Name: マウスにおける脳卒中のモデリング:外頸動脈を介した過渡中脳動脈閉塞 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶマウス脳卒中モデル：フィラメント法による一過性中脳動脈閉塞。レーザードップラー血流モニタリングと神経学的評価を含む標準化プロトコルで、再灌流を伴う人間の脳卒中を再現し、前臨床研究の再現性向上に貢献します。

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私たちは、ImmunoStrokeコンソーシアムのすべてのコラボレーションパートナーに感謝します (FOR 2879, 免疫細胞から脳卒中の回復まで) 提案と議論のために.この研究は、ドイツのドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG、ドイツ研究財団)が、ミュンヘン・クラスター・フォー・システム・ニューロロジー(EXC 2145 SyNergy - ID 390857198)の枠組みの下でドイツの卓越性戦略の下で資金提供を受け、助成金LI-2534/7-1、LI-2534/7-1およびLL-112/1-1.1。

このビデオで報告された実験は、実験動物の使用に関する国家ガイドラインに従って行われ、プロトコルはドイツ政府委員会(ドイツのドイツ、ミュンヘン、ドイツ)によって承認されました。10週齢の雄C57Bl/6Jマウスを使用し、制御温度(22±2°C)で収容し、12時間の明暗サイクル期間とペレット食品および水 アドリビタムへのアクセスを行った。
1. 材料と機器の準備
<ol><li>熱毛布を接続して、麻酔中の操作領域の温度とマウス体温を37°Cに保ちます。</li>
	<li>オートクレーブはさみおよび鉗子は、70%エタノール溶液を準備し、利用可能なデブンタンテノールの目軟膏、綿のいくつかの部分、および5-0コーティングされた編組ポリエステル縫合糸を使用する準備ができておきます。動物の切開部位を水分補給するために、0.9%の生理食塩水(針なし)で1 mLシリンジを調製します。麻酔ガス(100%O2+イソフルラン)を準備します。</li>
	<li>10 μL ピペットチップ(3~5 mm)の先端を切って、レーザードップラープローブ用のホルダーを準備します。 注:すべての器具は熱いビードの殺菌器を使用して殺菌される。表面はまた、微生物消毒スプレーで手術の前後に消毒されます。手術前、マウスの頭と胸の周囲の領域は、創傷消毒スプレーで消毒されます。</li>
</ol>2. レーザードップラーの準備
<ol><li>手術の30分前にマウスに鎮痛薬を注入する(4mg/kgカルプロフェンおよび0,1mg/kgブプレノルフィン、腹腔内)。</li>
	<li>自発的な身体運動とビブリッサエの停止まで4%のイソフルラン流量で誘導室に置くことによって、マウスを麻酔します。</li>
	<li>麻酔マスク内の鼻を持つ操作領域の起こりやすい位置にマウスを置きます。さらに4%のイオブルラン濃度を維持し、それを減らし、2%に保ちます。</li>
	<li>37°Cでマウスの体温を維持するために関連するフィードバック制御加熱パッドを設定し、外科的処置全体の温度を監視するために直腸プローブを静かに挿入します。</li>
	<li>両目にデブサンテノール眼軟膏を適用する。</li>
	<li>左目と耳を取り巻く皮膚や毛髪を70%エタノールで消毒します。</li>
	<li>頭皮を左耳と目(長さ1cm)の間で切り、頭蓋骨を露出させる。</li>
	<li>頭蓋の下のMCAを視覚化するために、側頭筋を切断して退断します。</li>
	<li>レーザードップラープローブ/ファイバーを左MCAの上に接着剤で固定して、先端の外側の部分を接着剤で固定します。次に、皮膚を接着して、先端ホルダーの周りの傷口を閉じます。2~3滴の硬化剤を塗布して、プロセスをスピードアップします。レーザードップラー繊維が接着されておらず、いつでも簡単にチップホルダーから取り外しできることを確認してください。</li>
</ol>3. 過渡MCAoモデル(オクルージョン)
<ol><li>マウスを上の位置に回します。スパウトを麻酔コーンに入れ、足をテープで固定します。</li>
	<li>胸部を取り巻く皮膚や毛髪を消毒し、首に長さ2cmの中線切開を行います。</li>
	<li>鉗子を使用して皮膚と顎下腺を引き離します。胸骨筋を保持し、外科分野を露出させ、左共通頸動脈(CCA)を見つけるためにリトラクターを使用してください。結合組織および周囲の神経から解放されたCCAを解剖し(迷走神経に害を与えることなく)、分岐前に一過性の結紮を行う。</li>
	<li>外的頸動脈(ECA)を解剖し、最も遠位の目に見える部分で永久結び目を結ぶ。ECAの下に別の縫合線を配置し、分岐の近くに配置し、後で使用する緩い結び目を準備します。</li>
	<li>内部頸動脈(ICA)を解剖し、その上に微小血管クリップを置き、分岐の上に5mm。迷走神経を傷めないようにしてください。</li>
	<li>タイトと緩い結紮の間のECAに小さな穴をカットします。ECA全体をカットしないように注意してください。</li>
	<li>フィラメントを導入し、CCAに向かって進めます。管腔の周りのECAの緩い結紮を締めて、その位置のフィラメントをすぐに固定し、微小血管クリップを取り外すときに出血を避けます。</li>
	<li>マイクロ血管クリップを取り外し、レーザードップラーで測定した脳血流の急激な減少(>80%)を検出することによってMCAの起源に達するまでICAを通してフィラメントを挿入します。さらに、ECAの周りの結び目を引き締めることによって、この位置のフィラメントを固定します。 注:フィラメントが適切な方向に向かうと、スムーズに進み、抵抗は見られないようにしてください。</li>
	<li>フィラメント挿入前と後のレーザードップラー値を記録します。</li>
	<li>リトラクタを取り除き、創傷を縫合する前に胸骨筋と顎下腺を再配置する。レーザードップラープローブを取り外し、37°Cの回収室に1時間(フィラメント除去まで)を入れます。</li>
</ol>4. 過渡MCAoモデル(リパーフュージョン)
<ol><li>自発的な身体運動とビブリッサエの停止まで4%のイソフルラン流量で誘導室に置くことによって、マウスを麻酔します。</li>
	<li>両目にデブサンテノール眼軟膏を適用する。</li>
	<li>麻酔マスクの中に、そのスナを伴う操作領域の起こりやすい位置にマウスを置きます。さらに4%のイオブルラン濃度を維持し、それを減らし、2%に保ちます。テープで動物の足を固定します。</li>
	<li>レーザードップラープローブをプローブホルダーに挿入します。</li>
