Name: BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 44 s
Description: 学ぶ BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたDNA二本鎖末端切除の定量法。HeLa細胞を用いた免疫蛍光プロトコルで、相同組換えと非同源性末端結合を区別し、PARP阻害剤耐性メカニズムの研究に有用です。

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マリー=クリスティーヌ・キャロンの卓越した技術的アドバイスに感謝します。この研究は、カナダ衛生研究所J.Y..M(CIHR FDN-388879)からの資金提供によって支えられています。J.-Y..M.は、DNA修復およびがん治療のTier 1カナダ研究委員長を務めています。J.O'SはFRQS博士課程の学生フェローであり、S.Y.MはFRQSポスドクフェローです。

1. 細胞培養、処理、およびカバースリップの準備
注: すべての細胞プレーティング、トランスフェクション、および処理は、照射を除き、滅菌細胞培養フードの下で行う必要があります。
<ol><li>1日目<ol>
<li>6 ウェルプレートに、各ウェルに 1 つのカバースリップを 1 つの条件だけ配置し、必要な条件だけ配置します。必要に応じて、トランスフェクションまたは薬物処理のための〜150,000個のHeLa細胞をプレート化します。 注: トランスフェクションを行う場合は、めっき時に逆方向トランスフェクションを行うか、めっきの数時間後に順方向トランスフェクションを実行して付着性を保つことをお勧めします。逆トランスフェクションは、細胞が加えられる前にトランスフェクションミックスをカバースリップに加えることによって達成されます。したがって、トランスフェクションは細胞が接着し始める前に開始されます。対照的に、フォワードトランスフェクションは、通常翌日に表面に付着後のトランスフェクションミックスを添加することです。しかし、細胞が接着するのに十分な時間が与えられれば、これを同じ日に行うことができる。</li>
		<li>この方法のために、4つのウェルを使用する:ウェル1:siRNAコントロール(siCTRLと呼ばれる);ウェル2:PARP−1に対するsiRNA(siPARP−1);ウェル3:未処理;ウェル4:照射の1時間前に5 μM BMN673で処理する細胞。 注:このプロトコルでは、すべてのテストは照射条件下で実施されました(セクション1.3を参照)。</li>
		<li>トランスフェクションプロトコルでは最大3日間のインキュベーションが可能ですが、5% CO2加 湿インキュベーターで37°Cで一晩インキュベートします。BrdU処理前のインキュベーション時間は、siRNAトランスフェクション効率に依存する。トランスフェクションがない場合、16時間のインキュベーションでカバースリップへの付着と細胞増殖を可能にするのに十分です。 注:インキュベーターの条件は、使用する細胞株に応じて変更することができます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>2日目<ol>
<li>適切な培養培地に終濃度10μMのBrdUを添加し、16時間(1細胞周期)インキュベートする。 注:BrdU溶液はジメチルスルホキシド中で調製される。使用した原液は10mMであり、-20°Cでアリコートに貯蔵される。</li>
	</ol>
</li>
	<li>3日目<ol>
<li>プレートに総線量5GyのX線照射(例えば、小動物用照射器とベンチトップ型照射器など、照射器の種類によって照射線量が異なります)を照射します。使用した照射器のブランドとモデルについては、 材料表 を参照してください。</li>
		<li>プレートをインキュベーターに戻し、3時間細胞を解放する。</li>
		<li>3時間のインキュベーション期間中、2つの緩衝液、AおよびB、ならびに4%パラホルムアルデヒド(PFA)を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に調製する。 注:緩衝液AおよびBおよびスクロースは、汚染を防ぐために新鮮なスクロース溶液を使用して、固定の日に新鮮に調製する必要があります。<ol>
<li>緩衝液A(抽出前緩衝液)を、 表1に記載の順序(30mL)に従って調製する。 注:1Mスクロースは、汚染を防ぐために使用日に準備する必要があります。</li>
			<li>表1に記載の順序に従って緩衝液B(細胞骨格剥離緩衝液)(30mL)を調製する。 注:緩衝液Bは、Tween-20およびデオキシコール酸ナトリウム溶液の沈殿を防ぐために、引用された順序で調製されなければならない。</li>
			<li>4%PFA、1条件あたり2mL(10mL)を、化学フードの下で調製する(表1)。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 事前抽出と固定
