Name: 固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぶ固体支持膜電気生理学を用いたナノボディスクリーニング法。電気性トランスポーターの阻害・非阻害ナノボディを高スループットで同定し、IC50値を決定できます。ラベルフリーで大規模ライブラリーのスクリーニングが可能です。

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チューリッヒ大学医学微生物学研究所のセドリック・A・J・ハッターとマルクス・A・シーガー、バーゼル大学バイオゼントルムのゴンサロ・セブレロに対し、合成ナノボディ(シボディ)の生成に協力していただきありがとうございます。ナニオン・テクノロジーズのマリア・バルトメスとアンドレ・バッツォーネの技術支援に感謝します。この研究は、スイス国立科学財団(SNSF)(PP00P3_170607とナニオン研究助成イニシアチブからC.P.)によって支援されました。

<ol><li>Braden, B. C., Goldman, E. R., Mariuzza, R. A., Poljak, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+an+antibody+molecule%3A+structure%2C+kinetics%2C+thermodynamics%2C+and+mutational+studies+of+the+antilysozyme+antibody+D1.3%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Anatomy an antibody molecule: structure, kinetics, thermodynamics, and mutational studies of the antilysozyme antibody D1.3.</a> Immunology Reviews. 163, 45-57 (1998).</li>
<li>Hamers-Casterman, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+antibodies+devoid+of+light+chains%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring antibodies devoid of light chains.</a> Nature. 363, 446-448 (1993).</li>
<li>Perez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+inhibition+of+lipid-linked+oligosaccharide+flippase+PglK+by+a+conformational+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of inhibition of lipid-linked oligosaccharide flippase PglK by a conformational nanobody.</a> Science Reports. 7, 46641(2017).</li>
<li>Grahl, A., Abiko, L. A., Isogai, S., Sharpe, T., Grzesiek, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+description+of+beta1-adrenergic+receptor+functional+dynamics+and+allosteric+coupling+from+backbone+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">A high-resolution description of beta1-adrenergic receptor functional dynamics and allosteric coupling from backbone NMR.</a> Nature Communication. 11, 2216(2020).</li>
<li>Schenck, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+anti-VGLUT+nanobodies+acting+as+inhibitors+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport.</a> Biochemistry. 56, 3962-3971 (2017).</li>
<li>Mireku, S. A., Sauer, M. M., Glockshuber, R., Locher, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+nanobody-mediated+blocking+of+BtuF%2C+the+cognate+substrate-binding+protein+of+the+Escherichia+coli+vitamin+B12+transporter+BtuCD%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Reports%22%5BJournal%5D)">Structural basis of nanobody-mediated blocking of BtuF, the cognate substrate-binding protein of the Escherichia coli vitamin B12 transporter BtuCD.</a> Science Reports. 7, 14296(2017).</li>
<li>Manglik, A., Kobilka, B. K., Steyaert, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+to+study+G+protein-coupled+receptor+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Pharmacology+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Nanobodies to study G protein-coupled receptor structure and function.</a> Annual Reviews of Pharmacology Toxicology. 57, 19-37 (2017).</li>
<li>Rasmussen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+nanobody-stabilized+active+state+of+the+beta%282%29+adrenoceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of a nanobody-stabilized active state of the beta(2) adrenoceptor.</a> Nature. 469 (2), 175-180 (2011).</li>
<li>Jiang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+LacY-nanobody+complex+in+a+periplasmic-open+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a LacY-nanobody complex in a periplasmic-open conformation.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 113, 12420-12425 (2016).</li>
<li>Geertsma, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+prokaryotic+fumarate+transporter+reveals+the+architecture+of+the+SLC26+family%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structure of a prokaryotic fumarate transporter reveals the architecture of the SLC26 family.</a> Nature Structural Molecular Biology. 22, 803-808 (2015).</li>
<li>Harmsen, M. M., De Haard, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+production%2C+and+applications+of+camelid+single-domain+antibody+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Properties, production, and applications of camelid single-domain antibody fragments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 77, 13-22 (2007).</li>
<li>Pardon, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+protocol+for+the+generation+of+nanobodies+for+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A general protocol for the generation of nanobodies for structural biology.</a> Nature Protocols. 9, 674-693 (2014).</li>
<li>Nguyen, V. K., Desmyter, A., Muyldermans, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+heavy-chain+antibodies+in+Camelidae%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Functional heavy-chain antibodies in Camelidae.</a> Advances in Immunology. 79, 261-296 (2001).</li>
<li>Zimmermann, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+single+domain+antibodies+for+the+conformational+trapping+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins.</a> Elife. 7, 34317(2018).</li>
<li>McMahon, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+surface+display+platform+for+rapid+discovery+of+conformationally+selective+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Yeast surface display platform for rapid discovery of conformationally selective nanobodies.</a> Nature Structural Molecular Biology. 25, 289-296 (2018).</li>
<li>Olichon, A., de Marco, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+naive+library+of+camelid+single+domain+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of a naive library of camelid single domain antibodies.</a> Methods in Molecular Biology. 911, 65-78 (2012).</li>
<li>Moutel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NaLi-H1%3A+A+universal+synthetic+library+of+humanized+nanobodies+providing+highly+functional+antibodies+and+intrabodies%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NaLi-H1: A universal synthetic library of humanized nanobodies providing highly functional antibodies and intrabodies.</a> Elife. 5, 16228(2016).</li>
<li>Yan, J., Li, G., Hu, Y., Ou, W., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+synthetic+phage-displayed+nanobody+library+with+CDR3+regions+randomized+by+trinucleotide+cassettes+for+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Construction of a synthetic phage-displayed nanobody library with CDR3 regions randomized by trinucleotide cassettes for diagnostic applications.</a> Journal of Translational Medicine. 12, 343(2014).</li>