	<li>創傷縫合糸を取り除き、皮膚と顎下腺を引き離すために鉗子を使用する。胸骨筋を優しく引っ張り、外科分野を露出させるためにレトラクターを使用してください。</li>
	<li>フィラメントを引き締めるECA縫合を緩め、そっとフィラメントを引っ張ります。除去中にフィラメントのシリコーンゴムコーティングを損傷しないようにしてください。</li>
	<li>ECA縫合糸をしっかりと結びます。</li>
	<li>レーザードップラー装置における脳血流の増加を確認する(再灌流前の初期値の>80%)。</li>
	<li>フィラメント除去の前後にレーザードップラー値を記録します。</li>
	<li>CCAからの分岐の前に一過性の結紮を開く。</li>
	<li>リトラクタを取り外し、創傷を縫合する前に胸骨筋と顎下腺を再配置する。動物を37°Cの回復室に1時間置き、麻酔から回復します。</li>
	<li>回復後、マウスを温度制御された部屋のケージに戻します。</li>
	<li>手術後3日目までケージの床に小さなペトリ皿にウェットフードペレットとヒドロゲルを加えることで、動物の世話をします。</li>
	<li>手術後3d(4mg /kgカルプロフェンおよび0.1mg/kgブプレノルフィン)に対して12時間ごとに鎮痛を注入する。</li>
</ol>5. シャム操作
<ol><li>上述の手順は、動脈の結紮およびフィラメントの導入を含む全ての手順を行う(ステップ1〜3.7)。</li>
	<li>フィラメントを挿入した直後に取り外します。その後、動物を1時間回収室に入れます。</li>
	<li>再度操作領域に動物を置き、完全な脳血流回復を確実にするためにCCAの一過性の結紮を除去する。</li>
	<li>創傷を縫合し、麻酔から回復するために1時間37°Cの回収室に動物を入れた。回復後、マウスを温度制御された部屋のケージに戻します。</li>
	<li>手術後3日目までケージの床に小さなペトリ皿にウェットフードペレットとヒドロゲルを加えることで、動物の世話をします。</li>
	<li>手術後3d(4mg /kgカルプロフェンおよび0.1mg/kgブプレノルフィン)に対して12時間ごとに鎮痛を注入する。</li>
</ol>6. ニューロスコア
<ol><li>ニューロスコアは常に同じ時間帯に実行し、個々の外科医の間で「中立的な臭い」を維持するために外科服を使用します。</li>
	<li>マウスは、テストの前に「開いた」ケージで部屋の中で30分間休ませます。</li>
	<li>表 1と表 2の各項目を 30 s で観察します。</li>
</ol>7. 心臓内灌流
<ol><li>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)-ヘパリン(2 U/mL)を含む20mLシリンジを準備し、重力駆動灌流を容易にするためにベンチの上に1m置きます。(任意:4%パラホルムアルデヒド(PFA)を用いて、PBS、pH7.4で4%PFAを含む20mLシリンジを用いて心臓内灌流を行う。</li>
	<li>ケタミンとキシラジン(それぞれ120と16mg/kgの体重)のイントルペリトン100 μLを注入します。5分待って、自発的な身体運動とビブリッサエの停止を確認します。</li>
	<li>動物を圧出位置に固定し、70%エタノールで腹部体表面を消毒する。</li>
	<li>腹部に3cmの切開を行います;ダイヤフラム、肋骨、胸骨を切って心臓を完全に視覚化する。</li>
	<li>右心房に小さな切開を行い、左心室に輸血カニューレを挿入します。</li>
	<li>PBS-ヘパリン20 mLを使用したパーフューズ。</li>
	<li>灌流後、動物の首を切り落とし、脳を取り除きます。</li>
	<li>粉末ドライアイスで脳を凍らせ、さらに使用するまで-80°Cで保存します。</li>
</ol>8. 梗塞容積測定
<ol><li>凍結切断には、クライオスタットを使用して、脳を400μmごとに20μmの厚さのセクションに切断します。セクションをスライドに置き、使用するまで-80 °Cでスライドを保管してください。</li>
	<li>クレシルバイオレット(CV)染色<ol>
<li>500mLのH2OでCVアセテートを溶解するまで撹拌・加熱(60°C)0.5gで染色液を調製します。溶液が冷めた後、暗いボトルに保管してください。60°Cに再加熱し、すべての使用前にフィルター。</li>
		<li>スライドを室温で30分間乾燥させます。95%エタノールに15分間、70%エタノールで1分間、50%エタノールで1分間浸します。</li>
		<li>2分間蒸留水にスライドを浸します。蒸留水をリフレッシュし、スライドを水に1分間入れます。その後、スライドを60°Cで10分間予熱染色液に浸します。 スライドを蒸留水で2回1分間洗います。</li>
		<li>スライドを95%エタノールに2分間浸漬します。5分間、100%エタノールに入れる。100%エタノールをリフレッシュし、2分間エタノールにスライドを再び入れる。その後、スライドを取り付け媒体で覆います。</li>
		<li>分析 (図 4C)<ol>
<li>スライドをスキャンし、スワンソン法12 で間接梗塞の体積を分析し、次の式を使用して浮腫を補正します。 (虚血領域)=(虚血領域)((イプシアテラミカル半球)-(対角半球))</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Stroke.</a> Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).</li>
<li>O'Collins, V. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((1%2C026+experimental+treatments+in+acute+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">1,026 experimental treatments in acute stroke.</a> Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).</li>
