Name: 蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 4 s
Description: 学ぶ蛍光相関分光法によるタンパク質凝集検出法。ALS関連TDP25や変異SOD1の拡散特性と凝集状態を解析し、神経変性疾患の病態解明に貢献する標準化プロトコルを提供します。

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A.K.は、日本科学振興会(JSPS)の科学研究助成(C)(#18K06201)の支援を受け、中谷財団の新しいコロナウイルス感染対策助成金、北海道大学未来研究リーダー事務所(Lステーション)からの助成金、ホアンシャ財団からの助成によって支援されました。M.K.は、革新的領域に関する科学研究のためのJSPS助成援助「多分子混雑バイオシステムのための化学」(#20H04686)と、革新的分野に関する科学研究のためのJSPS助成助成「生き物の情報物理学」(#20H05522)によって部分的に支援されました。

1. 材料・試薬
<ol><li>細胞培養用の発熱性フリー溶液および培地を使用する(表1)。</li>
	<li>超純水を用いた生化学実験用のソリューションを準備し、DNase/RNaseフリーとして使用します。</li>
	<li>ロットチェックプロセスで細胞培養に適したFBSを選択します。選択した FBS ロットは定期的に変更されるため、FBS のカタログとロット番号はここでは表すことができません。</li>
	<li>プラスミドDNA<ol>
<li>eGFP モノマー発現用の pmeGFP-N15を準備します。GFP-TDP25 表現のための pmeGFP-C1-TDP256;SOD1-G85R-GFP 発現のための pmeGFP-N1-SOD1-G85R7;キャリアとしてpCAGGS8。 注:meGFPは、強化されたGFP(eGFP)のA206K突然変異を運ぶ単量体変異体です。TDP25は、TDP-43のALS関連C末端フラグメントである。SOD1-G85Rは、SOD1のALS関連変異体である。</li>
	</ol>
</li>
	<li>細胞株<ol>
<li>マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞を使用してください。 注意:Neuro2a細胞はトランスフェクション効率が高く、外因性タンパク質を高発現しています。TDP25発現の場合、Neuro2aやHEK293細胞などの高い発現効率を有する細胞株が必要である。HeLa細胞では、TDP25は効率的に発現できなかった。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 細胞培養とトランスフェクション
<ol><li>Neuro2a細胞を通常の成長培地で半流暢に成長させる100mmプラスチック皿を準備する。 注:半合流に達するまで、前の播種後約48〜72時間、37°Cでインキュベートする必要があります。</li>
	<li>メディアを取り外します。</li>
	<li>0.5 mLのトリプシン-EDTA溶液を細胞培養皿に加え、37°Cで1分間インキュベートします。</li>
	<li>通常の成長培地を9.5mLを皿に加え、剥離した細胞を一時停止します。</li>
	<li>Trypan blueを使用して死んだセルを染色し、セルカウンターを使用するか手動でセル数をカウントします。次いで、培養培地中の細胞を希釈する(1.0×10 5/mL)。</li>
	<li>細胞のリシスのための35のmmのプラスチック皿またはライブ細胞測定のためのガラスベース皿に細胞懸濁液の2 mLを加える。</li>
	<li>37°Cで1日インキュベートします。</li>
	<li>トランスフェクションの1日の15分前に、次の準備を開始します。</li>
	<li>2つの1.5 mLチューブを準備し、各チューブにオプティ-MEM Iの100 μLを追加します。</li>