<li>Sabir, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+naive+camelids+VHH+repertoire+in+phage+display-based+library%5BTitle%5D)+AND+%22Comptes+Rendus+Biologies%22%5BJournal%5D)">Construction of naive camelids VHH repertoire in phage display-based library.</a> Comptes Rendus Biologies. 337, 244-249 (2014).</li>
<li>Yau, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+of+hapten-specific+single-domain+antibodies+from+a+non-immunized+llama+ribosome+display+library%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology+Methods%22%5BJournal%5D)">Selection of hapten-specific single-domain antibodies from a non-immunized llama ribosome display library.</a> Journal of Immunology Methods. 281, 161-175 (2003).</li>
<li>vander Linden, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physical+chemical+properties+of+llama+VHH+antibody+fragments+and+mouse+monoclonal+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Comparison of physical chemical properties of llama VHH antibody fragments and mouse monoclonal antibodies.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1431, 37-46 (1999).</li>
<li>Dumoulin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibody+fragments+with+high+conformational+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibody fragments with high conformational stability.</a> Protein Science. 11, 500-515 (2002).</li>
<li>Iezzi, M. E., Policastro, L., Werbajh, S., Podhajcer, O., Canziani, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-domain+antibodies+and+the+promise+of+modular+targeting+in+cancer+imaging+and+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-domain antibodies and the promise of modular targeting in cancer imaging and treatment.</a> Frontiers in Immunology. 9, 273(2018).</li>
<li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanobodies+derived+from+camelids+represent+versatile+biomolecules+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials+Science%22%5BJournal%5D)">Nanobodies derived from camelids represent versatile biomolecules for biomedical applications.</a> Biomaterials Science. 8, 3559-3573 (2020).</li>
<li>Jahnichen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4+nanobodies+%28VHH-based+single+variable+domains%29+potently+inhibit+chemotaxis+and+HIV-1+replication+and+mobilize+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">CXCR4 nanobodies (VHH-based single variable domains) potently inhibit chemotaxis and HIV-1 replication and mobilize stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, 20565-20570 (2010).</li>
<li>Nguyen, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+type+VI+secretion+by+an+anti-TssM+llama+nanobody%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Inhibition of type VI secretion by an anti-TssM llama nanobody.</a> PLoS One. 10, 0122187(2015).</li>
<li>Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-Based+Electrophysiology+for+Transporter+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">SSM-Based Electrophysiology for Transporter Research.</a> Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).</li>
<li>Schulz, P., Garcia-Celma, J. J., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SSM-based+electrophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">SSM-based electrophysiology.</a> Methods. 46, 97-103 (2008).</li>
<li>Barthmes, M., Liao, J., Jiang, Y., Bruggemann, A., Wahl-Schott, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+the+archaeal+transporter+NCX_Mj+using+solid+supported+membrane+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of the archaeal transporter NCX_Mj using solid supported membrane technology.</a> Journal of General Physiology. 147, 485-496 (2016).</li>
<li>Watzke, N., Diekert, K., Obrdlik, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiology+of+respiratory+chain+complexes+and+the+ADP-ATP+exchanger+in+native+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electrophysiology of respiratory chain complexes and the ADP-ATP exchanger in native mitochondrial membranes.</a> Biochemistry. 49, 10308-10318 (2010).</li>
<li>Zuber, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+charge+translocation+in+the+passive+downhill+uptake+mode+of+the+Na%2B%2FH%2B+antiporter+NhaA+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Kinetics of charge translocation in the passive downhill uptake mode of the Na+/H+ antiporter NhaA of Escherichia coli.</a> Biochim Biophys Acta. 1709, 240-250 (2005).</li>
<li>Garcia-Celma, J. J., Smirnova, I. N., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+characterization+of+LacY%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological characterization of LacY.</a> Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 106, 7373-7378 (2009).</li>
<li>Bazzone, A., Madej, M. G., Kaback, H. R., Fendler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH+regulation+of+electrogenic+sugar%2FH%2B+symport+in+MFS+sugar+permeases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">pH regulation of electrogenic sugar/H+ symport in MFS sugar permeases.</a> PLoS One. 11, 0156392(2016).</li>
<li>Williamson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-lane+mechanism+for+selective+biological+ammonium+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">A two-lane mechanism for selective biological ammonium transport.</a> Elife. 9, 57183(2020).</li>
<li>Mirandela, G. D., Tamburrino, G., Hoskisson, P. A., Zachariae, U., Javelle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+environment+determines+the+activity+of+the+Escherichia+coli+ammonium+transporter+AmtB%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">The lipid environment determines the activity of the Escherichia coli ammonium transporter AmtB.</a> FASEB Journal. 33, 1989-1999 (2019).</li>
<li>Kaplan, R. S., Pedersen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+microgram+quantities+of+protein+in+the+presence+of+milligram+levels+of+lipid+with+amido+black+10B%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Determination of microgram quantities of protein in the presence of milligram levels of lipid with amido black 10B.</a> Annals of Biochemistry. 150, 97-104 (1985).</li>
<li>Kermani, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+promiscuity+in+small+multidrug+resistance+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communication%22%5BJournal%5D)">The structural basis of promiscuity in small multidrug resistance transporters.</a> Nature Communication. 11, 6064(2020).</li>
<li>Weitz, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+a+prokaryotic+peptide+transporter+with+features+similar+to+mammalian+PEPT1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of a prokaryotic peptide transporter with features similar to mammalian PEPT1.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 2832-2839 (2007).</li>
</ol>