<li>Tureyen, K., Vemuganti, R., Sailor, K. A., Dempsey, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infarct+volume+quantification+in+mouse+focal+cerebral+ischemia%3A+a+comparison+of+triphenyltetrazolium+chloride+and+cresyl+violet+staining+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Infarct volume quantification in mouse focal cerebral ischemia: a comparison of triphenyltetrazolium chloride and cresyl violet staining techniques.</a> Journal of Neuroscience Methods. 139 (2), 203-207 (2004).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+rat+model+of+thrombotic+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">A new rat model of thrombotic focal cerebral ischemia.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 17 (2), 123-135 (1997).</li>
<li>Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, S., Cummins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+middle+cerebral+artery+occlusion+without+craniectomy+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.</a> Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).</li>
<li>Carmichael, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rodent+models+of+focal+stroke%3A+size%2C+mechanism%2C+and+purpose%5BTitle%5D)+AND+%22NeuroRx%22%5BJournal%5D)">Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose.</a> NeuroRx. 2 (3), 396-409 (2005).</li>
<li>Engel, O., Kolodziej, S., Dirnagl, U., Prinz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+stroke+in+mice+-+middle+cerebral+artery+occlusion+with+the+filament+model%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Modeling stroke in mice - middle cerebral artery occlusion with the filament model.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (47), e2423(2011).</li>
<li>Dirnagl, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+concerted+appeal+for+international+cooperation+in+preclinical+stroke+research%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">A concerted appeal for international cooperation in preclinical stroke research.</a> Stroke. 44 (6), 1754-1760 (2013).</li>
<li>McNutt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journals+unite+for+reproducibility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Journals unite for reproducibility.</a> Science. 346 (6210), 679(2014).</li>
<li>Llovera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Results+of+a+preclinical+randomized+controlled+multicenter+trial+%28pRCT%29%3A+Anti-CD49d+treatment+for+acute+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Results of a preclinical randomized controlled multicenter trial (pRCT): Anti-CD49d treatment for acute brain ischemia.</a> Science Translational Medicine. 7 (299), (2015).</li>
<li>Llovera, G., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+next+step+in+translational+research%3A+lessons+learned+from+the+first+preclinical+randomized+controlled+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The next step in translational research: lessons learned from the first preclinical randomized controlled trial.</a> Journal of Neurochemistry. 139, Suppl 2 271-279 (2016).</li>