	<li>最初のチューブに、プラスミドDNA(溶液A)を1.0μg混合します。第2の管に、リポフェクトアミン2000(溶液B)の2.5 μLを混合する。 注:トランスフェクション効率を維持するために、DNAの総量は同じに保ちます。生細胞におけるFCS測定の発現量を減らすには、タンパク質発現に対するプラスミドDNAの割合が減少するはずです(例えば、pmeGFP-N1-SOD1-G85Rの0.2 μgおよびpCAGGS混合物の0.8 μg)。さらに、リポフェクトアミン2000の体積とプラスミドDNAの量との比率を同じに保つ。</li>
	<li>溶液AとBをいずれかのチューブに加えて穏やかに混合し、室温(溶液C)で1分間インキュベートします。</li>
	<li>ソリューション C を培地に追加します。37°Cで24時間培養した。</li>
</ol>3. 細胞のリシスと中程度の交換
<ol><li>日常的な顕微鏡を使用してGFP表現を確認します。</li>
	<li>皿の中の媒体を取り除きます。</li>
	<li>25°Cで2mLのPBSを加え、培地を洗い流します。PBS を取り出します。</li>
	<li>砕いた氷の上にアルミニウム板の上に皿を置きます。 注:私たちは、日曜日のツールストアまたは市販の1つの実験室機器としてカット1ミリメートル厚いアルミニウム板を使用しています。</li>
	<li>4°Cで200μLのリシスバッファーを加えます。 皿の底にバッファーが均等に分配されるように、皿を穏やかに振ります。</li>
	<li>セルスクレーパーを使用して皿を削り、新しい1.5 mLチューブに未溶解細胞の破片で溶解物を回収します。</li>
	<li>4°Cで5分間20,400 x g で溶液を遠心分離する。</li>
	<li>新しい1.5 mLチューブに上清を回収し、4°Cまたは氷上に保管してください。 注:ライセートを凍結しないでください。</li>
	<li>ライブセル測定の場合は、測定前に培地を交換してください。位相コントラスト顕微鏡を使用して細胞の取り付けを確認します。蛍光顕微鏡で発現を確認します。</li>
</ol>4. 蛍光相関分光法(FCS)キャリブレーション
<ol><li>システムを起動し、操作ソフトウェアを実行します。アルゴン+ レーザー(458/477/488/514 nm)をオンにします。少なくとも30分間システムを安定させます。</li>
	<li>光路を設定する:メインビームスプリッター:HFT488;ディクロイックミラー:NFT600;蛍光バリアフィルター:バンドパスフィルタ505-540(BP505-540);検出器:雪崩フォトダイオード(APD)。</li>
	<li>値を直接入力してピンホールサイズを設定します(66 μm;1風通しのユニット)。</li>
	<li>ローダミン6G(Rh6G)溶液をステージ上のカバーガラスチャンバーの井戸に加えます。</li>
	<li>目的に浸漬超純水を追加します。浸漬油は使用しないでください。</li>
	<li>顕微鏡のステージにチャンバーをセットします。ステージを適切な位置に移動します。</li>
	<li>ガラス表面からの散乱光を測定することで、ガラス上面に焦点を当てます。対物レンズを底面に下げた後、フォーカスノブを時計回りに回して調整します。 注意:フォーカスノブの旋回方向は日本とドイツの間で反対なので確認してください。</li>
	<li>焦点を上げて上ガラス表面の上に200μm上げて、溶液の内部を観察します。</li>
	<li>[カウント] レートをクリックし、フォトン数を監視します。</li>
	<li>徐々にカウント率値が10 kHz以上になるようにアクースト視チューナブルフィルタ(AOTF)値(例えば、励起レーザー伝送)を増加させます。</li>
	<li>[ピンホール調整]をクリックし、ピンホール調整ウィザードを開きます。x 軸と y 軸の両方で、フォトンの最大数 (ピーク) を持つピンホール位置を見つけます。</li>
	<li>対物レンズの補正リングを、分子あたりの数(CPM)値が最も高くなるようにします。 注:ここで指定したチャンバのカバーガラスの厚さは0.12-0.17ミリメートルであるため、補正リングは、CPMが最大である、その最小値またはそれからほんの数ターンの周りにあります。</li>
