Name: インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-11T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: 学ぶマウス胚性幹細胞を用いた三次元血管新生発芽アッセイ。コラーゲンゲル内でEBを培養し、DC101やDAPTによる薬物検査や遺伝子スクリーニングを行い、血管形成メカニズムと創薬研究に応用する。

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この研究は、オランダの組織団体(ZonMW 446002501)、Health Holland(LSHM19057-H040)、Leading Fellows Program Marie Skłodowska-Curie COFUND、およびMaladie de Rendu-Osler協会(AMRO)からの助成金によって支援されました。

1. mESCの培地調製と培養
<ol><li>サプリメント1xグラスゴーMEM(G-MEM BHK-21)培地を使用して、10%(vol/vol)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、0.05 mM β-メルカプトエタノール、1x非必須アミノ酸(NEAA 1x)、2 mM L-グルタミン、および1 mMピルビン酸ナトリウムを含むサプリメント1xグラスゴーMEM(G-MEM BHK-21)培地を使用して、コンディショニング培地+/-(CM+/-)を準備します。</li>
	<li>白血病抑制因子(LIF)(1,500 U/mL)および0.1 mM β-メルカプトエタノールを含むサプリメントCM+/-培地を使用して、コンディショニング培地+/+(CM+/+)を調製します。</li>
	<li>1 μM PD0325901および3 μM CHIR99021を含むサプリメントCM+/+培地を使用して、2つの阻害剤(CM+/+ 2i)の存在下でコンディショニング培地+/+を調製します。</li>
	<li>カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)500 mLに25 mLの予熱した2%ゼラチン溶液を混合することにより、0.1%ゼラチン溶液を調製します。</li>
	<li>トリプシン(2.5%)とTVP 1x(9.5% 10x DPBS、1 mM EDTA、0.01%ニワトリ血清、0.01% トリプシン(2.5%)をH2O溶液中で混合することにより、10xリン酸トリプシンバーセン(TVP 10x)バッファーを調製します(1:10比、体積/体積)。 注:0.22μmのポアフィルターですべての溶液をろ過します。培養液を-20°Cで長期間保存し、他の試薬を4°Cで最大3週間保持します(材料表を参照)。</li>
	<li>2枚の12ウェル細胞培養プレートを0.1%ゼラチン溶液(ウェルあたり500 μL)でコーティングし、CO2インキュベーター(37°C、5%CO2、湿潤雰囲気)で30分間インキュベートします。</li>
	<li>ゼラチンコーティングされたプレートをPBSで洗浄し、500 μLのCM+/-培地を加えます。</li>
	<li>1 x 106 凍結保存された照射マウス胚性線維芽細胞(MEF)の2つのバイアルを37°Cで解凍し、細胞懸濁液を5 mLのCM+/-培地を含むコニカルチューブに移します。</li>
	<li>細胞を200 x g で室温(RT)で5分間遠心分離します。培地を吸引し、細胞ペレットを12 mLのCM+/-培地に1.67 x 105 細胞/mLの濃度で静かに再懸濁します。</li>
	<li>500 μLのMEF懸濁液を12ウェル細胞培養プレート(2.4 x 105 細胞/cm2)に播種し、CO2 インキュベーター内でプレートを一晩(o/n)インキュベートします。</li>
	<li>凍結保存されたmESC(1 x 106)のバイアル1本をCM+/+ 2i培地で解凍します。</li>
	<li>1 mLのCM+/+ 2i培地中のMEFを含む事前に洗浄した12ウェルプレートにmESC懸濁液を播種し、プレートをCO2 インキュベーターに移します。メディアを毎日更新します。</li>
	<li>70%コンフルエントで、mESCコロニーをDPBSで洗浄します。150 μLの温かい10x TVPバッファーを加え、RTで30秒間インキュベートして酵素解離を開始します。</li>
	<li>TVPバッファーを注意深く除去し、細胞を1 mLのCM+/+ 2i培地に再懸濁し、穏やかなピペッティングによってコロニーを単一細胞に解離させます。</li>
	<li>細胞をMEFを含む新しい12ウェル細胞培養プレートに移して継代します(分割比:1:3-1:5)。穏やかに混合して細胞を分配し、CO2 インキュベーター内でインキュベートする。</li>
	<li>培地(2〜3 mL)をリフレッシュし、細胞の成長/形態を毎日観察します。2日ごとに70%のコンフルエンシーでシリアル継代を繰り返します。細胞分化を開始する前に、CM+/+培地に2回継代します。</li>
</ol>2. ハンギングドロップでのEB形成
<ol><li>CM+/-培地に塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)(50 ng·mL-1)および骨形成タンパク質4(BMP-4)(5 ng・mL-1)を添加して、新鮮な中胚葉分化培地を調製し、使用するまで4°Cに保ってください。</li>
	<li>6ウェル細胞培養プレートの1ウェルを500 μLの0.1%ゼラチン溶液でコーティングし、CO2 インキュベーターに30分間入れます。</li>
	<li>ゼラチンコーティングされたプレートをPBSで洗浄し、500 μLのCM+/-培地を加えます。</li>