<li>Swanson, G. M., Satariano, E. R., Satariano, W. A., Threatt, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Racial+differences+in+the+early+detection+of+breast+cancer+in+metropolitan+Detroit%2C+1978+to+1987%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Racial differences in the early detection of breast cancer in metropolitan Detroit, 1978 to 1987.</a> Cancer. 66 (6), 1297-1301 (1990).</li>
<li>Lourbopoulos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inadequate+food+and+water+intake+determine+mortality+following+stroke+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Inadequate food and water intake determine mortality following stroke in mice.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 37 (6), 2084-2097 (2017).</li>
<li>Clark, W. M., Lessov, N. S., Dixon, M. P., Eckenstein, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monofilament+intraluminal+middle+cerebral+artery+occlusion+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Neurological+Research%22%5BJournal%5D)">Monofilament intraluminal middle cerebral artery occlusion in the mouse.</a> Neurological Research. 19 (6), 641-648 (1997).</li>
<li>Jackman, K., Kunz, A., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+focal+cerebral+ischemia+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Modeling focal cerebral ischemia in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 793, 195-209 (2011).</li>
<li>Kitano, H., Kirsch, J. R., Hurn, P. D., Murphy, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhalational+anesthetics+as+neuroprotectants+or+chemical+preconditioning+agents+in+ischemic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cerebral+Blood+Flow+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Inhalational anesthetics as neuroprotectants or chemical preconditioning agents in ischemic brain.</a> Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (6), 1108-1128 (2007).</li>
<li>Rousselet, E., Kriz, J., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+intraluminal+MCAO%3A+cerebral+infarct+evaluation+by+cresyl+violet+staining%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Mouse model of intraluminal MCAO: cerebral infarct evaluation by cresyl violet staining.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4038(2012).</li>
<li>Rha, J. H., Saver, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+recanalization+on+ischemic+stroke+outcome%3A+a+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The impact of recanalization on ischemic stroke outcome: a meta-analysis.</a> Stroke. 38 (3), 967-973 (2007).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+filament+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+rats%3A+does+the+reperfusion+method+matter+24+hours+after+perfusion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transient filament occlusion of the middle cerebral artery in rats: does the reperfusion method matter 24 hours after perfusion.</a> BMC Neuroscience. 13, 154(2012).</li>
