><td>89001-502</td><td>13x100 mmスクリュートップチューブキャップ</td></tr>リン<tr><td>酸塩バフ加工生理食塩水</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td>洗浄後にチューブから検体を回収するには</td></tr><tr><td>リピーターピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>4987000118</td><td>LC-MSの内部標準液を分注するには</td></tr><tr><td>スクリューキャップ、青、赤 PTFE/白 シリコーン</td><td>VWR</td><td>89239-020</td><td>オートインジェクターバイアル</td></tr>キャップ <tr><td>IDパッチ付きスクリュースレッドガラスバイアル</td><td>VWR</td><td>46610-724</td><td>オートインジェクターバイアル</td></tr><tr><td>SIL-30ACオートインジェクター</td><td>島津</td><td>製作所 NA</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Scientific</td><td>SPD2030P1220</td><td>乾燥溶媒用</td></tr><tr><td>Supelco 2.1 (i.d.) x 50 mm Ascentis Express C18 カラム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>581300-U</td><td>LC-MS</td></tr><tr><td>用 トリプルクワッド 5500+ LC-MS/MS System</td><td>Sciex</td><td>NA</td><td>LC-ESI-MS/MS用</td></tr><tr><td>超音波ウォーターバス</td><td>ブランソン</td><td>モデル2800</td> 抽出<td>および乾燥脂質の均質化と再懸濁用</td></tr><tr><td>ボルテク</td><td>サーNA</td><td>NA</td><td>sOCTrPおよび乾燥脂質の再懸濁用</td></tr><tr><td>VWR培養チューブ 使い捨てホウケイ酸ガラス</td><td>VWR</td><td>47729572</td><td>13x100 ガラス培養チューブ</td></tr><tr><td>水 Hipersolve Chromanorm LC-MS</td><td>VWR</td><td>BDH83645.400</td><td></td></tr></tbody></table>

質量分析のための最適な切削温度化合物に包埋されたヒト組織の調製

Preparation of Human Tissues Embedded in Optimal Cutting Temperature Compound for Mass Spectrometry Analysis

スフィンゴ脂質は、ヒトの代謝および疾患において十分に確立された役割を有する細胞成分である。質量分析は、スフィンゴ脂質が疾患において変化しているかどうかを決定し、スフィンゴ脂質が臨床的に標的化できるかどうかを調べるために使用することができる。ただし、手術室から直接組織を取得する適切な検出力の前向き研究は、時間がかかり、技術的、ロジスティック的、および管理的に困難な場合があります。対照的に、後ろ向き研究は、組織バイオリポジトリですでに入手可能な、通常は大量に凍結保存されたヒト検体を利用することができます。バイオレポジトリーから組織を調達する他の利点には、組織学、病理学、および場合によっては臨床病理学的変数を含む組織標本に関連する情報へのアクセスが含まれ、これらはすべてリピドミクスデータとの相関を調べるために使用することができる。しかしながら、凍結保存および質量分析に使用される最適切断温度化合物(OCT)の非適合性に関連する技術的限界は、脂質の分析のための技術的障壁である。しかし、OCTは、スフィンゴ脂質含有量を変えることなく、洗浄と遠心分離のサイクルを通じて、ヒトバイオリポジトリ標本から簡単に除去できることを以前に示しました。また、OCTで凍結保存されたヒト組織中のスフィンゴ脂質は、最大16年間安定していることを以前に確立しました。本報告では、OCTに埋め込まれたヒト組織検体中のスフィンゴ脂質分析の手順とワークフローについて、組織の洗浄、データ正規化のための組織の計量、脂質の抽出、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析(LC-ESI-MS/MS)による分析用サンプルの調製、質量分析データ統合、データ正規化、データ解析などについて概説する。