	<li>純粋なmESC集団を得るには、細胞培養プレートを10x TVPバッファーでRTで30秒間トリプシン処理し、細胞を1 mLの中胚葉分化培地に再懸濁した後、ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートに30分間移し、mESCが懸濁したままMEFを付着させます。</li>
	<li>50 mLのコニカルチューブに細胞懸濁液を採取し、ノイバウアー血球計算盤とトリパンブルー染料を使用して細胞をカウントし、生細胞/死細胞を排除します。</li>
	<li>細胞を200 x g でRTで5分間遠心分離します。 上清を取り除き、細胞ペレットを中胚葉分化培地に再懸濁して、4.55 x 104 細胞/mLに到達させます。</li>
	<li>94 mmの低アタッチメントポリスチレン皿の底に15 mLの滅菌水を入れます。 注:3D発芽血管新生アッセイを使用して1つの特定の状態をテストするには、ハンギングドロップ(3.52 mLの培地に1.6 x 105 細胞)を含む4つの皿が必要になります。</li>
	<li>細胞懸濁液を滅菌プラスチックリザーバーに移し、マルチチャンネルピペットの4つの位置にチャンネルあたり22 μLの細胞懸濁液をロードします(22 μLドロップあたり1 x 103 セル)。</li>
	<li>94 mmディッシュの蓋を持ち上げて反転させ、内側を上に向けてフローキャビネットのきれいな面に置きます。</li>
	<li>各蓋の内面に40滴の細胞懸濁液を堆積させる。蓋を邪魔せずに慎重にひっくり返し、皿に戻して、滴が水に面するようにします。</li>
	<li>CO2 インキュベーターで皿をインキュベートします。これを分化 0 日目と考えてください。プレートを4日間維持してEBを形成します。</li>
</ol>3. 先端細胞位置の競合アッセイ
<ol><li>前述のように1つの蛍光および1つの非蛍光mESC株を培養する13。例として、黄色でラベル付けされた7ACS/EYFP mESCおよびR1 mESCが使用されます。</li>
	<li>等量の2つのmESCライン(1:1の比率)を混合してモザイクEBを調製し、ステップ2で説明したようにCO2 インキュベーター内でハンギングドロップディッシュをインキュベートします。</li>
</ol>4. 血管分化のための浮遊EB培養
<ol><li>ぶら下がっているドロップからEBを収集する前に、以下を準備します。<ol><li>H2O中の5%寒天溶液を調製し、オートクレーブ滅菌(120°Cで20分)して滅菌する。</li>
		<li>温かい5%寒天溶液を使用して、1%寒天を含むG-MEM BHK-21培地を調製し、60 mmポリスチレン皿の1つに3 mLをすばやく注ぎます。寒天をRTで1時間固化させ、使用するまで皿を4°Cで保管します。</li>
	</ol></li>
	<li>CM+/-培地にbFGF(100 ng·mL-1)およびVEGF-A(50 ng·mL-1)を添加して、新鮮な2x血管分化培地を調製します。使用するまで培地を4°Cで保存してください。</li>
	<li>P1000ピペットを使用して15 mLコニカルチューブに吊り下げられた滴を集め、数分のEB沈降後に上清を除去します。</li>
	<li>EBを3 mLの2x血管分化培地に再懸濁し、EB懸濁液を1つの寒天コーティングされた皿に移し、凝集を避けるためにEBを均一に分配します。</li>
	<li>CO 2インキュベーターで皿をインキュベートし、bFGF(50 ng・mL-1)およびVEGF-A(25 ng・mL-1)の存在下で1x血管分化培地を使用して、9日目まで2日ごとに培地をリフレッシュします。</li>
	<li>あるいは、血小板由来成長因子-BB(PDGF-BB)(4日目に10 ng・mL-1、6日目と8日目に5 ng・mL-1)を血管分化培地に追加して、壁細胞の分化を促進します。</li>
</ol>5. フローサイトメトリー解析
<ol><li>P1000ピペットを使用して15 mLのコニカルチューブに生後9日目のEBを収集し、温かいPBSで1回洗浄します。</li>
	<li>0.2 mg·mL-1のコラゲナーゼAを含むG-MEM BHK-21培地を1mL加え、細胞をCO2 インキュベーター内で5分間インキュベートします。</li>
	<li>P1000ピペットでゆっくりと上下にピペッティングしてEBを解離します。</li>
	<li>10%FBSを含む1mLの冷たいG-MEM BHK-21培地を加えて、コラゲナーゼ活性を停止します。</li>
	<li>細胞を200 x g でRTで5分間遠心分離します。</li>
	<li>細胞を2%FBSを含む500 μLのPBSに再懸濁します。</li>
	<li>ノイバウアー血球計算盤を使用して細胞をカウントします。</li>
	<li>染色条件ごとに2%FBSで100 μLのPBSで400,000細胞を再懸濁します。</li>
	<li>APC標識ラット抗マウスPECAM-1抗体(クローンMEC13.3)およびFITC標識ラット抗マウスCD45(クローン30-F11)またはアイソタイプコントロール抗体を用いて細胞を4°Cで45分間インキュベートします。</li>
	<li>2%FBSを含む1 mLのPBSで細胞を2回洗浄します。</li>
	<li>細胞を再懸濁して、mLあたり5 x 106 細胞の最終濃度に達します。</li>
	<li>セルストレーナースナップキャップ付きの丸底ポリスチレン試験管を使用して細胞をろ過します。</li>
	<li>フローサイトメトリーで20,000件のPECAM-1(+)イベントを解析します。</li>
</ol>6.3D発芽血管新生アッセイおよび免疫蛍光染色