	<li>AOTF 値を徐々に小さくして、CPM 値が 2 ~ 3 kHz になるようにします。</li>
	<li>90 s の Rh6G の自己相関関数 (ACF) を取得します。</li>
	<li>計測が完了したら、[ フィット ]をクリックしてカーブフィッティング解析を実行します。</li>
	<li>トリプレット状態の 1 成分 3 次元 (3D) 拡散のモデルを選択します。 注: Rh6G は単分散型であり、1 成分拡散はトリプレット状態です。</li>
	<li>赤い線を動かしてフィッティング開始時間を設定します。[ すべてフィット] をクリックし、適合偏差を確認します。カーブフィッティングを行った後、拡散時間(DT)と構造パラメータ(SP)がそれぞれ20〜30μsと4-8の範囲であることを確認します。</li>
	<li>構造パラメータ値を覚えておいてください。同じ日に測定されたすべてのAMFのカーブフィッティング分析に、同じ光学条件下で、顕微鏡ステージにセットされた同じタイプのガラスベースディッシュまたはチャンバーカバーガラスを使用して、SP値を使用します。</li>
</ol>5. 細胞のリセートのFCSの測定
<ol><li>細胞のライセートを準備します(上記参照)。</li>
	<li>カバーガラスチャンバーにライセートを置きます。乾燥を避けるために蓋をし、薄いシェーディング用のステージふたを置きます。</li>
	<li>取得条件、レーザーパワー、測定時間、繰り返しを設定します。</li>
	<li>[カウント]をクリックし、レーザーの AOTF 値を調整して、CPM 値が 1 kHz を超える値になるようにします。</li>
	<li>1分間の試験測定を行います。計算された ACF が正の振幅と滑らかな減衰を示しているかどうかを確認します。</li>
	<li>5分間の主な測定を行います。 メモ:測定時間が増えてもACFの形状が変わらないまで、合計測定時間は徐々に増加します。</li>
	<li>カーブ フィット解析を実行するには、[フィット]をクリックします。</li>
	<li>トリプレット状態の 2 成分 3D 拡散のモデルを選択します。SP値を入力し、設定を「すべて調整」をクリックする前に「Free」ではなく「固定」に変更することを忘れないでください。</li>
	<li>適合テーブルをタブ区切りテキストファイルとしてエクスポートします。</li>
	<li>必要に応じて、ACF および Count レート レコードをタブ区切りのテキスト ファイルとしてエクスポートします。</li>
</ol>6. 生細胞におけるFCS測定
<ol><li>測定前に、新鮮な媒体に交換してください。</li>
	<li>ヒートステージインキュベーターを使用します。顕微鏡ステージに細胞培養皿をセットします。</li>
	<li>共焦点マイクロペを使用して焦点と位置を確認します。測定セルを選択します。セルの位置を拡大して調整します。低速走査速度モードを使用して、GFP発現セルの蛍光画像を取得します。</li>
	<li>「FCS」セクションの位置を使用してFCS測定 位置 を選択します。</li>
	<li>十字線を使用して少なくとも 1 つの FCS 測定ポイントを選択します (図 1)。</li>
	<li>ACFを1分間測定します。 注:蛍光タンパク質は、溶液に比べて動きが遅いため、生細胞で光漂白される傾向があるため、測定時間は最小限に抑える必要があります。長時間の測定は蛍光タンパク質の光化につながるため、一般に、溶液測定と同じくらいスムーズに細胞内のACFを得ることは困難です。</li>
	<li>[ フィット] をクリックして、トリプレット状態の 2 成分 3D 拡散のモデルを使用してカーブ フィット解析を実行します。 注: ライブセルの測定では、1成分3D拡散モデルでは、生細胞にさまざまな移動成分が存在するため、カイ二乗値を減少させることが経験的に困難であるため、三重項状態の2成分3D拡散のモデルの方が良いでしょう。しかし、3成分3D拡散のモデルを使用しても、拡散成分は通常、2成分のモデルを使用する場合と比較して分離されません。</li>
</ol>