注:すべての事前抽出および固定は、氷上または4°Cで組織培養プレートに残っているカバースリップで行われます。カバースリップは、取り付けの最後のステップでのみ持ち上げられます(説明を参照)。
<ol><li>抽出前<ol>
<li>培地を吸引し、細胞を1x PBSで2回注意深く洗浄し、PBSを除去した。2mLの抽出前バッファーAを加え、直ちに4°Cで10分間インキュベートする。 注:バッファー A でのインキュベーション時間が延長されないことが重要です。抽出前バッファーでの長時間のインキュベーションは、カバースリップから剥離した細胞の数の増加をもたらすでしょう。あるいは、4°Cでのインキュベーションの代わりに、氷上でインキュベーションを行うこともできます。</li>
		<li>吸引によってバッファAを除去します。 メモ: バッファ A を取り外した後はカバースリップを洗わないでください。次の手順に進みます。</li>
		<li>2mLの細胞骨格ストリッピングバッファーBを加え、直ちに4°Cで10分間インキュベートする。バッファーBを注意深く吸引し、1x PBSで細胞を1回慎重に洗浄する。1x PBSを慎重に吸引します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>固定<ol>
<li>化学フードの下に2mLの4%PFAを加えて細胞を固定する。 注:PFAは有毒であり、化学的フードの下で操作する必要があります。</li>
		<li>細胞を室温で20分間インキュベートする。カバースリップを1x PBSで2回洗い、余分なものを吸引します。</li>
		<li>カバースリップを100%冷メタノールで覆い、-20°Cで5分間インキュベートします。1x PBSで2回洗ってください。 メモ: プロトコルはここで一時停止できます。カバースリップは、1x PBSで4°Cで保存し、必要に応じてプレートをアルミホイルで包むことができます。細胞は、IFプロトコルを継続する前に5日以上保持してはならない。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 透過処理
<ol><li>細胞を、0.5% Triton X-100を含む2 mLの1x PBSと共に室温で15分間インキュベートする。カバースリップを2mLの1x PBSで3回洗ってください。</li>
</ol>4. 免疫染色
<ol><li>ブロック手順<ol>
<li>カバースリップあたり 2 mL を使用するのに十分な新鮮なブロッキングバッファー (1x PBS 中の 3% BSA) を準備します。 注: 抗体溶液を作るために、ブロッキングバッファーを 5mL 余分に用意してください。</li>
		<li>各ウェルに2mLのブロッキングバッファーを加え、室温で1時間インキュベートする。</li>
	</ol>
</li>
	<li>一次抗体インキュベーション<ol>
<li>一次抗体溶液を新鮮なブロッキングバッファーで調製する:BrdU RPN202 1:1000および増殖細胞核抗原(PCNA)1:500、カバースリップあたり100 μL。 注: 抗体を保存するために、22 x 22 mm カバースリップの場合は 75 ~ 100 μL、18 x 18 mm カバースリップの場合は 50 ~ 75 μL と、より小さな容量を使用できます。</li>
		<li>各カバースリップに、100μLの一次抗体溶液を加える。ピンセットを使用してカバースリップを正方形のパラフィルムで覆い、泡が出ないようにパラフィルムを慎重に配置します。</li>
		<li>プレートをアルミ箔で覆い、加湿チャンバー内で一次抗体を4°Cで一晩インキュベートした。</li>
		<li>パラフィルムの正方形を取り出し、カバースリップを2mLの滅菌1x PBSで3回洗浄する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>二次抗体インキュベーション<ol>
<li>新鮮なブロッキングバッファー中に十分な二次抗体溶液を調製する:抗マウス488蛍光二次A11011(BrdU用)希釈1:800および抗ウサギ568蛍光二次A11011(PCNA用)希釈1:800。 注:使用される色は、実験的なニーズに合わせて変更することができます。使用される特定のブランドは、 材料表に記載されています。</li>
		<li>各カバースリップに100μLの二次抗体溶液を加え、ピンセットを使用して正方形のパラフィルムでカバースリップを覆い、気泡なしでパラフィルムを慎重に配置する。</li>
		<li>二次抗体を、アルミニウム箔で覆われたプレートで室温で1時間インキュベートする。</li>
		<li>カバースリップを2mLの1x PBSで3回洗ってください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>核染色<ol>
<li>終濃度1 μg/mL(1:1000)で4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む1x PBSのカバースリップあたり2mLの容量を調製する。</li>
