MALDI-TOF-TOF-MS/MSとトップダウンプロテオミクス解析を用いた 、大腸菌 における抗菌性免疫タンパク質の同定

このプロトコルは、抗生物質誘導および質量分析を用いて細菌タンパク質を同定するための迅速な方法を示す。この技術の主な利点は、スピードとシンプルさです。サンプル調製は複雑ではありません。

この技術は、細菌感染に対する適切な治療をより良く知らせるために、病原性因子や抗生物質耐性などの病原性細菌の特性評価に拡張することができる。まず、LB寒天プレートで成長した単一コロニーから細菌を収穫するために無菌1マイクロリットルループを使用してください。300マイクロリットルのHPLCグレードの水を含む2ミリリットルOリングリングラインスクリューキャップマイクロ遠心分離チューブに移します。

次に、チューブとペレットを遠心分離によって細胞を短時間ボルテックスし、ステンレス鋼MALDIターゲット上のサンプル上清の0.75マイクロリットルの残膜水で、乾燥させる。乾燥したサンプルスポットを、33%アセトニトリル、67%水、0.2%トリフルオロ酢酸で調製したシナピエン酸の飽和溶液の0.75マイクロリットルでオーバーレイし、その点を乾燥させます。スポットを乾燥させたら、質量分析計にターゲットをロードします。

取得ソフトウェアを開き、[MS リニア モード取得] または [一括充電範囲] をクリックし、下限と上限の質量対充電をそれぞれのフィールドに入力します。MALDI ターゲット テンプレートで分析するサンプル スポットをクリックします。次に、マウスの左ボタンを押し下げ、サンプルスポット上にカーソルをドラッグして、レーザーアブレーションまたはイオン化のためにサンプリングする矩形領域を指定します。

マウスボタンを放して取得を開始し、サンプルスポットごとに1000本のレーザーショットを収集します。イオンが検出されない場合は、タンパク質イオンシグナルが検出されるまでレーザー強度の下でスライドスケールバーを調整してレーザー強度を増加させます。MS リニア モード取得が完了したら、MS/MS 反射モード取得をクリックします。

解析する前駆体質量を前駆体質量フィールドに入力します。次に、前駆体質量の低質量側と高質量側の「前駆体質量」ウィンドウに、ダルトンの分離幅を入力します。[CID オフ] ボタンをクリックします。

次に、[メタスタブル サプレッサーオン]ボタンをクリックします。スライドスケールバーを調整して、レーザ強度を最大値の 90% 以上に調整します。MALDIターゲットテンプレートで分析するサンプルスポットをクリックし、マウスの左ボタンを押下し、サンプルスポット上にカーソルをドラッグしてレーザーアブレーションまたはイオン化のためにサンプリングする矩形領域を指定し、マウスボタンを放して取得を開始し、各サンプルスポットに対して10,000本のレーザーショットを収集します。

プロテインバイオマーカー Seeker 実行可能ファイルをダブルクリックすると、グラフィカルユーザーインターフェースウィンドウが表示されます。「成熟タンパク質量」フィールドにタンパク質バイオマーカーの質量を入力し、質量トレランスフィールドに質量測定誤差を入力します。必要に応じて、無料のb / yイオンタンパク質量計算ボタンをクリックして、推定された無料のフラグメントイオンペアからタンパク質量を計算すると、タンパク質量計算ツールのポップアップウィンドウが表示されます。

推定された無料のフラグメントイオンペアの質量と充電の比率を入力し、[ペアを追加]ボタンをクリックすると、電卓タンパク質量が表示されます。[成熟したタンパク質量]フィールドにこの値をコピーして貼り付け、[タンパク質量計算]ツールウィンドウを閉じます。[残留の制限を設定]ボックスをクリックします。

エンド・シグナル・ペプチド長を選択すると、スライドスケールとカーソルを持つポップアップが現れ、カーソルを希望するシグナル・ペプチド長に移動します。シグナルペプチド長が選択されていない場合、無制限のシーケンス切り捨てがソフトウェアによって実行されます。フラグメントイオン条件の下で、1つ以上の残基、D-E-N、および/またはP.のボックスをクリックしてポリペプチドバックボーン切断の残基を選択し、フラグメントイオンプラス1を入力して検索ボタンをクリックすると、ポップアップフラグメントページが表示されます。

次にフラグメントイオンの追加ボタンをクリックすると、入力するフラグメントイオンごとにドロップダウンフィールドが表示されます。フラグメントイオンの電荷比と関連する質量を、電荷許容差で質量を入力します。次に、[保存して閉じる] ボタンをクリックします。

「一致する必要があるフラグメントイオンの数」の右側のボックスで、スクロールして、識別のために一致させる必要があるフラグメントイオンの最小数を選択し、酸化状態のシステイン残基を選択します。検索後にタンパク質が同定されない場合は、システインを減少させた状態で検索を繰り返します。ファイル設定で、[FASTA ファイルの選択] アイコンをクリックして、以前に構築した細菌株のインシリコタンパク質配列を含む FASTA ファイルを参照して選択します。

次に、出力フォルダーを選択し、出力ファイル名を作成します。[ファイル エントリで検索を実行]アイコンをクリックします。検索が開始される前に検索パラメータを表示する「検索パラメータの確認」というポップアップウィンドウが表示されます。

検索パラメータが正しい場合は、[検索の開始] をクリックします。パラメータが正しくない場合は、[キャンセル]をクリックして、正しいパラメータを再入力します。検索が開始されると、パラメータウィンドウが閉じ、新しいポップアップウィンドウが表示され、検索の進行状況と見つかった識別数の集計が表示されます。

検索が完了すると、プログレスバーが自動的に閉じられ、検索の概要が、検出されたタンパク質の識別情報を表示する新しいポップアップウィンドウと共に、グラフィカルユーザーインターフェースのログフィールドに表示されます。現在の研究では、細菌培養物は、2つの異なる濃度のマイトマイシンCを有するLBで増殖した。菌培養物の質量スペクトルは、マイトマイシン-C濃度で増殖した。

コールドショックタンパク質C、コールドショックタンパク質E、および機能不明のプラスミド媒介タンパク質が同定された。9780で未知のタンパク質イオンをMS/MSで分析し、前駆イオンを約100ダルトンのタイムイオン選択窓で単離した。質量で9675.9を電荷するフラグメントイオンは、9655でのメタスタブルタンパク質イオンの解離から波及する。

コリシンE3の免疫タンパク質の配列は、イオン化の可能な部位の基本的な残基を含む。ポリペプチド骨格切断から検出されたフラグメントイオンを、システインの還元形態を探索中に使用した場合。N末端メチオニンは、翻訳後の変更として除去されます。

細菌培養を高いマイトマイシン-C濃度で増殖させた場合、バクテリオシンの免疫タンパク質が同定された。9651の未知のピークをMS/MSで分析し、前駆体イオンはマイナス75プラス60ダルトンのより狭く非対称的なTISウィンドウで単離された。バクテリオシンの免疫タンパク質の配列には、イオン化の可能な部位の塩基残基が含まれています。

ポリペプチド骨格切断から検出されたフラグメントイオンを、システインの還元形態を探索中に使用した場合。抗生物質の異なる濃度で, 相対的なタンパク質の豊富さは異なる場合があります。.そして、これらは質量分析を用いて分析した。

細菌細胞を収穫する場合は、抗生物質や濃度に関してコロニーの形態と細菌の増殖を観察する。タンパク質を検出するには、1マイクロリットルの細胞ループが必要です。