<ol><li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation and neurodegenerative disease.</a> Nature Medicine. 10, Suppl 10-17 (2004).</li>
<li>Hipp, M. S., Kasturi, P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+proteostasis+network+and+its+decline+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The proteostasis network and its decline in ageing.</a> Nature Review Molecular Cell Biology. 20 (7), 421-435 (2019).</li>
<li>Kitamura, A., Nagata, K., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+analysis+of+misfolded+protein+aggregation+by+FRET+and+live-cell+imaging+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">Conformational analysis of misfolded protein aggregation by FRET and live-cell imaging techniques.</a> International Journal of Molecular Science. 16 (3), 6076-6092 (2015).</li>
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<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+RNA+with+a+C-terminal+fragment+of+the+amyotrophic+lateral+sclerosis-associated+TDP43+reduces+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interaction of RNA with a C-terminal fragment of the amyotrophic lateral sclerosis-associated TDP43 reduces cytotoxicity.</a> Scientific Reports. 6, 19230(2016).</li>
<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+the+proteasome+increases+the+toxicity+of+ALS-linked+mutant+SOD1%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of the proteasome increases the toxicity of ALS-linked mutant SOD1.</a> Genes to Cells. 19 (3), 209-224 (2014).</li>
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<li>Kitamura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+chaperonin+prevents+polyglutamine+toxicity+with+altering+the+aggregation+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytosolic chaperonin prevents polyglutamine toxicity with altering the aggregation state.</a> Nature Cell Biology. 8 (10), 1163-1170 (2006).</li>
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<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+steps+for+fluorescence+correlation+spectroscopy+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">First steps for fluorescence correlation spectroscopy of living cells.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (10), 1185-1189 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Fluorescence correlation spectroscopy example: shift of autocorrelation curve. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1267-1269 (2011).</li>
<li>Kinjo, M., Sakata, H., Mikuni, S. Basic fluorescence correlation spectroscopy setup and measurement. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKinjo%2C+M+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22">Cold Spring Harbor Protocols</a>. 2011 (10), 1262-1266 (2011).</li>
<li>Jazani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+alternative+framework+for+fluorescence+correlation+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">An alternative framework for fluorescence correlation spectroscopy.</a> Nature Communication. 10 (1), 3662(2019).</li>
<li>Pack, C., Saito, K., Tamura, M., Kinjo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microenvironment+and+effect+of+energy+depletion+in+the+nucleus+analyzed+by+mobility+of+multiple+oligomeric+EGFPs%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Microenvironment and effect of energy depletion in the nucleus analyzed by mobility of multiple oligomeric EGFPs.</a> Biophysical Journal. 91 (10), 3921-3936 (2006).</li>
<li>Ries, J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+membrane+dynamics+with+line-scan+FCS%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of membrane dynamics with line-scan FCS.</a> Biophysical Journal. 96 (5), 1999-2008 (2009).</li>
<li>Fujioka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+separation+organizes+the+site+of+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phase separation organizes the site of autophagosome formation.</a> Nature. 578 (7794), 301-305 (2020).</li>
<li>Sadaie, W., Harada, Y., Matsuda, M., Aoki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+in+vivo+fluorescence+cross-correlation+analyses+highlight+the+importance+of+competitive+effects+in+the+regulation+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitative in vivo fluorescence cross-correlation analyses highlight the importance of competitive effects in the regulation of protein-protein interactions.</a> Molecular and Cellular Biology. 34 (17), 3272-3290 (2014).</li>
<li>Cohen, L. D., Boulos, A., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-fluorescent+HaloTag+blocker+for+improved+measurement+and+visualization+of+protein+synthesis+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">A non-fluorescent HaloTag blocker for improved measurement and visualization of protein synthesis in living cells.</a> F1000Research. 9, (2020).</li>
</ol>