<ol><li>9日目に、10%FBS(容量/容量)、bFGF(50 ng·mL-1)、VEGF-A(25 ng·mL-1)、ヒト組換えエリスロポエチン(hEPO)(20 ng·mL-1)、ヒトインターロイキン-6(IL-6)(10 ng·mL-1)、0.05 mM β-メルカプトエタノール、NEAA(1x)、L-グルタミン(1x)、ピルビン酸ナトリウム(1x)、I型ラットテールコラーゲン(1.25 mg·mL-1)、 NaOH(3.1 mM)をGMEM BHK-1培地に置き換えます。</li>
	<li>コラーゲンのゲル化を避けるために、使用するまで発芽培地を氷の上に置いてください。</li>
	<li>血管新生促進分子/抗血管新生分子の効果を評価するには、選択した薬物またはビヒクルを選択した濃度で発芽培地に追加します。</li>
	<li>15 mLのコニカルチューブ(1つの条件に相当)の60 mm寒天ディッシュ1枚から9日齢のEBを収集し、数分の沈降後に上清を除去します。</li>
	<li>35 mmの培養皿の底に1 mLの発芽培地を覆い、37°Cで5分間インキュベートしてゲル化を誘導します。</li>
	<li>EBを2 mLの冷発芽培地に再懸濁します。</li>
	<li>懸濁液を発芽培地の第1層でコーティングした35 mm培養皿に移します。</li>
	<li>EBをプレート全体に分散させ、互いに等しい距離にあることを確認します。CO2 インキュベーターで皿をインキュベートします。最初の芽形成は24〜48時間以内に起こります。</li>
	<li>12日目に、EBを含むコラーゲンゲルをスパチュラを使用してスライドガラス(75 x 26 mm)に注意深く移します。</li>
	<li>ピペット(P1000)を使用して余分な液体を取り除き、ナイロンリネンのガーゼシートと吸収性フィルターカード(ゲルブロッティング紙)をゲルの上に置いてゲルを脱水します。重り(250 g)を2分間置き、圧力をかけます。ナイロン/ろ紙を慎重に取り外し、スライドをRTで30分間風乾させます。</li>
	<li>スライドをPBSでRTで5分間3回洗浄します。</li>
	<li>亜鉛溶液( 材料表を参照)を使用してEBを4°Cで固定します。 あるいは、モザイク蛍光EBをパラホルムアルデヒド(PFA)(4%)o/nで4°C暗所で固定します。</li>
	<li>固定液を取り外します。スライドをPBSで5回RTで5分間洗浄します。</li>
	<li>0.1%トリトン-X100を含むPBS中でEBをRTで15分間透過処理します。</li>
	<li>透過処理液を取り除きます。スライドをPBSで5分間5回洗浄します。</li>
	<li>ブロッキングバッファー(PBSと2%ウシ血清アルブミン、BSA)でRTで1時間インキュベートします。</li>
	<li>内皮スプラウトを染色するには、ラット抗マウス抗PECAM-1一次抗体(1:100希釈)をブロッキングバッファーo/nで4°Cで使用します。</li>
	<li>スライドをPBSで5分間5回洗浄します。</li>
	<li>ブロッキングバッファー(1:250希釈)中のヤギ抗ラットAlexa 555二次抗体でスライドをインキュベートし、必要に応じてブロッキングバッファー(1:250希釈)中のFITC結合抗α-SMA抗体を使用して、暗所でRTで2時間壁画細胞を染色します。</li>
	<li>スライドを取り付ける前に、スライドをPBSで5分間3回、H20で1回洗浄します。</li>
</ol>7. EB内皮芽の共焦点イメージング、形態測定、定量解析
<ol><li>共焦点顕微鏡を用いた焦点面マージ(zスタッキング)により、免疫染色されたEBの高解像度画像を取得します。10倍の倍率対物レンズを使用して、EB全体を画像化します。</li>
	<li>ImageJを用いて取得した画像を解析し、確立された定量法に従ってPECAM-1陽性内皮スプラウトの特徴を定量化するために形態を評価した13、14、21。<ol><li>個々のEBあたりの総芽数を手動でカウントすることにより、EBあたりの内皮スプラウトの平均数を計算します。</li>
		<li>ImageJ描画ツールを使用して、個々の芽の長さを測定します。EBコア領域から始まる内皮スプラウトの基部を定義し、スプラウト先端が終了するまで手動で線を引きます。</li>
		<li>個々の芽あたりの先端細胞の数を手動で数えて、芽あたりの先端細胞の平均数を計算し、EBあたりの平均を計算します。</li>
		<li>親芽の軸を手動で決定して糸足の向きを計算し、ImageJソフトウェア角度ツールを使用してそれらの間の鋭角を測定します。向きが>50°の芽の数を計算し、それを関心のあるEBの芽の総数で割ります。 注意: 角度は常に0°から90°の範囲でした。</li>
	</ol></li>
	<li>共焦点顕微鏡を使用して免疫染色されたEBの高解像度画像を取得します。40倍の倍率対物レンズを使用して、単一の内皮芽の高解像度画像を実現します。</li>
	<li>ImageJソフトウェアを使用して、α-SMA陽性MCに囲まれたPECAM-1陽性ECスプラウトの血管被覆率を定量化します。<ol><li>マージされた画像を別々の赤と緑のチャンネルに分割します。</li>
		<li>画像をバイナリ形式に変換します。</li>
		<li>PECAM-1(赤色で標識された内皮細胞)およびα-SMA(緑色で標識された壁画細胞)陽性細胞によって別々に占められたスプラウトの総細胞面積を測定する。</li>
		<li>画像計算機関数とAND演算子を使用して、マージされた画像を生成します。画像の総セルラー面積を測定します。カバレッジを計算するには、共局在画像の面積を PECAM-1 バイナリ画像の面積で割ります。</li>
	</ol></li>
	<li>モザイクEBによって開発されたスプラウトの内皮先端/茎細胞位置の細胞競合を分析するには、先端細胞の数を手作業でスコアリングし、蛍光シグナルに基づいて遺伝子型起源をマークします。EB あたりの平均値を計算します。</li>
</ol>