著者らは、競合する財政的利益を宣言しない。

ここで提示される技術は、電気原性輸送体を標的とする抑制性および非阻害性を有するナノボディを分類する。基質輸送の評価は、プロテオリポソームの膜に埋め込まれたトランスポーターを介した電荷の移動の検出に可能である。実験のセットアップ中の重要なステップのいくつかは、リポソームにおける活性タンパク質の再構成、SSMチップ上の安定した単層の調製、および結合されたナノnobody分子を除去するための洗浄プロトコルの適用後の初期状態の回復である。膜タンパク質が適切な脂質対タンパク質比で再構成されると、一般的なSSMプロトコルを天然基質を用いて確立することができる。プロテオリポソームを使用して測定した電流から差し引く必要があるノイズ電流を明らかにするために、タンパク質フリーリポソームを用いて制御実験を行うことが重要です。しかし、ノイズ電流が大きすぎる場合は、異なる脂質を使用してタンパク質の再構成を試みるか、これらの有害なシグナルを最小限に抑えるバッファ条件をスクリーニングすることをお勧めします。SSMアッセイの条件を正常に確立した後、ナノボディのスクリーニングを行うことができます。ナノボディのスクリーニングを速くするのに役立つ非常に有用なオプションは、単...

抗体は、2つの同一の重鎖と、抗原結合を担う2つの軽鎖から構成される。ラクダは、従来の抗体1,2と比較して、同結合抗原に対して類似した親和性を示す重鎖のみの抗体を有する。重鎖のみの抗体の単一可変ドメイン(VHH)は、完全な抗原結合電位を保持し、非常に安定であることが1、2であることが示されている。これらの単離されたVHH分子または「ナノボディ」は、立体構造を安定化するためのツールとして膜タンパク質生化学に関連する研究に実施されている3,4, 阻害剤として5,6, 安定化剤として7, 構造決定のためのガジェットとして8,9,10.ナノボディは、B細胞の標的特異的ナノボディおよびその後の単離をコードするB細胞の前濃縮のためのカメリッドの免疫化によって生成することができ、続いてnanobodyライブラリのクローニングとファージディスプレイ11、12、13による選択を行う。ナノボディを生成する別の方法は、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、または酵母ディスプレイ14、15、16、17、18、19、20によるライブラリおよび選択の構築に依存するインビトロ選択方法に基づく。これらのin vitro法は、大きなライブラリサイズを必要としますが、動物の免疫を回避することから利益を得て、比較的低い安定性を有するタンパク質を標的とするナノボディの選択を好む。
ナノボディの小型化は、その高い安定性および溶解性、強い抗原親和性、低い免疫原性、および比較的容易な産生を、治療21、22、23の開発のための有力な候補となる。特に、複数の膜タンパク質の活性を阻害するナノボディは、臨床応用5、24、25、26の潜在的な資産である。膜輸送体の場合、ナネnobodyが阻害活性を有するかどうかを評価するためには、輸送された基質および/または共基質の検出を可能にするアッセイを開発する必要がある。このようなアッセイは、通常、標識された分子または基質特異的検出方法の設計を伴い、普遍的な適用を欠く可能性がある。さらに、阻害性ナノボディの同定には、一般に多数の結合剤のスクリーニングが必要である。したがって、ハイスループットモードで使用でき、ラベル付き基板に依存しない方法がこの選択に不可欠です。
SSMベースの電気生理学は、膜を越えて電荷の移動(例えば、イオン結合/輸送)27、28を検出することを可能にする非常に敏感で、非常に時間分解された技術である。この技術は、これらのタンパク質の相対的低回転率に起因する他の電気生理学的手法を用いて研究することが困難である電気原性トランスポーターの特徴付けに適用されてきた29、30、31、32、33、34、35。SSM電気生理学は標識された基質の使用を必要とせず、ハイスループットスクリーニングに適しており、また、目的のトランスポーターを含むプロテオリポソームまたは膜小胞のいずれかを使用することができる。ここでは、SSMベースの電気生理学が、トランスポーター標的ナノボディを阻害性および非阻害特性で分類できることを実証する。原理の証明として、我々はリポソームに細菌コリントランスポーターの再構成を記述し、続いてSSMセンサー上のプロテオリポソームの固定化のための詳細なステップを述べています。次に、コリン輸送のSSMベースの電気生理学的測定を行う方法と、半最大有効濃度を決定する方法について説明します(EC50)。次に、SSMベースの電気生理学を用いて、複数のナノボディをスクリーニングし、コリン輸送の阻害剤を同定する方法を示す。最後に、選択した阻害性ナノボディの半最大阻害濃度(IC50)を決定する方法を説明する。