<li>Sommer, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke%3A+experimental+models+and+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke: experimental models and reality.</a> Acta Neuropathologica. 133 (2), 245-261 (2017).</li>
<li>Jones, B. J., Roberts, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rotarod+suitable+for+quantitative+measurements+of+motor+incoordination+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Naunyn-Schmiedebergs+Archiv+f%C3%BCr+Experimentelle+Pathologie+und+Pharmakologie%22%5BJournal%5D)">A rotarod suitable for quantitative measurements of motor incoordination in naive mice.</a> Naunyn-Schmiedebergs Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 259 (2), 211(1968).</li>
<li>Bouet, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adhesive+removal+test%3A+a+sensitive+method+to+assess+sensorimotor+deficits+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">The adhesive removal test: a sensitive method to assess sensorimotor deficits in mice.</a> Nature Protocols. 4 (10), 1560-1564 (2009).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+test+for+detecting+long-term+sensorimotor+dysfunction+in+the+mouse+after+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">A test for detecting long-term sensorimotor dysfunction in the mouse after focal cerebral ischemia.</a> Journal of Neuroscience Methods. 117 (2), 207-214 (2002).</li>
<li>Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+plasticity+and+assessment+of+forelimb+sensorimotor+outcome+in+unilateral+rat+models+of+stroke%2C+cortical+ablation%2C+parkinsonism+and+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury.</a> Neuropharmacology. 39 (5), 777-787 (2000).</li>
<li>Roth, S., Yang, J., Cramer, J., Malik, R., Liesz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+cytokine-induced+sickness+behavior+after+ischemic+stroke+by+an+optimized+behavioral+assessment+battery%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%2C+Behavior%2C+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Detection of cytokine-induced sickness behavior after ischemic stroke by an optimized behavioral assessment battery.</a> Brain, Behavior, and Immunity. 91, 668-672 (2021).</li>
</ol>

著者らは開示する競合する利益を持っていません。

本プロトコルは、標準化された過渡MCAoモデルを確立するためのドイツの多施設研究コンソーシアム(「ImmunoStroke」)の合意に基づく実験的ストロークモデルを記述する。ECAを介してシリコンコートフィラメントを導入してMCAの原点に導入した一過性MCAoモデルは、閉塞期間を経て動脈再灌流を達成するために最も広く使用されているストロークモデルの1つです。したがって、この手順は、翻訳上関連のストローク モデルと見なすことができます。
ビデオで提示された「フィラメントモデル」は、頭蓋骨骨組み術を必要とせず、閉塞した血管の完全な再灌流を達成するなど、以前に説明した他のストロークモデルと比較していくつかの利点があります。しかし、外科的介入の複雑さは、侵襲的な手術と気管と迷走神経に近接する異なる動脈の正確な操作を含むため、制限と考えることができる。麻酔薬の神経保護および脳卒中の結果に対する麻酔薬の影響はすでに十分に文書化されており、麻酔薬に対する動物の長期暴露も考慮すべき重要な要因となり得る。最後に、この外科的処置の複雑さにもかかわらず、訓...

脳卒中は、世界中の死亡と障害の最も一般的な原因の一つです。主に2つの異なる形態の脳卒中があり、虚血性と出血性があり、全脳卒中症例の80~85%が虚血性1である。現在、虚血性脳卒中の患者には、組換え組織プラスミノーゲン活性化剤(rtPA)または機械的血栓切れによる薬理学的治療の2つの治療法のみが利用可能です。しかし、狭い治療時間枠と複数の除外基準のために、選択された患者の数だけがこれらの特定の治療オプションの恩恵を受けることができます。過去20年間で、 前臨床およびトランスレーショナル脳卒中研究は神経保護アプローチの研究に焦点を当ててきました。しかし、臨床試験に到達したすべての化合物は、これまでのところ患者2に対する改善を示していない。