このプロトコルでは、凍結保存されたヒト組織からOCTを除去し、LC-ESI-MS/MSによる分析のために組織を計量する方法について詳しく説明します。この手順に必要な材料は、材料表にリストされています。図1に示すのは、10個のヒト肺腺癌腫瘍と10個の正常隣接組織を洗浄してOCTを除去し、LC-ESI-MS/MSで分析した典型的な実験の結果です。 重要なことに、11を以前に示したように、肺腺癌腫瘍では、正常な隣接非関与組織と比較して有意に上昇しているセラミド(図1A)およびモノヘキソシルセラミド(図1B)にはさまざまな鎖長種があります。
セクション4で概説した脂質抽出ステップに対するOCTの効果を評価するための対照実験では、200 mgのマウス肝臓(C57BL6;男性;14〜16週齢)を2 mLのリン酸緩衝生理食塩水に再懸濁し、...

スフィンゴ脂質は、ヒトの疾患において十分に確立された役割を有する生理活性代謝物である。質量分析で組織の変化を特徴づけることで、疾患の病因における役割を明らかにしたり、治療標的を特定したりすることができます。しかし、バイオリポジトリでの凍結保存に使用されるOCT化合物は、質量分析を妨害します。OCTに包埋したヒト組織中のスフィンゴ脂質をLC-ESI-MS/MSで解析する方法を概説する。

Sphingolipids are cellular components that have well-established roles in human metabolism and disease. Mass spectrometry can be used to determine whether ...