		<li>各カバースリップに2mLのDAPI溶液を加える。カバースリップを室温で10分間インキュベートし、プレートをアルミホイルで覆った。カバースリップを1x PBSで2回洗ってください。</li>
		<li>カバースリップを 1x PBS で覆い、針または細かいピンセットを使用してカバースリップをウェルの底から持ち上げます。余分な液体を拭き取って、片方の端をペーパータオルで軽く叩いて慎重に拭き取ります。 メモ: スライドを落とさないように、または付着セルのある平らな面が用紙に触れないように注意してください。</li>
		<li>10~20 μLのIF特異的マウント媒体を使用して、カバースリップをスライドに取り付けます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 画像の取得と解析
メモ:画像取得は、いくつかのタイプの蛍光顕微鏡で行うことができます。63倍の油対物レンズを備えた落射蛍光顕微鏡を使用した。ブランドとモデル の材料表 を参照してください。Zスタックは必須ではありませんが、細胞株およびミトコンドリア染色のレベルに応じて使用できます。
<ol><li>画像解析<ol>
<li>画像ごとに、複数の tiff ファイルを作成します。すべての平面をマージしますが、カラーチャンネルは別々に保ちます。これらのファイルをセルプロファイラ(The Broad Institute https://cellprofiler.org/home)にインポートし、スペックルカウントパイプライン(補足ビデオ1)を使用して分析します。</li>
		<li>画像をアップロードする(補足図S1A)。<ol>
<li>プロジェクトの作成を開始するには、スペックルカウントパイプラインをプログラムにロードし、提供された領域で分析する画像をロードします。</li>
			<li>NamesAndTypes モジュールを使用して、他のモジュールが参照する意味のある名前を各イメージに割り当てます-C01: BrdU チャンネルの表現;C02: PCNA チャネルを表す;C03: DAPI チャネルを表します。 注:これらの識別子は顕微鏡によって異なります。ファイル名には、チャネルを区別するための識別子が必要です。</li>
		</ol>
</li>
		<li>核を識別するために使用するファイルを特定し、それに名前を付けます (必要に応じてこの名前を変更します) (補足図 S1B および補足図 S1C を参照)。<ol>
<li>オブジェクトの直径を 50 ~ 300 ピクセル単位で選択します。これは、核の許容可能なサイズ範囲ですが、画像内の核に合わせて値を変更します。 注: 50 は値が大きすぎて、より小さい核が識別できない可能性があります。同様に、300は、核の大きなグループを1として数えることを可能にするかもしれない。</li>
			<li>直径範囲外のオブジェクトを破棄して、基準に一致するオブジェクトのみがカウントされるようにします。</li>
			<li>罫線に接触するオブジェクトを破棄して、フィールド内に部分的にしか存在しないセルを削除します。</li>
			<li>特定の画像に合わせてしきい値を適用します。例として、次の設定に注意してください。しきい値設定戦略の厳格さに基づいて、しきい値調整係数を変更します。その他の設定には、しきい値戦略が含まれます: グローバル;閾値化方法:大津;2つのクラスまたは3つのクラスのしきい値:2つのクラス。しきい値平滑化スケール: 1;しきい値平滑化係数: 1;しきい値の下限と上限: 0.0 および 1.0;凝集したオブジェクトを区別する方法:形状;凝集したオブジェクト間に分割線を引く方法:伝播。 注: 各パラメーターについて、セル・プロファイラーは、変数設定に補完的な定義と使用可能な可能性を提供します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>病巣を特定する一次対象を特定する(補足図S2A)。<ol>
<li>次の設定を使用します: 入力画像を選択します: マスクドグリーン;識別されるプライマリオブジェクトに名前を付けました: BrdUFoci;オブジェクトの典型的な直径:1-15;直径範囲外のオブジェクトを破棄します:はい。画像の境界線に触れるオブジェクトを破棄します:いいえ。しきい値戦略:適応性;閾値化方法:大津;2つのクラスまたは3つのクラスのしきい値:3つのクラス。しきい値平滑化スケール: 1;しきい値平滑化係数: 3;平滑化フィルターのサイズ:4。</li>
		</ol>
</li>
		<li>強度を測定する(補足図S2B)。<ol>
<li>測定する画像を選択します:オリッググリーン。</li>
			<li>[ 別の画像を追加]をクリックします。測定する画像(PCNA)を選択します。測定するオブジェクトを選択します: Nuclei。 注: これは、BrdU および PCNA 強度 (グラフ化される最終データ) を測定するために使用されます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者らは開示するものは何もありません。