in vitroモデルでは、脳卒中の脳相互作用や病態生理学的メカニズムをすべて正確に再現できないため、動物モデルは前臨床脳卒中研究にとって非常に重要です。しかし、虚血性脳卒中は非常に複雑で不均一な疾患であるため、ヒト虚血性脳卒中のすべての側面を単一の動物モデルで模倣することは不可能である。このため、異なる虚血性脳卒中モデルが異なる種で経時開発されてきた。中大脳動脈の大脳動脈または永久遠位閉塞(MCA)の光血栓症は、新皮質3、4において小さく、局所的に定義された病変を誘導するモデルとして一般的に用いられている。これらに加えて、最も一般的に使用されるストロークモデルは、おそらくMCAの過渡的な閉塞が達成されるいわゆる「フィラメントモデル」である。このモデルは、MCAの起源に縫合フィラメントを一過性に導入し、脳血流の急激な減少と皮質下および皮質脳領域のその後の大梗塞に至る5。ほとんどのストロークモデルはMCA閉塞6を模倣するが、「フィラメントモデル」は虚血時間の正確な区切りを可能にする。フィラメント除去による再灌流は、血栓溶解(rtPAまたは機械的血栓切除術)後の脳血流回復のヒト臨床シナリオを模倣する。現在までに、この「フィラメントモデル」の異なる変更が記載されている。最も一般的なアプローチでは、最初にLongaらによって記述されます。1989年5月、シリコンコーティングされたフィラメントが、共通の頸動脈(CCA)を介してMCA 7の起源に導入される。広く使用されているアプローチですが、このモデルでは、フィラメントの除去後にCCAが永久に結紮されるため、再灌流時の血流の完全な回復はできません。
過去10年間、この「フィラメントモデル」を用いてマウスの脳卒中をモデル化することに関心を持つ研究グループが増えています。しかしながら、このモデルのかなりのばらつきと、手順の標準化の欠如は、これまでに報告された実験結果と科学的知見の変動性が高く、再現性が悪い理由の一部である2,8。現在の「複製危機」の潜在的な原因は、研究所間での再現性の低さに言及し、同じ実験方法論9を用いた研究グループ間の非比較的な脳卒中梗塞量である。実際、最初の前臨床無作為化対照多施設試験試験10を実施した結果、この実験ストロークモデルの十分な標準化の欠如とその後の結果パラメータが、独立した実験室間の前臨床試験における再現性の失敗の主な理由であることを確認することができました11.結果として生じる梗塞サイズの劇的な違いは、同じストロークモデルを使用しているにもかかわらず、確認研究だけでなく、堅牢で再現可能なモデルの欠如による科学的コラボレーションにも脅威を与える。
これらの課題を踏まえ、「ImmunoStroke」研究コンソーシアム(https://immunostroke.de/)における共同研究に用いられている標準化された過渡性MCAoモデルの手順を開発し、詳細に記述することを目指しました。このコンソーシアムは、脳卒中回復の機械主義の根底にある脳と免疫の相互作用を理解することを目的としています。さらに、脳卒中の結果分析のための組織学的および関連する機能法が提示される。すべての方法は、ImmunoStrokeコンソーシアムのすべての研究所で使用される確立された標準的な操作手順に基づいています。

<table><tbody><tr><td>45°Cランプ</td><td>H&S Kunststofftechnik</td><td></td><td>高さ: 18 cm</td></tr><tr><td>5/0 脅威</td><td>Pearsalls</td><td>10C103000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL シリンジ</td><td>ブラウン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>酢酸</td><td>シグマ ライフサイエンス</td><td>695092</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ドレーガー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ベパンテン ポマード</td><td>バイエル</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6J マウス</td><td>チャールズリバー</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>クランプ</td><td>FST</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>クリップ</td><td>FST</td><td>18055-04</td><td></td></tr><tr><td>クリップホルダー</td><td>FST</td><td>18057-14</td><td></td></tr><tr><td>Cotons</td><td>NOBA Verbondmitel Danz</td><td>974116</td><td></td></tr><tr><td>Cresyl violet</td><td>Sigma Life Science</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Thermo Scientific CryoStarNX70</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エタノール 70%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>521005</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 96%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>522078</td><td></td></tr><tr><td>エタノール 99%</td><td>CLN Chemikalien Laborbedorf</td><td>ETO-5000-99-1</td><td></td></tr><tr><td>フィラメント</td><td>ドッコル</td><td>602112PK5RE</td><td></td></tr><tr><td>ファイン 45 