これらの著者には利益相反はありません。

測定前のシステム校正に関しては、サンプルを測定するために使用されたものと同じガラス製品を使用する必要があります(例えば、8ウェルは、細胞のライセートのためのガラスチャンバーと生細胞用の35mmガラスベースディッシュをカバーする)。ガラス上のRh6Gの吸着のために、その有効濃度が低下することがあります。その場合は、1 μMのような高濃度のRh6G溶液をピンホール調整のためだけに使用する必要があります。非常に高い光子数率は、検出器を保護するために避ける必要があります(例えば、1000 kHz以上)。また、濃縮溶液は自己相関関数の獲得には適さない(100kHz未満を維持する)。ピンホール位置のキャリブレーションは重要です。光学系が頻繁に使用される場合、ピンホールの劇的な脱臼はまれです。したがって、最初に「ファイン」を使用することは、多くの場合、適切な位置を見つけるのに問題ありません。「ファイン」を使用してカウント率のピーク位置が見つからない場合は、「粗い」を使用して、動きの範囲の一方の端から「ファイン」を使用して位置を見つける前にピンホールを移動します。ACFの振幅が平坦であった場合は、焦点と位置が適切かどうかを確認してください。
<...

筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病などの神経変性疾患を含むタンパク質凝集は毒性 が知られており、細胞や臓器のタンパク質恒常性(プロテオスタシス)を乱し、その後老化につながる可能性がある。タンパク質凝集のクリアランスは、治療戦略として期待されています;しかし、タンパク質の凝集を防ぎ、タンパク質凝集体(例えば、小分子や薬物)を分解する化学物質はまだ確立されていません。さらに、タンパク質凝集が毒性を発揮する方法は、依然として不可解です。したがって、タンパク質凝集に関する研究プロジェクトを推進するためには、単にタンパク質凝集を検出する高スループット手順を導入することが重要です。タンパク質凝集および凝集特異的蛍光色素の立体構造を認識する抗体を用いたタンパク質凝集検出は広く用いられている3。しかし、このような古典的な手順を用いた生細胞において特に、凝集を検出することは困難である。 
フェルスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、タンパク質凝集および構造変化を検出する手順である。しかし、FRETはタンパク質のダイナミクス(例えば、生細胞におけるタンパク質の拡散およびオリゴマー化)を分析することができない3。そこで、ここでは、単一分子感度4で蛍光分子の拡散特性と明るさを測定する蛍光相関分光法(FCS)を用いて、溶液中のタンパク質凝集(例えば、細胞溶解物)および生細胞を検出する簡単なプロトコルを紹介する。FCSは、レーザースキャン共焦点顕微鏡(LSM)を用いた光子計法である。高感度光子検出器と光子到着時間の自己相関関数(ACF)の計算を用いて、検出体積中の蛍光分子の通過時間と明るさが測定される。拡散は分子量の増加と共に遅くなる。従って、FCSを用いて分子間相互作用を推定することができる。さらに強力に、蛍光分子の明るさの増加は、分子のホモオリゴマー化を示す。したがって、FCSは、このようなタンパク質凝集を検出するための強力なツールである。

<table><tbody><tr><td>0.25%(w / v)トリプシン-1 mmol / L EDTA&middot;フェノールレッド(トリプシン-EDTA)配合4Na溶液富士</td><td>フイルム和光純薬(株)</td><td>201-16945</td><td></td></tr><tr><td>100 mm プラスチック皿</td><td>CORNING</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>35 mm ガラスベース皿</td><td>岩城</td><td>3910-035</td><td>生細胞測定用</td></tr><tr><td>35 mm プラスチック皿</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>150460</td><td></td></tr><tr><td>アルミプレート</td><td>Bio-Bik</td><td>AB-TC1</td><td></td></tr><tr><td>C-アポクロマート 40x/1.2NA Korr.UV-VIS-IR M27</td><td>カールツァイス</td><td></td><td>対物</td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>住友ベークライト(株)</td><td>MS-93100</td><td></td></tr><tr><td>酢酸セルロースフィルターメンブレン (0.22 mm)</td><td>アドバンテック トーヨー</td><td>25CS020AS</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラスチャンバー 8ウェル</td><td>岩城</td><td>5232-008</td><td>溶液測定用</td></tr><tr><td>ダルベッコ修正イーグルス培地 (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5796</td><td>基礎培地</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>バイオセラ</td><td></td><td>ロットチェックが必要</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>LSM510 META + ConfoCor3</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td>FCS system</td></tr><tr><td>マウス神経芽腫 Neuro2a 細胞</td><td>ATCC</td><td>CCL-131</td><td>細胞株</td></tr><tr><td>Opti-MEM I</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>pCAGGS</td><td>理研</td><td>RDB08938</td><td>トランスフェクションキャリア用プラスミドDNA</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液(&times;100 )</td><td>富士フイルム和光純薬(株)</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>モノ</td><td></td><td></td><td>マーeGFPでタグ付けされたTDP25用プラスミドDNA</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1</td><td></td><td></td><td>eGFPモノマー発現用プラスミドDNA</td></tr><tr><td>pmeGFP-N1-SOD1-G85R</td><td></td><td></td><td>モノマーeGFPプロテアーゼ阻害剤カクテルでタグ付けされたSOD1のALSリンクG85R変異体用プラスミドDNA</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8304</td><td></td></tr></tbody></table>

蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出

Detection of Protein Aggregation using Fluorescence Correlation Spectroscopy

タンパク質凝集は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)などの神経変性疾患の特徴である。可溶性または拡散性タンパク質オリゴマーまたは凝集体を検出および分析するために、単一分子感度で単一粒子の拡散速度および明るさを検出できる蛍光相関分光法(FCS)が使用されている。しかし、タンパク質凝集検出のための適切な手順とノウハウは広く共有されていません。ここでは、細胞ライセートおよび生細胞における凝集しやすいタンパク質の拡散特性に関するFCS測定の標準的な手順を示す:ALS関連25 kDaカルボキシル末端断片のTAR DNA/RNA結合タンパク質43kDa(TDP25)およびスーパーオキシドジスムターゼ1(SOD1)を示す。代表的な結果は、緑色蛍光タンパク質(GFP)タグ付きTDP25の凝集物の一部が、マウス神経芽細胞腫Neuro2a細胞溶解物の可溶性画分にわずかに含まれていたことを示している。さらに、ALS関連変異を運ぶGFPタグ付きSOD1は、生細胞における拡散が遅い。そこで、FCSを用いた拡散特性を介してタンパク質凝集を検出する手順を紹介します。

細胞ライセートとSOD1-G85R-GFPのFCS測定を生細胞で行いました。どちらの場合も、正の振幅と滑らかなADFを獲得することができました。Neuro2a細胞で発現したGFP-TDP25の一部が、示された条件6の下で可溶性分率で回収されたことを示した。細胞溶解液の可溶性分率では、FCSを用いた光子カウント率記録において極めて明るい蛍光分子が検出された(図2A、上、矢印)。このような「スパイク(バーストとも呼ばれる)」は、GFPモノマーおよび単分散化学蛍光色素溶液では認められず、スパイクがオリゴマータンパク質9を示していることを示唆している。三重項状態の2成分3D拡散を想定したモデルを用いた曲線フィッティング解析は、高速拡散分子(DTFast = 186 μs)が〜90%、残りの10%が2.3ms(図2A、底部、表 2)であることを示した。
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ここでは、蛍光相関分光法を用いて、細胞ライセートおよび生細胞におけるタンパク質オリゴマーおよび凝集を測定する手順を紹介する。

Protein aggregation is a hallmark of neurodegenerative disorders such as amyotrophic lateral sclerosis (ALS), Alzheimer's disease (AD), Parkinson's ...