本稿では、IF染色を用いてセルロのDNA切除の変動を測定する方法について説明する。DNA切除への影響を観察するための現在の標準は、RPA染色によるものです。しかし、これはDNA複製の影響を受ける可能性のある間接的な方法です。以前に、BrdU陽性およびBrdU陰性細胞において生じる強度を分類するための別のBrdU組み込みベースのDNA切除IF技術が記載されていた。この方法により、HRを受けていない細胞は、バックグラウンドまたはミトコンドリア染色のために陽性としてカウントされ、高いBrdU強度をもたらす14、15、16が可能になりました。この論文に記載されている方法の主な新規性は、細胞周期のS期およびG2期に対する選択性を可能にし、結果として生じるBrdUシグナルが切除によるものであり、したがって相同性指向性修復によるものであることを保証するPCNA染色の添加である。
このプロトコル...

DNA修復因子の調節は、特にDNA DSB修復不全腫瘍環境において、がん治療のための絶えず進化する方法である。特定の修復因子の阻害は、DNA損傷物質に対して癌細胞を感作するために使用される独創的な戦略の1つである。何十年にもわたる研究の結果、DNA修復遺伝子のさまざまな変異が、治療戦略の選択のためのバイオマーカーとして同定されました1。その結果、DNA修復分野は、幅広い治療を確実にするための医薬品開発のハブとなり、個別化医療の概念を強化しています。 
DSBは、NHEJとHR2の2つの主要な経路によって修復されます。NHEJ経路はエラーが発生しやすく、DNAエンドプロセシングをほとんどまたはまったく行わずに2つのDNA末端を迅速にライゲーションし、プロテインキナーゼ(DNA-PKcs)、Ku70/80複合体、53BP1、およびRIF1タンパク質3が関与します。対照的に、HRはBRCA14によって開始された忠実なメカニズムです。HR修復に不可欠なステップはDNA末端切除プロセスであり、これは3'-OH末端を有する一本鎖(ss)DNAにつながる切断末端の分解である。BRCA1は、5'~3'DNA切除に関与する切除体MRN/RPA/BLM/DNA2/EXO1を形成する下流タンパク質のリクルートを促進します5。
初期末端切除は、MRE11のエンドヌクレアーゼ活性を介して達成され、DNA2およびEXO1ヌクレアーゼによるさらなる処理を可能にする。生成されたssDNAオーバーハングは、レプリケーションプロテインA(RPA)によって迅速にコーティングされ、さらなる処理から保護されます。続いて、BRCA2、PALB2、およびBRCA1は、RPAの変位および相同性指向性修復機構に必要なRAD51ヌクレオフィラメントの組み立てを媒介するために関与する。NHEJとHRの使用の微妙なバランスは、ゲノム完全性の最適な維持のために必要である。経路の選択は、細胞周期の段階に依存する。HRは、DNA切除が最高レベルにあるS期からG2期にかけて優先的に使用され、姉妹染色分体が適切な修復を確実にするために利用可能である。
ポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ1(PARP-1)は、DSBにリクルートされた最も初期のタンパク質の1つである。これは、切除活性とNHEJ5,6に関与する下流エフェクターの組み立ての両方を調節する。PARP-1は、複製中のDNA一本鎖切断修復にも必要です7,8。DNA修復におけるその重要な役割のために、PARP阻害剤(PARPi)は癌治療として使用されている。いくつかのHR欠損がんにおいて、PARPi治療は、代替経路を介して蓄積された損傷を修復するHR欠損細胞の能力がないため、合成致死的応答をもたらす9,10。現在、FDAが承認したPARPiは、オラパリブ、ルカパリブ、ニリパリブ、タラゾパリブ(BMN 673とも呼ばれる)の4種類で、乳がんや卵巣がんのさまざまな治療に使用されています11。しかし、PARPi耐性は一般的であり、1つの潜在的な原因は、HR能力の再獲得によって生じる12。照射の存在下でのPARP−1の喪失または阻害は、切除体機構を調節不全にし、より長いssDNA経路の蓄積をもたらす13。したがって、インビボでのDNA切除の詳細な研究は、DNA修復経路のより明確な理解と、その後のがん治療およびPARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要である。
DNA切除イベントを検出するためにいくつかの方法が採用されています5。そのような方法の1つは、抗RPA抗体を使用してストレス誘発DSB後に切除されたDNAの間接染色および可視化を可能にする古典的なIFベースの技術である。ゲノムDNAを5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)で標識し、ssDNAのみを検出することは、DNA切除事象の直接測定です。これは、DNA複製などの複数の細胞プロセスに関与するRPAのモニタリングを回避します。本明細書に記載の方法では、単一細胞周期の間BrdUと共にインキュベートされた細胞は、BrdUが複製細胞DNAの1本の鎖に組み込まれることを可能にする。切除に続いて、IF染色は、抗BrdU抗体の使用により、ssDNA形態においてのみBrdU検出を可能にする条件下で行われる。この抗体は、露出したBrdUヌクレオチドにのみアクセスでき、二本鎖DNAに組み込まれたものは検出しません。蛍光顕微鏡を用いて、切除されたDNAを点状BrdU/ssDNA病巣の形で可視化することができる。これらの病巣の核強度は、DNA損傷後の切除を定量化するための読み出しとして使用することができる。この論文では、ほとんどの哺乳動物細胞株に適用できるこの方法のプロセスを段階的に説明します。この方法は、セル ロのDNA末端切除をモニタリングする簡単な方法として、概念実証として幅広い有用性を持つべきである。