角度付き鉗子</td><td>FST</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>ファイン鉗子</td><td>FST</td><td>11252-23</td><td></td></tr><tr><td>ファインハサミ</td><td>FST</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>グルー</td><td>Orechseln</td><td>BSI-112</td><td></td></tr><tr><td>硬化剤グルー</td><td>Drechseln &Mehr</td><td>BSI-151</td><td></td></tr><tr><td>ヒーティングブランケット</td><td>FHC DC 温度コントローラー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>Abbot</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>イソペンタン</td><td>フルーカ</td><td>59070</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン</td><td>Inresa Arzneimittel GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>レーザードップラー</td><td>Perimed</td><td>PF 5010 LDPM、Periflux System 5000</td><td></td></tr><tr><td>レーザードップラープローブ</td><td>Perimed</td><td>91-00123</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 pH: 7.4</td><td>Apotheke Innestadt Uni Munchen</td><td>P32799</td><td></td></tr><tr><td>回収室</td><td>Mediheat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histokit 取り付け媒体</td><td>Roth</td><td>6638.1</td><td></td></tr><tr><td>生理食塩水</td><td>ブラウン</td><td>131321</td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>の羽</td><td>02.001.30.011</td><td></td></tr><tr><td>シリコンコーティングフィラメント</td><td>Doccol</td><td>602112PK5Re</td><td></td></tr><tr><td>ステレオマイクロスコープ</td><td>ライカ</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト プラス スライド</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>バンナス スプリングシザース</td><td>FST</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>キシラシン</td><td>アルブレヒト</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスにおける脳卒中のモデリング:外頸動脈を介した過渡中脳動脈閉塞

Modeling Stroke in Mice: Transient Middle Cerebral Artery Occlusion via the External Carotid Artery

脳卒中は、先進国における死亡の第3の最も一般的な原因であり、成人後天障害の主な原因である。現在までに、治療の選択肢は、脳卒中後最初の1時間以内に脳卒中患者のごく一部に制限されている。新しい治療戦略は、特に治療時間を延長するために広範囲に調査されています。これらの現在の調査には、脳卒中後の重要な病態生理学的経路の研究が含まれます, 例えば脳卒中後の炎症, 血管新生, 神経可塑性, 再生.過去10年間、独立した研究グループ間での実験結果や科学的知見の再現性が悪いという懸念が高まっています。いわゆる「レプリケーション危機」を克服するためには、すべての手続きのための詳細な標準化されたモデルが緊急に必要とされます。「ImmunoStroke」研究コンソーシアム(https://immunostroke.de/)における取り組みとして、一過性中大脳動脈閉塞(MCAo)の標準化されたマウスモデルが提案されている。このモデルは、フィラメントの除去時に血流を完全に回復させ、人間の脳卒中の大部分で起こる治療的または自発的な血栓の起こりをシミュレートする。この「フィラメント」ストロークモデルの外科的処置とその機能分析のためのツールは、付随するビデオで示されています。

ここで説明するモデルは、一般的に使用される「フィラメント」ストロークモデルの改変であり、これは、MCAの起源を一時的に遮断するためにECAを介してシリコンコーティングされたフィラメントを導入することから成っている(図1)。フィラメントを除去した後、ECA内の血流のみが永久に停止し、CCAおよびICAの完全な再活性化を可能にする。これにより、ヒト患者における薬理学的血栓溶解または機械的血栓切開に成功した後に観察された状況と同様に、脳の十分な再灌流(図2)が可能になる。また、この研究は、MCAの領域上の頭蓋骨でレーザードップラープローブに接続されたカニューレを固定することによって、閉塞と再灌流の両方の手順の間に脳血流を測定する方法についても説明する。
外科的処置の全体的な死亡率は、訓練を受けた外科医によって行われる場合&lt;5%である。MCAo後の早期時点では、動物は一般的に重度の姿勢および運動の欠損、一般的な弱さ、および体重13...

中大脳動脈閉塞の異なるモデル(MCAo)は、実験的な脳卒中研究で使用されています。ここでは、外部頸動脈(ECA)を介した一過性MCAoの実験的ストロークモデルについて説明し、これは、自然血栓溶解または治療のために脳血管血栓が除去されるヒトの脳卒中を模倣することを目的とする。

Stroke is the third most common cause of mortality and the leading cause of acquired adult disability in developed countries. To date, therapeutic options ...