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</ol>

著者は開示するものは何もありません。

このプロトコルは、血管新生を調節する薬物および遺伝子のスクリーニングに適した、偏りのない、堅牢で再現性のある3D EBベースの血管発芽アッセイについて説明しています。この方法は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)などの内皮細胞培養を使用して、遊走(ラテラルスクラッチアッセイまたはボイデンチャンバーアッセイ)22,23または増殖(細胞数のカウント、DNA合成の検出、増殖マーカーの検出、または代謝アッセイ)24を監視するために、広く使用されている多くの2次元(2D)アッセイよりも優れています。内皮細胞と壁細胞の両方の分化と、発芽血管新生の重要なステップを模倣する血管網へのそれらの組織の研究を独自に可能にするという点で。これらのステップには、内皮先端細胞の選択、茎細胞の増殖、血管スプラウトの空間的配向および遊走、ならびに新生血管25への壁細胞の動員が含まれる。また、多くの3D血管新生モデルにも利点があります。尿細管形成を模倣したフィ...

過去30年間、ターゲットベースの創薬(TDD)は、製薬業界による創薬に広く採用されてきました。TDDは、疾患において重要な役割を果たす定義された分子標的を組み込んでおり、比較的単純な細胞培養システムの開発と薬物スクリーニングのための読み出しに依存しています1。TDDプログラムで使用される最も典型的な疾患モデルには、人工環境および非生理学的基質内で増殖した癌細胞または不死化細胞株などの従来の細胞培養方法が含まれる。これらのモデルの多くは、成功した薬剤候補を特定するための実行可能なツールを提供していますが、そのようなシステムの使用は、疾患との関連性が低いため、疑わしい場合があります2。
ほとんどの疾患では、根底にあるメカニズムは確かに複雑であり、さまざまな細胞型、独立したシグナル伝達経路、および複数の遺伝子セットが特定の疾患表現型に寄与することがしばしば見られます。これは、主な原因が1つの遺伝子の突然変異である遺伝性疾患にも当てはまります。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)技術と遺伝子編集ツールの最近の登場により、in vivoのヒトの複雑さをよりよく再現できる3Dオルガノイドと臓器チップ疾患モデルを生成できるようになりました3,4。このような技術の開発は、表現型創薬(PDD)プログラムへの関心の復活に関連しています1。PDDは、特定の薬物標的の同一性に関する知識や疾患におけるその役割に関する仮説に依存しないため、経験的スクリーニングと比較することができます。PDDアプローチは、ファーストインクラスの医薬品の発見に大きく貢献することがますます認識されています5。ヒトオルガノイドおよび臓器オンチップ技術の開発はまだ初期段階にあるため、iPS細胞モデル(革新的なイメージングおよび機械学習ツール6,7で補完)は、近い将来、TDDアプローチの生産性の低さを克服するための薬物スクリーニングおよび関連するPDDプログラムのための複数の新しい複雑な細胞ベースの疾患モデルを提供することが期待されています8。9.
ヒトオルガノイドおよび臓器オンチップモデルは、疾患の複雑さと新薬の同定に関する重要な洞察を提供することができますが、薬物を新しい臨床診療に持ち込むには、動物モデルからのデータにも大きく依存して、その有効性と安全性を評価します。その中で、遺伝子改変マウスは確かに最も好ましい哺乳類モデルである。哺乳類の世代時間が比較的短く、人間の病気と多くの表現型が類似しており、簡単に遺伝子操作できるため、多くの利点があります。したがって、それらは創薬プログラムで広く使用されています10。しかし、マウスとヒトの間のギャップを埋めることは、依然として重要な課題です11。ヒトオルガノイドおよび臓器オンチップモデルと同等のin vitroマウスモデルの開発は、in vivoマウスとin vitroヒトデータ間の直接的な薬効および安全性比較を可能にするため、このギャップを少なくとも部分的に埋めることができます。 
ここでは、マウス胚様体(EB)における血管発芽アッセイについて説明する。血管は、内皮細胞(血管壁の内層)、壁細胞(血管平滑筋細胞および周皮細胞)で構成されています12。このプロトコルは、de novo内皮細胞および壁細胞の分化を再現するハンギング液滴を使用して、マウス胚性幹細胞(mESC)を血管化EBに分化することに基づいています13,14。マウスESCは、異なる遺伝的背景を有する単離された3.5日目のマウス胚盤胞からの培養において容易に確立することができる15。それらはまた、クローン分析、系統追跡の可能性を提供し、疾患モデルを生成するために容易に遺伝子操作することができる13,16。
血管はすべての臓器に栄養を与えるので、すべてではないにしても多くの病気が微小血管系の変化に関連していることは驚くべきことではありません。病理学的状態では、内皮細胞は活性化状態をとるか、機能不全になり、壁細胞の死または血管からの遊走を引き起こす可能性があります。これらは、過剰な血管新生または血管希薄化をもたらす可能性があり、免疫細胞血管外漏出、および炎症につながる異常な血流および血管バリアの欠陥を誘発し得る12、17、18、19。したがって、血管を調節する薬物の開発のための研究は高度であり、治療標的のための複数の分子プレーヤーおよび概念がすでに同定されている。これに関連して、記載されたプロトコルは、内皮先端および茎細胞の選択、内皮細胞の遊走および増殖、内皮細胞の誘導、チューブ形成、および壁細胞動員を含むin vivo発芽血管新生の重要な特徴を要約するため、疾患モデルの構築および薬物試験に特に適している。また、ヒトiPS細胞技術に基づく最近記載された3D血管アッセイとの類似性も示しています20。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>ミリポア、メルク</td><td>805740</td><td>バイオハザード:適切な安全指示は、</td></tr><tr><td>寒天 Noble</td><td>Difco、BD Pharmigen</td><td>214220</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluo 555 ヤギ抗ラット IgG</td><td>ライフテクノロジー</td><td>A21434</td><td></td></tr><tr><td>APC 結合ラット抗マウス PECAM-1 抗体 (クローン MEC13.3)</td><td>BD Biosciences</td><td>551262</td><td></td></tr><tr><td>APCラットIgG2a&カッパ;アイソタイプ制御(クローン&nbsp;R35-95)</td><td>BD Biosciences</td><td>553932</td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 25 倒立位相差組織培養顕微鏡</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>卓上遠心分離機 Allegra X-15R</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>バイオセーフティキャビネット BioVanguard (グリーンライン)</td><td>Telstar</td><td>133H401001</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン(BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>細胞計数室、バーカー、0.100mm</td><td>マリエンフェルト</td><td>640211</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿 60 x 15mm</td><td>コーニング</td><td>353802</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養皿、35 x 10 mm</td><td>コーニング</td><td>353801</td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート 12ウェル</td><td>コーニング</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch リアルタイム PCR 解析システム</td><td>Biorad</td><td>1855196</td><td></td></tr><tr><td>チキン血清</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5405</td><td></td></tr><tr><td>CHIR-99021 (CT99021) HCl</td><td>Selleckchem</td><td>S2924</td><td></td></tr><tr><td>コラーゲン I、高濃度、ラットテール、100mg</td><td>Corning</td><td>354249</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase A</td><td>Roche</td><td>10103586001</td><td></td></tr><tr><td>Conphoral Laser Scanning顕微鏡、TCS SP5</td><td>ライカ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス、24 &times; 50 mm</td><td>Vwr</td><td>631-0146</td><td></td></tr><tr><td>DAPT &gamma;?