蛍光相関分光法の最良の原理であるFCSは、1970年代に最初に発明されました。1990年代には、共焦点装置顕微鏡と組み合わせることで、FCSの重要かつ多くの改良が確立されました。それ以来、FCSは、分子相互作用やタンパク質凝集解析など、多くの化学・ウイルス治療用途に使用されてきました。タンパク質凝集は神経変性疾患の特徴である。蛍光輝度は、拡散特性によって説明される分子サイズの作用における単一粒子である。タンパク質凝集を測定する際には、分子の予測ライフサイクルを決定できるだけでなく、ホモまたはヘテロ重合も区別できるため、非常に重要です。ここでは、細胞ライセートおよび生細胞におけるFCSを用いた凝集型タンパク質に関連する筋萎縮性側索硬化症の拡散を測定する手順を紹介する。正常な成長媒体の中で快適に坐っているNeuro2a細胞を成長する100ミリメートルプラスチック皿を準備する。細胞の合流を確認します。メディアを取り外します。3.5ミリリットルのトリプシンEDTA溶液を3番目のカートリッジ皿に加え、摂氏37度で1分間インキュベートします。9.5ミリリットルの正常成長培地を皿に加え、それらを中断します。細胞懸濁液をトリパンブルーと混合して死細胞を染色する。セルカウントスライドにサスペンションを追加します。セル カウンタを使用するか、手動でセルの数をカウントします。ライブセル番号とその生存率を確認してください。1ミリリットル当たり5の電力に1.0倍10倍にカウントされた媒体で細胞を希釈します。生細胞測定用の細胞リシスまたは成長空間皿用の35ミリメートルプラスチック皿に2ミリリットルの細胞懸濁液を加えます。1日摂氏37度でインキュベートします。翌日、プラスミドDNAとトランスフェクション試薬の混合物を調製する。細胞数培地にトランスフェクション混合物を加え、細胞を24時間インキュベートします。一日後。日常的な顕微鏡を使用してGFP表現を確認します。あなたは細胞の中で非常に明るいTDP25成分体を見ることができます。細胞の分解は生化学的なベンチで行われるべきである。皿の中の媒体を取り除きます。25°CでPBSを2ミリリットル加え、培地として洗浄します。PBS を取り出します。砕いた氷の上にアルミニウム板の上に皿を置きます。すぐに、200マイクロリットルのライシスバッファーを皿に加えます。セルスクレーパーを使用して皿を削ります。新しい1.5ミリメートルチューブの未溶解細胞デブリで溶解物を回収します。摂氏4度でリセートを遠心分離します。ライブセル測定の場合は、測定前に新しい測定に培地を交換してください。位相コントラスト顕微鏡を使用して細胞の取り付けを確認します。また、蛍光顕微鏡を用いてGFPの発現を確認してください。共焦点顕微鏡結合FCSシステムを使用します。488ナノメートルのレーザーをオンにします。少なくとも30分間システムを安定させます。光パスを設定します。488ナノメートルのレーザーをインスタントライトに使用します。適切なビームスプリッターと二色性計を使用してください。また、蛍光フューザー。通常、キャリブレーションと溶液測定にはカバーグラスチャンバーを使用します。慎重に、カバーガラスチャンバーを取ります。ガラス表面をレンズのスクリーニング用紙に置きます。FCSキャリブレーションを流します。同様にロダミン6G溶液を追加します。目的に超純水を追加します。油は使用しないでください。顕微鏡のステージにチャンバーを置きます。ステージを適切な位置に移動します。ピンホール調整を作成し、ピンホール調整ウィザードを開きます。フォトン数の割合を、x 方向のピンホールの粗い動きとして監視します。最も明るい位置は正しく決定されました。次に、光子のカウントレートを微細な動きとして監視します。最も明るい位置は、X 方向のピンホール位置と判定されました。同様に、ピンホールの最も明るい位置で y 方向を検索します。y方向の最も明るい位置も決定されました。ピンホールの x と y の位置を合成します。毎日の測定の前にピンホールの位置を調整することをおしいです。ライブパスが変更された場合、ピンホールの位置を再調整する必要があります。カウント率を作成し、電話の数を監視します。CPM モニタリング モードに変更します。CPM 値が最高になるように、実行したオブジェクトの補正リングをカウントします。カウント率ウィンドウを閉じます。ローダミン6G溶液測定から開始します。測定が完了したら、フィットをクリックしてカーブフィッティング解析を実行します。古い相関関数の適合のためのモデルを選択します。ローダミン6Gの場合、トリプレット状態の1成分3次元拡散のモデルを選択します。赤い線を動かしてフィッティング開始時間を設定します。[すべてフィット]をクリックして、継ぎ手計算を開始します。適合偏差を確認します。側面がゼロの周りに、転記され、負であることを確認します。適合値を確認します。拡散時間が20~30マイクロ秒の範囲であることを確認します。さらに、構造パラメータは4から8までである。フィットパネルを開き、測定するモデルを選択します。適合パネルで、サンプルのモデルに同じ構造パラメータ値を入力します。