<table><tbody><tr><td>Alexa 568ヤギ抗ウサギ</td><td>分子プローブ</td><td>A11011</td><td>1:800</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488ヤギ抗マウス</td><td>分子プローブ</td><td>A11001</td><td>1:800</td></tr>アンチ<tr><td>PARP1(F1-23)</td><td>自家製</td><td></td><td>1:2500</td></tr><tr><td>アンチPCNA(SY12-07)</td><td>Novus</td><td>NBP2-67390</td><td>1:500</td></tr>アンチ<tr><td>アルファチューブリン(DM1A)</td><td>Abcam</td><td>Ab7291</td><td>1:100000</td></tr><tr><td>anti-BrdU</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN202</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>ベンチトップX線照射器</td><td>Cell Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BMN673</td><td>MedChem Express</td><td>HY-16106</td><td></td></tr><tr><td>ブロモデオキシウリジン (BrdU)</td><td>Sigma</td><td>B5002</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Cell profiler</td><td>Broad Institute</td><td>V 3.19</td><td>https://cellprofiler.org/</td></tr> <tr><td>Curwood Parafilm M Laboratory Wrapping Film 4in / 250 ft</td><td>Fisher scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>Fisher scientific</td><td>10063542</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Fetalウシ血清</td><td>Gibco</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーブランド カバー メガネ: 正方形 22 x 22</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>12 541B</td><td></td></tr><tr><td>蛍光顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>DMI6000B</td><td>63倍液浸対物レンズ</td></tr><tr><td>HeLa</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 160I CO2 インキュベーター CU 1-21 TC 120V</td><td>VWR</td><td>51030408</td><td>37% CO2</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>BioShop Canada</td><td>MAG520.500</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002.10</td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS 1x</td><td>Wisent Bio Products</td><td>311-010-CS</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td><td>Cedarlane Labs</td><td>15710-S(EM)</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6757-100G</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold 退色防止封入剤</td><td>Invitrogen Life Technology</td><td>P-36930</td><td></td></tr><tr><td>RNAiMAX</td><td>Invitrogen</td><td>13778-075</td><td></td></tr><tr><td>siPARPi</td><td>Dharmacon</td><td></td><td>AAG AUA GAG CGU GAA GGC GAA dTdT</td></tr><tr><td>siRNA control</td><td>ダルマコン</td><td></td><td>UUCGAACGUGUCACGUCAA</td></tr><tr><td>デオキシコルケートナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6750-100G</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>バイオショップカナダ</td><td>SUC507.5</td><td></td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>バイオショップカナダ</td><td>TRS001.5</td><td></td></tr>トリ<tr><td>ションX-100</td><td>ミリポアシグマ</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン20</td><td>フィッシャー科学</td><td>BP337500</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