セクレターゼ阻害剤</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5942</td><td></td></tr><tr><td>DC101 抗マウス VEGFR-2 クローン</td><td>BioXcell</td><td>BP0060</td><td></td></tr><tr><td>DC101 アイソタイプラット IgG1</td><td>BioXcell</td><td>BP0290</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D2438-5X</td> バイオハザード: DPBS (10x) <td>を取り扱う際には、適切な安全指示を受ける必要があります</td></tr>。カルシウム<tr><td>、マグネシウム</td><td>Gibco は使用しないでください。サーモフィッシャー科学</td><td>14200067</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 40 mM</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>胚性幹細胞 ウシ胎児血清</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>16141-079</td><td>ES 細胞の生存率と増殖を最大限に高めるために、ロット試験を行う必要があります。60°Cで熱が不活性化します。C と &minus で格納します。20度;C 最長1年間</td></tr><tr><td>Eppendorf Microcentrifuge 5415R</td><td>Eppendorf AG&</td><td>nbsp;</td><td></td>Z605212</tr><tr><td>エリスロポエチン、ヒト (hEPO)、250 U (2.5 &micro;g) (1 mL)</td><td>Roche</td><td>11120166001</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10?単位&nbsp;&nbsp;1 mL)</td><td>Milipore, Merck</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 15 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes 50 mL</td><td>Greiner Bio-0ne</td><td>227270</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ ,透明 ,滅菌済み F.Gilson, P-200</td><td>Greiner Bio-One</td><td>739288</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ,透明 ,滅菌済み F.Gilson, P10</td><td>Greiner Bio-One</td><td>771288</td><td></td></tr><tr><td>フィルターチップ,透明 ,滅菌 F.Gilson、P1000</td><td>Greiner Bio-One</td><td>740288</td><td></td></tr><tr><td>FITC 標識抗アルファ;平滑筋アクチン(SMA)(クローン1A4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F3777</td><td></td></tr><tr><td>FITC標識ラット抗マウスCD45(クローン30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103107</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat IgG2b、&kappa;Isotype Ctrl 抗体 (clone RTK4530)</td><td>Biolegend</td><td>400605</td><td></td></tr><tr><td>蛍光封入剤</td><td>DAKO</td><td>S3023</td><td></td></tr><tr><td>Gascompress</td><td>Cutisoft</td><td>45846</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ Cutisoft 10 x 10 cm</td><td>Bsn Medical</td><td>45844_00</td><td></td></tr><tr><td>ゲルあぶらとり紙、Grade GB003</td><td>Whatman</td><td>WHA10547922</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン溶液、B</td> <td>型Sigma-Aldrich</td><td>G1393-100 ml</td><td></td></tr><tr><td>グラスゴーの MEM (GMEM)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>21710082</td><td></td></tr><tr><td>IHC 亜鉛固定剤</td><td>BD Pharmigen</td><td>550523</td><td></td></tr><tr><td>IncuSafe CO2 インキュベーター</td><td>PHCBi</td><td>MCO-170AICUV-PE</td><td></td></tr><tr><td>インターロイキン-6, ヒト (hIL-6)</td><td>Roche</td><td>11138600001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>Gibco,Thermofisher scientific</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100x)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td>11140035</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライドボックス</td><td>Kartell Labware</td><td>278</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド, Starfrost</td><td>Knittel ガラス</td><td>VS113711FKB.0</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>QT00110467</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Eng_1_SG QuantiTect プライマーアッセイ</td><td>Qiagen</td><td>QT00148981</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Epha4_1_SG QuantiTect プライマーアッセイ</td><td>Qiagen</td><td>QT00093576</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect プライマーアッセイ</td><td>Qiagen</td><td>QT00154014</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Flt1_1_SG QuantiTect プライマーアッセイ</td><td>Qiagen</td><td>QT00096292</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Flt4_1_SG QuantiTect