ここで説明するフィラメントモデルでは、血流の完全な回復とそれが記録されている、マウスの間で、特に移動性脳卒中研究において、生産可能な流入を確保するための要件である。このモデルには、前に説明した他のストローク モデルと比較して 2 つの主な利点があります。頭蓋間術は必要なく、血管の完全な再灌流が達成される。フィラメントモデルは、異なる動脈のプロセス操作を含む複雑な外科的介入である。これら全ての可視化と説明は、小さいが重要なステップであり、神経外科医の学習期間を加速させるかもしれない。熱毛布を接続して、37°Cの麻酔中に操作領域の温度とマウスの体温を維持します。オートクレーブはさみと鉗子、70%エタノール溶液およびデブンサンテノールの目軟膏を準備し、綿とファイブOコーティング編組ポリエステルの縫合のいくつかの部分を、使用する準備ができておきます。切開部位を水分補給するために針なしで1ミリリットルの注射器に0.9%の生理食塩水を調製する。10マイクロリットルのピペットチップの先端を切断して、レーザードップラープローブ用のホルダーを準備します。マウスを完全に麻酔したら、操作領域内の起こりやすい位置に置きます。直腸プローブを静かに挿入して、外科的処置全体の温度を監視します。手術部位を消毒した後、左耳と目の間にこの頭皮を切り取り、頭蓋骨を露出させる。次に、頭蓋頭筋を切断して退断し、頭蓋骨の下にある複数の大脳動脈またはMCAを可視化する。左MCAの上部にレーザードップラープローブまたはファイバーを保持している先端の外側部分を接着剤で固定し、皮膚も接着するように皮膚を閉じます。硬化剤接着剤を2~3滴塗布して、処理をスピードアップします。レーザードップラー繊維が接着されておらず、いつでも簡単にチップホルダーから取り外しできることを確認してください。マウスを上の位置に回し、その後、スナを麻酔コーンに入れ、足をテープで固定します。胸部を取り巻く皮膚や毛髪を消毒し、首に長い2センチの長い中線切開を行います。鉗子を使用して皮膚下顎腺と胸骨腫筋を引き離します。リトラクターを使用して外科分野を露出させ、左共通の頸動脈またはCCAを見つける。CCAを血管神経に害を与えることなく、結合組織および周囲の神経から解放して解剖し、分岐前に一過性の結紮を行う。外的頸動脈またはECAを解剖し、最も遠位の目に見える部分で永久的な結び目を結ぶ。ECAの下に別の縫合糸を置き、分岐の近くに置き、後で使用する緩い結び目を準備します。内部頸動脈またはICAを解剖し、その上に約5ミリメートルの分岐の上に微小血管クリップを置く。迷走神経を傷めないようにしてください。その後、狭い結紮との間のECAに小さな穴をカットし、ECA全体を切断しないようにします。フィラメントを導入し、CCAに向かって進めます。内腔の周りのECAのゆるい結紮を締めて、その位置のフィラメントを一時的に固定します。微小血管クリップを取り外し、出血を防ぎます。微小血管クリップを取り外した後、MCAの原点に達するまでICAを通してフィラメントを挿入します。さらに、ECAの周りの結び目を引き締めることによって、この位置のフィラメントを固定します。フィラメント挿入前と後のレーザードップラー値を記録します。リトラクタを取り除き、創傷を縫合する前に骨腺下腺に胸骨筋を再配置する。レーザードップラープローブを取り外し、1時間摂氏37度の回収室に動物を置きます。麻酔マスクのスナを使用して操作領域内の起こりやすい位置にマウスを置き、動物の足をテープで固定します。レーザードップラープローブをプローブホルダーに挿入します。創傷縫合糸を取り除き、鉗子を使用して皮膚、顎下腺、胸腺腫筋を引き離します。リトラクターを使用して外科分野を露出させます。フィラメントを引き締めるECA縫合を緩め、そっとフィラメントを引っ張ります。取り外し時にフィラメントのシリコーンゴムコーティングを損傷しないようにしてください。フィラメント除去の前後にレーザードップラー値を記録します。ECA縫合糸をしっかりと結び付け、レーザードップラー装置の脳血流の増加を確認します。CCAからの分岐の前に一過性の結紮を開いて、完全な血流を回復させます。リトラクタを取り除き、創傷を縫合する前に骨腺下腺に胸骨筋を再配置する。その後、麻酔から回復するために1時間摂氏37度の回復室に動物を置きます。回復後、マウスは温度制御された部屋のケージに戻り、ケージフロアの小さなペトリ皿にウェットフードペレットとヒドロゲルを追加して動物の世話をし、手術後3日目まで12時間ごとに鎮痛を注入します。フィラメントを除去した後にCCAの血流が回復すると、脳の完全な再灌流が起こり、これはヒト患者における機械的血栓切除術に成功した後に観察された状況と同様である。脳卒中動物は、複合および焦点神経スコアに有意な変化を示したが、偽動物と比較した場合の一般的な神経スコアでは示さなかった。取り出された梗塞容積は、脳卒中誘導24時間後にコロナ直列脳部のクレゾール紫色染色を用いても行った。病変領域は、体性感覚および運動皮質、ならびに線条体のような皮質下構造を含む。梗塞の体積平均は61〜62ミリメートル平方メートルで、影響を受けた脳半球の48%を表す。隣接する組織、特に迷走神経に損傷を与えることなく、CCA、ECAおよびRCAの適切な解剖を行うことが重要であり、すべての構造の良好な視覚化を有し、フィラメントを挿入し、MCA起源を閉塞することができる。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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