brdu-dna標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルdna二本鎖末端切除の評価

Assessment of Global DNA Double-Strand End Resection using BrdU-DNA Labeling coupled with Cell Cycle Discrimination Imaging

DNA損傷応答(DDR)の研究は複雑で不可欠な分野であり、がん治療にDDR標的薬を使用することで重要性が増しています。これらの標的はポリ(ADP-リボース)ポリメラーゼ(PRP)であり、様々な形態のDNA修復を開始する。PARP阻害剤(PARPi)を用いてこれらの酵素を阻害することは、乳癌1型(BRCA1)、BRCA2、またはBRCA2のパートナーおよび局在化器(PALB2)の変異による相同組換え(HR)欠損細胞に治療上の脆弱性を与えることによって合成致死性を達成する。 
PARPiで処理された細胞は、DNA二本鎖切断(DSB)を蓄積する。これらの切断はDNA末端切除機構によって処理され、一本鎖(ss)DNAの形成およびその後のDNA修復につながる。BRCA1欠損の状況では、53BP1やDYNLL1などのDNA切除阻害剤の変異を介してDNA切除を再活性化すると、PARPi耐性が引き起こされます。したがって、 セルロ のDNA切除をモニターできることは、DNA修復経路のより明確な理解と、PARPi耐性を克服するための新しい戦略の開発にとって重要です。免疫蛍光(IF)ベースの技術により、DNA損傷後のグローバルDNA切除のモニタリングが可能になります。この戦略には、5-ブロモ-2'-デオキシウリジン(BrdU)によるロングパルスゲノムDNA標識が必要です。DNA損傷およびDNA末端切除に続いて、得られた一本鎖DNAは、天然条件下で抗BrdU抗体によって特異的に検出される。さらに、DNA切除は、細胞周期の様々な段階を区別するために細胞周期マーカーを用いて研究することもできる。S/G2期の細胞はHR内の末端切除の研究を可能にするが、G1細胞は非相同末端結合(NHEJ)の研究に使用することができる。細胞周期弁別に結合されたこのIF法の詳細なプロトコルは、この論文に記載されている。

このプロトコールでは、ブロモデオキシウリジン(BrdU)ベースのアッセイを使用して、放射線誘発損傷に対するHeLa細胞の切除応答を定量的に測定した。生成されたssDNAトラックは、免疫蛍光染色後に別個の病巣として可視化される(図1A)。次いで、同定された病巣を定量化し、核におけるBrdU染色の総積分強度として表した(図1B、補足図S1、補足図S2、および補足図S3)。病巣数または平均病巣強度を測定することは可能ですが、これは総核強度よりも信頼性が低く、主にBrdU病巣の可変サイズに大きく依存します。
NHEJの結果としての短距離切除とHRの長期切除とを区別するために、抗PCNA抗体を用いて共染色を行い、S期を経る細胞を同定した(図1 および 補足図S4)。PCNAは、DNAポリメラーゼのプロセス性因子とし...

本プロトコールでは、細胞周期のS/G2期におけるDNA二本鎖末端切除を免疫蛍光ベースの方法を用いて可視化する方法を実証する。

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

The study of the DNA damage response (DDR) is a complex and essential field, which has only become more important due to the use of DDR-targeting drugs ...