型が固定型に設定されていることを確認します。細胞のライセートのGFP-TDP25測定。リセートをカバーグラスチャンバーに入れます。蓋をして、ライセートの乾燥を避けます。薄いシェーディングのステージのふたを置きます。取得パネルで、レーザーパワー、測定時間、および繰り返しを設定します。取得を開始します。スパイクが観察された。スパイクが再び観察された。スパイクは、検出体を通過した明るい分子を示しています。スパイクは可溶性オリゴマーまたは凝集体を示す。カーブ フィット解析を実行するためのフィットを作成します。トリプレット状態の 2 成分、3 次元拡散のモデルを選択します。フィッティング開始時刻を設定します。[すべてフィット]をクリックします。適合値を確認します。SOD1-G85Rは、ライブセル内のGFP測定でタグ付けされています。溶液測定とは異なり、ヒートステージインキュベーターを使用することをお勧めします。顕微鏡ステージに細胞培養皿をセットします。眼を使用してフォーカスと位置を確認します。測定セルを選択します。高速スキャンモードを使用して、セルの位置を拡大して調整します。低速スキャン速度モードを使用してセルのスナップショットを取得します。位置ツールを使用して、FCS測定位置を選択します。十字線は測定位置を示します。測定を開始します。光子数の割合記録のわずかな減少は、GFPの光の切り落としを示唆しています。カーブのフィッティングを実行します。細胞ライセートにおけるGFP-TDP25の代表結果が示される。トップグラフは、フォトン数の記録を示しています。矢印があるところにはスパイクがあり、可溶性オリゴマーと凝集体が示唆されています。中央のグラフは、古い相関関数を表します。灰色の線は低い、古い相関関数を示しています。マゼンタラインは適合関数を示します。点線は、フィッティングの開始時間と終了時間を示します。下の表は適合値を示しています。次に、生細胞におけるSOD1-G85R-GFPの代表結果を示す。上のグラフは、フォトン数の記録を表します。記録された光子数の減少率が徐々に観察され、異なる測定のためのGFP成長の光化が示唆された。これは、生細胞の拡散速度が遅いためです。中央のグラフは、SOD1の古い相関関数を表します。灰色の線は低い、古い相関関数を示しています。マゼンタラインは適合関数を示す。点線は、フィッティングを使用した開始時間と終了時間を示します。下の表は適合値を示しています。ここでは、細胞ライセートにおけるTDP-25関連するすべての細胞からの拡散を測定し、FCSを使用して生細胞内のSOD1の全変異体を測定するこの手順を示します。細胞溶解物中の可溶性オリゴマーおよび凝集は、スパイクまたはバーストとしてしばしば観察することができる。一方、生細胞では、おそらく明白な生きている構造を除いて、そのようなスパイクはほとんど観察されない。ゆっくりと拡散する種の変異体SOD1は、SOD1ホモ重合などの単一粒子の明るさを意味します。ここに示す手順はシンプルで価値があります。FCS には放射線がなく、直接休止状態です。それはちょうどあなたと私たちの想像力の共感です。

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生物学

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生細胞中のタンパク質凝集の4Dイメージング

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フローサイトメトリーによる生体内におけるタンパク質自己集合体の検出と特性特性

赤外線ナノ分光法と高分解能原子間近顕微鏡の応用を用いて、タンパク質自己組織化のプロセスをオリゴメラ凝集体とアミロイド線維に可視化し、発症と発達に密接に関連している。ヒト神経変性疾患の広い範囲の。...

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時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する

我々は、現代の蛍光標識技術を用いて生細胞における膜受容体ダイナミクスを研究するために、フェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)と組み合わせた生細胞二重色蛍光相互相関分光(FCCS)を行う実験プロトコルとデータ分析ワークフローを提示する。...

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示差走査蛍光法によるCD40タンパク質-ウンベリフェロン相互作用の検出

学ぶ蛍光相関分光法によるタンパク質凝集検出法。ALS関連TDP25や変異SOD1の拡散特性と凝集状態を解析し、神経変性疾患の病態解明に貢献する標準化プロトコルを提供します。

蛍光相関分光法を用いたタンパク質凝集の検出

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