プライマーアッセイ</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td>QT00099064</tr><tr><td>Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Amine</td><td>Qiagen</td><td>QT01658692</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>QT00097020</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer</td><td>Qiagen</td><td>QT00156982</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay</td><td>Qiagen</td><td>QT00153104</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer</td><td>Qiagen</td><td>QT01052044</td><td></td></tr><tr><td>Mm_Tek_1_SG QuantiTect プライマーアッセイ</td><td>Qiagen</td><td>QT00114576</td><td></td></tr><tr><td>Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts&nbsp;(2メートル)</td><td>Gibco、Thermofisher scientific</td><td>A24903</td><td>バイアルを液体窒素(195.79°;C) 無期限</td></tr><tr><td>マウス胚性幹細胞株 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1033</td> Dr <td>A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada によって生成されました。[Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1&ndash;2)、79&ndash;90(1998)]。</td></tr><tr>ライデン大学医療センターで生成された<td>マウス胚性幹細胞株Acvrl1 +/-およびAcvrl1 +/+</td><td></td><td></td>[<td>Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698&ndash;2712(2018)]。</td></tr><tr><td>マウス胚性幹細胞株E14</td><td></td><td></td><td>Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635&ndash;3642(2001年)。</td></tr><tr><td>マウス胚性幹細胞株R1(ATCC SCRC-1011)</td><td>ATCC</td><td>SCRC-1011</td><td>Dr A Nagy、Samuel Lunenfeld Research Institute、Mount Sinai Hospital、600 University Ave、Toronto、Ontario、M5G 1X5、Canadaによって生成されます。[Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424&ndash;8428(1993)]。</td></tr><tr><td>マウス胚性幹細胞株Z /赤(株129 / Ola)</td><td></td><td></td>博士<td>A Nagy、サミュエル・ルーネンフェルド研究所、マウントサイナイ病院、600ユニバーシティアベニュー、トロント、オンタリオ州、M5G 1X5、カナダ[Vintersten、K.、et al. Genesis. 40(4)、241&ndash;246(2004)]。</td></tr><tr><td>NanoDrop 1000 UV/VIS 分光光度計</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>ND-1000</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Selleckchem</td><td>S1036</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB, Recombinant Human</td><td>Peprotech</td><td>100-14B</td><td></td></tr><tr><td>Pecam-1 抗体, Rat Anti-Mouse</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Gibco, Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>15140122</tr><tr><td>ペトリ皿、PS、94/16 mm、標準、通気口付き、滅菌済み</td><td>Greiner Bio-One</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Pipetboy acu 2</td><td>Integra-Biosciences</td><td>155 019</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman G マルチチャンネル P8 x 200G</td><td>ギルソン</td><td>F144072</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman G スターターキット、4 ピペットキット、P2G、P20G、P200G、P1000G</td><td>ギルソン</td><td>F167360</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト BMP-4タンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>314-BP</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Plus mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74134</td><td></td></tr><tr><td>血清学ピペット、10 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607 180</td><td></td></tr><tr><td>血清学ピペット、25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760 180</td><td></td></tr><tr><td>血清学ピペット、5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606 180</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム (NaOH)</td><td>Merck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム 100 mM</td><td>Gibco、サーモフィッシャー 科学</td><td>11360039</td><td></td></tr><tr><td>試験管 5ml 丸底、セルストレーナーキャップ付き</td><td>コーニング</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>サーマルサイクラー、T100</td><td>バイオラッド</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>トリトン X-100 (BioXtra)</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルー ソリューション、0.4%</td> <td>Gibco、サーモフィッシャー サイエンティフィ</td><td>ック</td><td></td>15250061</tr><tr><td>トリプシン (2.5%)</td><td>Gibco、Thermofisher scientific</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>真空フィルター/保存ボトルシステム、500 mL</td><td>Corning</td><td>430758</td><td></td></tr><tr><td>VEGFA165、組換えマウス</td><td>Peprotech</td><td>450-32</td><td></td></tr><tr><td>水、滅菌</td><td>Fresenius-Kabi</td><td>B230531</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath、Lab-Line Digital</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>18052A</td><td></td></tr></tbody></table>