このプロトコルは、DNAのセルロ定量およびDNA損傷後の切除を可能にする。この技術の主な利点は、細胞をS期およびG2期に制限し、DNAおよび切除から生じるブロモデオキシウリジンシグナルを確実にする細胞周期マーキングである。この手順を実証するのは、主任研究者のJean-Yves Massonとポスドク研究者のSofiane Y.Mersaouiです。滅菌培養フードの下で作業し、必要な数の条件のために、6ウェルプレートの各ウェルに単一のカバースリップを置きます。トランスフェクションまたは薬物処理のために約150,000個のHeLa細胞をプレートする。3日目に、終濃度10マイクロモルのBrdUとの一晩インキュベーションに続いて、5グレイのX線照射の総用量でプレートを照射する。照射後、プレートを37°Cで5%の二酸化炭素加湿インキュベーターに3時間戻してインキュベートする。予備抽出のために、培地を吸引し、PBSで細胞を2回注意深く洗浄する。PBSを除去した後、2ミリリットルの抽出前バッファーAを加え、細胞を氷上で摂氏4度で10分間インキュベートする。10分後、吸引バッファーA、細胞骨格剥離バッファーBを2ミリリットル加え、インキュベーションを繰り返した。その後、バッファーBを注意深く吸引し、PBSで細胞を洗浄する。PBSを吸引した後、化学フードの下に2ミリリットルの4%のパラホルムアルデヒドを加えて細胞を固定する。パラホルムアルデヒドを除去してPBSで洗浄した後、カバースリップを100%冷たいメタノールで覆い、マイナス20°Cで5分間インキュベートし、カバースリップをPBSで2回洗浄します。透過処理のために、細胞を0.5%Tritan X-100を含む2ミリリットルのPBSと共に室温でインキュベートする。15分後、カバースリップを2ミリリットルのPBSで3回洗う。免疫染色のために、各ウェルに2ミリリットルのブロッキングバッファーを加える。1時間のインキュベーション後、100マイクロリットルの一次抗体溶液を各カバースリップに加える。ピンセットを使用してカバースリップを正方形のパラフィルムで覆い、泡を作らないようにパラフィルムを慎重に配置します。次いで、プレートをアルミニウム箔で覆い、加湿チャンバー内で一次抗体を摂氏4度で一晩インキュベートする。翌日、パラフィルムの正方形を取り除き、カバースリップを2ミリリットルのPBSで3回洗う。洗浄後、各カバースリップに100マイクロリットルの二次抗体溶液を加え、実証されているように正方形のパラフィルムでカバースリップを覆う。二次抗体を室温で1時間インキュベートし、ホイルを使用してプレートを光から保護します。その後、カバースリップを2ミリリットルの1X PBSで3回洗ってください。核染色の場合は、各カバースリップに2ミリリットルのDAPI溶液を加え、カバースリップをPBSで洗浄します。顕微鏡スライドに10~20マイクロリットルのIF特異的マウント媒体を加えます。針または細かいピンセットを使用して、カバースリップを井戸の底から持ち上げます。ペーパータオルの片方の端を軽く叩いて余分な液体を慎重に拭き取り、カバースリップを顕微鏡スライドに取り付けます。画像の取得と分析を行うには、これらのファイルを CellProfiler にインポートし、スペックルカウントパイプラインを使用して分析します。テキスト原稿に記載されている設定を使用して病巣を識別するための主要なオブジェクトを特定し、強度を測定します。照射後の5-ブロモ-2-プライムデオキシウリジン病巣形成および増殖細胞核抗原染色の代表的な像をここに示す。生成された一本鎖DNAトラックを、別個の病巣として可視化した。次いで、同定された病巣を定量化し、核におけるブロモデオキシウリジン染色の総積分強度として表した。共染色は、S期を経る細胞を同定するために抗PCNA抗体を用いた非相同末端結合による短距離切除と相同組換えの長距離切除との間の分化を示した。PCNAは核内で顕著であり、細胞周期のS期に極めて強い染色で最大発現に達する。次に、値の結果を散布図としてプロットし、PCNA 陽性核と PCNA 負核を判別します。PCNA 陰性の結果はデータセットから削除され、条件に関係なく BrdU 信号が低いため、BrdU 強度ベースの解析が可能になります。PCNA負性核は、900単位のBrdU病巣の基礎積分強度を保有し、この値はPCNA正核において1,800AUに達する。siRNA対照条件において、核当たりのBrdU病巣の集積強度は、PCNA陽性核において約1,500AUである。siRNAを用いたPARP−1の効率的なノックダウンの後、BrdU病巣の強度の約1,900AUへの有意な増加が観察された。この技術は、相同組換えの第1段階に関する重要な洞察を提供し、したがって、タンパク質が修復経路の第1段階に関与しているかどうかを同定するのに役立つ。抽出前バッファーのインキュベーション時間は厳密に保持する必要があります。これらのバッファーへの過剰暴露は、過剰な細胞剥離およびバックグラウンドシグナルの増加をもたらす。