OCTは質量分析と両立しない凍結保存剤です。このプロトコルを使用すると、研究者は組織からOCTを除去し、タンデム液体クロマトグラフィー質量分析でスフィンゴ脂質を定量できます。組織乾燥芯の準備、組織洗浄、および組織計量は、バージニアコモンウェルス大学のエイプリルボイドによって実証され、脂質抽出は、バージニアコモンウェルスメタボロミクスおよびリピドミクスコアのディレクターであるジェレミーアレグッド博士によって実証されます。まず、外科用ハサミをメタノールに5分間浸してきれいにし、次にきれいな実験室グレードのティッシュで拭きます。パウダーフリーの手袋を使用して、実験室グレードのティッシュの端を回転させて、細かく先細りの30〜40ミリメートルの長さの芯を作成します。次に、メタノールで洗浄したはさみを使用して、厚い端の芯を切り、きれいな段ボール箱に入れます。次に、メタノール洗浄ハサミを使用して、1ミリリットルのピペットチップの先端から4〜5ミリメートルを切り取り、チップホルダーに戻します。組織からOCTを洗い流すには、人間の肺組織を含む各チューブに10ミリリットルの氷冷超高純度脱イオン水を加え、しっかりと蓋をします。チューブを10分間インキュベートします。チューブまたは組織ペレットの壁に堆積したすべての組織が完全に再懸濁されるまで、各チューブを激しくボルテックスします。次に、摂氏 4 度で 10 分間、 4 、 000 〜 5 、 000 倍の G でプレチルドスイングバケット遠心分離機でチューブを遠心分離します。遠心分離が完了したら、氷上でチューブのキャップを外します。洗浄液を慎重に吸引し、チューブ内に約0.5ミリリットルの上清を残してから、チューブをキャップします。すべてのチューブから上清を除去した後、同じ方法で組織をさらに2回洗浄します。OCT除去を3回洗浄した後、準備した短縮ピペットチップを使用して、500マイクロリットルの氷冷PBSをチューブに加えます。同じチップを使用して、ペレットを静かに再懸濁し、再懸濁したすべての組織を、事前にラベル付けされ、事前に計量された1.5ミリリットルの遠沈管に移します。すべての組織サンプルが移されるまで、チューブを氷上に置いておきます。事前に冷却された遠心分離機でチューブを遠心分離して組織をペレット化し、ペレットを乱さずにできるだけ多くのPBSを注意深く吸引し、チューブを氷上に戻します。前に準備したティッシュ乾燥芯を使用して、残っている洗浄液をそっと取り除き、チューブを閉じて氷の上に置きます。チューブの重量を量るには、最近校正されたタール処理およびゼロ分析天びんに一度に1本のチューブを置き、チャンバーのドアを閉じます。体重が安定したら、電子スプレッドシートに記録します。計量後、チューブを氷上に戻し、300マイクロリットルの氷冷PBSを加えます。短くしたピペットチップを使用して、すべての組織を、事前にラベル付けされたスクリュートップガラスチューブ内の2ミリリットルの氷冷メタノールに慎重に移します。脂質抽出の前に、組織および質量分析の内部脂質標準物質を室温に20分間平衡化させ、次に脂質標準物質が完全に溶解するまで内部標準物質溶液をボルテックスして超音波水浴に浸します。繰り返しピペットを使用して、内部質量分析標準の250ピコモルを各チューブに追加し、チューブを軽く要約します。均質化を容易にするために、メタノールの容量を2ミリリットルに調整し、次にホモジナイザーの先端をチューブ壁にそっと押し付けて円を描くように動かして、ホモジナイザーを使用して組織を粉砕します。塊が見えなくなったら、チューブを要約します。チューブを超音波水浴に45度の角度で5〜10秒間浸します。次に、ヒュームフードの下で、各チューブにクロロホルムとメタノールを追加して、メタノールとクロロホルムと水の比率を2対1から0.1にします。チューブをしっかりと密封し、一日の終わりまでベンチトップに置いておきます。その夜出発する前に、しっかりと蓋をしたチューブを摂氏48度の水浴に入れて一晩インキュベートします。翌日、任意の溶媒および可溶性破片を遠心分離によりペレット化する。次に、ヒュームフード内で、上清を事前にラベル付けされた13に慎重にデカントし、デカンテーションを容易にするために30〜45度の角度で傾けた100ミリメートルのホウケイ酸ガラス試験管に入れます。すべてのチューブから上清をデカントした後、最大真空で真空濃縮器を使用し、摂氏40度で最初の1時間の加熱ステップですべての溶媒を蒸発させ、次に各チューブに500マイクロリットルのメタノールを追加します。乾燥した脂質抽出物を再懸濁するには、チューブを5〜10秒間ボルテックスしてから、チューブを45度の角度で2分間回転させて超音波水浴に浸します。チューブを5秒間再ボルテックスし、さらに1分間超音波水浴に再度浸します。遠心分離によって不溶性の破片を取り除き、デカンテーションを容易にするために、上清を30〜45度の角度で傾けた事前にラベル付けされたオートインジェクターバイアルにデカントします。分析するまで摂氏マイナス80度で保管する前に、バイアルをしっかりと蓋をしてください。OCT除去後の液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析分析により、ヒト肺腺癌腫瘍では、正常な隣接非関与組織と比較して、さまざまな鎖長種のセラミドおよびモノヘキソシルセラミドが有意に上昇していることが確認されました。スフィンゴ脂質標準物質は、d17:1スフィンゴシン、d17:1スフィンゴシン-1-リン酸、C12ラクトシルセラミド、C12モノヘキソシルセラミド、C12スフィンゴミエリン、C12セラミドの順に溶出します。これらのスフィンゴ脂質種のそれぞれについて、テキストの勾配とインストルメンテーションの設定を使用して、鎖長の2つの炭素増加ごとに保持時間に約0.15分の正のシフトがあります。ただし、C24やC26などの鎖長の長い脂質は、保持時間のシフトが大きくなる可能性があります。さらに、脂肪酸の二重結合は、保持時間の負の0.15分のシフトをもたらすことがよくあります。したがって、C18:1セラミドの保持時間はC16セラミドと同様です。このプロトコルは、採取したばかりの組織にほぼ独占的に依存するのではなく、質量分析に使用できる組織源を拡張して、バイオリポジトリに極低温で保存された組織源を含めます。

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質量分析によるエピジェネティックプロファイリングのための臨床標本からヒストン抽出

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