インビトロ 血管疾患モデリングおよび薬物検査のためのマウス胚性幹細胞を用いた血管新生の三次元発芽アッセイ

In Vitro Three-Dimensional Sprouting Assay of Angiogenesis Using Mouse Embryonic Stem Cells for Vascular Disease Modeling and Drug Testing

人工多能性幹細胞(iPSC)および遺伝子編集技術の最近の進歩により、表現型創薬(PDD)プログラムのための新しいヒト細胞ベースの疾患モデルの開発が可能になりました。これらの新しいデバイスは、ヒトにおける治験薬の安全性と有効性をより正確に予測することができますが、臨床への開発は依然として哺乳類のデータ、特にマウス疾患モデルの使用に強く依存しています。したがって、ヒトオルガノイドまたは臓器オンチップ疾患モデルと並行して、関連するin vitroマウスモデルの開発は、種間およびin vivoおよびin vitro条件との間の直接的な薬効および安全性比較を評価するための満たされていないニーズです。 ここでは、胚様体(EB)に分化させたマウス胚性幹細胞を利用する血管発芽アッセイについて説明する。3Dコラーゲンゲル上で培養された血管新生EBは、発芽血管新生と呼ばれるプロセスである拡張する新しい血管を発達させます。このモデルは、内皮先端細胞の選択、内皮細胞の移動と増殖、細胞誘導、管形成、壁細胞動員など、既存の血管網からの血管の形成であるin vivo発芽血管新生の重要な特徴を要約しています。血管新生を調節する薬物や遺伝子のスクリーニングに適しており、最近記載されたヒトiPS細胞技術に基づく3次元(3D)血管アッセイとの類似性を示しています。

血管発芽アッセイのプロトコル概要を図1に示す。3つの独立した129/Ola mESC株(Z/Red、R1、およびE14)に由来する9日齢のEBを、コラゲナーゼAを用いて酵素的に単一細胞に解離させた。すべての細胞株が強固な内皮分化を示し、内皮細胞への分化能に差は認められなかった。全ての細胞株は、内皮細胞の約10.5%±1.3%を産生した(図2A)。PECAM-1(+)細胞集団におけるPANエンドテリアル細胞マーカーの相対発現レベルも定量化した。解析したすべてのマーカー(Flk1、Flt1、Flt4、 Eng、Tie2、Cdh5)のmRNA発現レベルは、細胞株と実験の間で同等であり、分化プロトコルの堅牢性が確認されました(図2B)。PECAM-1(+)細胞集団は、プロトコルによって生成された内皮細胞の比較的未成熟な状態を支持する動脈(Notch1<...

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in vitroで発芽血管新生を制御する生物学的プロセスを解析します。この技術は、薬物の検査、疾患のモデリング、および胚的に致命的な欠失の文脈での特定の遺伝子の研究に適用できます。

Recent advances in induced pluripotent stem cells (iPSC) and gene editing technologies enable the development of novel human cell-based disease models for ...

このプロトコルは、血管形成の多くの特徴を再現し、薬物の試験に使用できるin vitro発芽血管新生アッセイについて説明しています。この方法は、ラボで簡単に実装でき、堅牢でスケーラブルです。ヒトリンパ管内皮細胞やミクロスフェアを用いたアッセイと多くの類似点があります。このモデルは、病理学的血管新生につながる内皮先端細胞選択および配向内皮細胞移動の欠陥を示す表現型を頑健に模倣する。今回の研究は、特に遺伝子スクリーニングを行うことにより、発芽血管新生を調節する機構、重要な遺伝子、および関与するシグナル伝達経路に関する手掛かりを得ることができる。 主な課題は、培養中のマウス胚性幹細胞の品質または多能性を維持することである。細胞株の多能性段階と形態を定期的にチェックすることが重要です。また、細胞株は染色体を失ったり獲得したりするために培養する傾向があるため、細胞株の核型決定を行うことも重要です。まず、6ウェル細胞培養プレートの1ウェルを500マイクロリットルの0.1%ゼラチン溶液でコーティングし、二酸化炭素インキュベーターに30分間入れます。次に、ゼラチンコーティングされたプレートをPBSで洗浄し、500マイクロリットルの新たに調製したCMプラスマイナス培地を加えます。マウス胚性幹細胞またはmESCの純粋な集団を得るには、細胞培養プレートを10x TVPバッファーで室温で30秒間トリプシン処理します。次に、細胞を1ミリリットルの中胚葉分化培地に再懸濁してから、ゼラチンコーティングされた6ウェルプレートに30分間移し、mESCが懸濁状態にある間にマウス胚性線維芽細胞を付着させます。トリパンブルー色素のノイバウアー血球計算盤を使用して生細胞をカウントする前に、細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。次いで、細胞を200倍Gで室温で5分間遠心分離する。上清を除去し、細胞ペレットを適量の中胚葉分化培地に再懸濁する。底に15ミリリットルの滅菌水を加えて、4つの94ミリメートルの低アタッチメントポリスチレン皿を準備します。細胞懸濁液を滅菌プラスチックリザーバーに移した後、マルチチャンネルピペットの4つの位置に、チャンネルあたり22マイクロリットルの細胞懸濁液をロードします。94 mm 皿の逆さにした蓋を持ち上げて、内側を上に向けてフローキャビネットのきれいな面に置きます。各蓋の内面に40滴の細胞懸濁液を堆積させ、滴が水に面するように、蓋を邪魔することなく慎重にひっくり返して皿に戻します。これを分化ゼロ日と見なして、二酸化炭素インキュベーターで皿を4日間インキュベートします。4日間のインキュベーションの後、P1000ピペットを使用して15ミリリットルの円錐形のチューブにぶら下がっている滴を集めます。上清を除去する前に、EB沈殿物をチューブに入れてください。EBを3ミリリッ