assessment-global-dna-double-strand-end-resection-using-brdu-dna

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

この記事では、GFPベースの蛍光を示して...

哺乳動物細胞におけるDNA二重鎖切断（DSB）修復の解析

細胞集団の細胞周期の位置を決定する、または信号が増殖にどのような影響を与えるか理解する、容易にこのプロトコルを使用してフローサイトメトリーによって測定することができる。我々は、細胞を染色し、細胞周期内の位置を定量化するための簡単​​な実験的なアプローチを報告する。...

哺乳動物細胞における細胞周期の位置の解析

細胞周期ステージの進行と動態の追跡微妙な変化は、BrdUとヨウ化プロピジウムを経由して全ゲノムDNAを染色した核酸の代謝標識の組み合わせの使用によって達成することができます。このメソッドは、それによって順番に細胞周期の進行に影響を及ぼす非特異的DNA損傷の導入を防止し、サイクリング細胞の化学物質の同期の必要がなくなります。...

代謝標識とフローサイトメトリーで細胞周期の進行速度を測定

妊娠マウスにおけるチミジンのEdUおよびBrdUの二類似体の投与は、胚性マウス脳の神経細胞および前駆細胞における細胞周期進行の分析を可能にする。この方法は、脳の発達の間に、電離放射線を含む遺伝毒性ストレスの効果を決定するために有用である。...

神経幹細胞の細胞周期の進行を評価し、マウスでの前駆細胞は、遺伝毒性ストレス後の脳の開発

蛍光顕微鏡を用いた過渡的長期的な二本鎖 DNA 切断の DNA 修復プロセスの特性

提示された方法は、DNA二本鎖切断(DSB)、細胞周期分布およびアポトーシスの定量分析を組み合わせて、DSB誘導および修復の細胞周期特異的評価と修復失敗の結果を可能にする。...

フローサイトメトリーによる無毒ストレス後のγH2AXとアポトーシスの細胞周期特異的測定

5-エチニル-2'-デオキシウリジン(EdU)およびホスホヒストンH3(pH3)標識による細胞周期解析は、広範な最適化を必要とし得る多段階の手順である。ここでは、異なる細胞周期段階で細胞を区別するための画像解析および定量化を含む、この手順のすべてのステップを説明する詳細なプロトコルを提示する。...

5-エチニル-2'-デオキシウリジン/ホスホヒストンH3細胞周期進行解析用二重標識プロトコル

ここでは、単一細胞における複数の老化関連マーカーの可視化および定量化のためのフローサイトメトリーベースの方法を提示する。...

治療誘発性老化癌細胞における複数の蛍光老化マーカーの同時イメージングおよびフローサイトメトリーベースの検出

次のプロトコルはRPA2 immunofluorescent stainingに先行している細胞周期の同期を利用して細胞周期のG1段階のsingle-stranded...

細胞周期のG1期における一本鎖DNA病巣の可視化

私たちは、一連の発光ベースの染色体外レポーター基質を使用して、細胞内の二本鎖切断修復経路の習熟度を評価するためのプロトコルを提示します。...

ハイスループットで定量的な発光ベースのレポーターアッセイを用いたDNA二本鎖切断修復活性の評価

学ぶ BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたDNA二本鎖末端切除の定量法。HeLa細胞を用いた免疫蛍光プロトコルで、相同組換えと非同源性末端結合を区別し、PARP阻害剤耐性メカニズムの研究に有用です。

BrdU-DNA標識と細胞周期判別イメージングを用いたグローバルDNA二本鎖末端切除の評価

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