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、血管新生の反復するいくつかの段階そのin vitroでの血管新生アッセイのプロトコルを示しています。タイムラプス発芽の画像、管腔形成、分岐と吻合 - 血管新生の主要な機能は -...

血管新生の研究のために最適化されたフィブリンゲルビーズアッセイ

新生児マウスの網膜は血管新生を調節する別の遺伝子や薬剤の役割の調査を可能にし、血管新生のよく特徴付け生理学的モデルを提供...

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

我々は、単離され、十分に特徴付けられた環境で、in vivoで血管新生を分析するためのモデルとして動静脈（AV）ループの生成のための顕微的なアプローチを説明します。このモデルだけでなく、血管新生の研究のために有用であるだけでなく、最適なエンジニアリングを軸方向に血管および移植組織に適しています。...

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

In vitro血管芽腫 (HBs) と HBs におけるその役割の古典的な腫瘍血管新生が存在するかどうかを評価する包括的な手順を提案します。結果は、HB 血管新生の複雑さを強調表示し、血管新生のこの共通の形態の HB...

発芽アッセイ回転楕円体を使用して推定される芽新生体外パフォーマンスを評価する包括的な手順

誘導多能性幹細胞(iPSC-EPs)に由来する内皮前駆体は、心血管疾患治療に革命を起こさせ、より忠実な心血管疾患モデルの作成を可能にする可能性を秘めています。本明細書において、三次元(3D)コラーゲン微小環境におけるiPSC-EPの封入およびこれらの細胞の血管球電位の定量分析について説明する。...

iPSC由来内皮前駆体の血管学的電位を定量化するインビトロ3Dモデルと計算パイプライン

この方法は、標準化されたマイクロ流体プラットフォームにおける40の浸透した3Dマイクロ容器としてiPSC由来内皮細胞の培養を記述する。このプラットフォームは、アナストモシスや、スケーラブルで高スループットな方法での血管新芽の安定化を含む、3Dでの勾配駆動血管新生芽芽の研究を可能にします。...

iPSC由来内皮細胞の浸透した3D血管新生発芽をインビトロで研究するための標準化およびスケーラブルなアッセイ

三次元共培養スフェロイド血管新生アッセイシステムは、生理学的血管新生を模倣するように設計されている。共培養スフェロイドは、2つのヒト血管細胞前駆体、CFFCおよびMSCによって形成され、コラーゲンゲルに埋め込まれる。新しいシステムは血管新生調節器の評価に有効であり、生体内研究により関連性の高い情報を提供する。...

内皮コロニー形成細胞と間葉系幹細胞によって形成された共培養スフェロイドを用いた3次元血管新生アッセイ系

このプロトコルは、微小血管増殖の元生体モデルである脈絡芽発芽アッセイを提示する。このアッセイは、脈絡膜微小血管の増殖に関与する経路を評価し、野生型および遺伝子組み換えマウス組織を用いた薬物治療を評価するために使用することができる。...

眼小血管血管新生のエキビボロイド発芽アッセイ

この研究では、2次元(2D)スクラッチ創傷移動アッセイと3次元(3D)スフェロイドスプラウティングアッセイ、およびRNA抽出や免疫細胞化学などのそれぞれのダウンストリーム分析方法が、 in...

Scratch Wound Migration Assay と Spheroid Sprouting Assay を活用した機能的および分子レベルでの血管新生の調査

発芽血管新生は、発生と疾患の基本であり、複雑な分子的および機械的プロセスに関与しています。ブタの頸動脈からの細胞芽を解析し、硬さ依存性の血管新生と明確なリーダーフォロワー細胞力学を明らかにする、汎用性の高い2.5D ex vivo...

生体組織における発芽血管新生の ex vivo 機械的特性評価のための2.5Dモデル

学ぶマウス胚性幹細胞を用いた三次元血管新生発芽アッセイ。コラーゲンゲル内でEBを培養し、DC101やDAPTによる薬物検査や遺伝子スクリーニングを行い、血管形成メカニズムと創薬研究に応用する。

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