<table><tbody><tr><td>1-オクタデカンチオール溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O1858-25ML</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356C-25mg</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Beads SM-2 吸着剤 (ポリスチレン吸着ビーズ)</td><td>BioRad</td><td>#152-3920</td><td></td></tr><tr><td>PD 10 脱塩カラム</td><td>GE Healthcare</td><td>GE17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>フィルター 200 nm 膜</td><td>Whatman Nucleopore</td><td>WHA800282</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Merck</td><td>33539-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>n-Decane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8034051000</td><td></td></tr><tr><td>n-dodecyl-&szlig;-D-maltoside (DDM)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850520P-25g</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>AppliChem</td><td>131659.1211</td><td></td></tr><tr><td>(SSM setup) SURFE2R N1</td><td>Nanion</td><td>-----</td><td></td></tr><tr><td>SURFE2R N1シングルセンサーチップ</td><td>Nanion</td><td># 161001</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>大腸菌 極性脂質抽出物</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>100600C</td><td></td></tr><tr><td>卵PC L-&α;-ホスファチジルコリン </td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840051C</td><td></td></tr></tbody></table>

固体支持膜(ssm)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

Selection of Transporter-Targeted Inhibitory Nanobodies by Solid-Supported-Membrane (SSM)-Based Electrophysiology

単一ドメイン抗体(ナノボディ)は、タンパク質の機械学的研究や構造研究で広く使用されており、臨床療法を開発するためのツールとして大きな可能性を秘めており、その多くはトランスポーターなどの膜タンパク質の阻害に依存しています。しかし、輸送活動の阻害を決定するために使用される方法のほとんどは、ハイスループットルーチンで実行することは困難であり、それによって大規模なnanobodyライブラリのスクリーニングを複雑にする標識基質の可用性に依存する。固体支持膜(SSM)電気生理学は、電気原性輸送体の特性評価や輸送の動態と阻害の測定に使用されるハイスループット法です。ここでは、電気原発性二次輸送体を標的とする阻害性および非阻害性ナノボディを選択し、ナノボディ阻害定数を計算するSSMベースの電気生理学の実施を示す。この技術は、標識された基質が利用できないトランスポーターを標的とする抑制性ナノボディを選択するのに特に有用である可能性がある。

SSMベースの電気生理学は、電気系トランスポーターの特性評価に広く使用されています。ここで紹介するプロトコルでは、SSMベースの電気生理学を用いて、阻害性および非阻害特性に基づいて、二次輸送体(ここでは細菌コリンシンポーター)を標的とするナノボディを分類する方法を示す。この手法の最も有用な機能の 1 つは、複数のバッファー条件のハイスループットスクリーニングが可能です。この特定の特性は、結合剤の選択後に数十から数十のナノボディを構成することができるnanobodyライブラリの分析に有益である。標準的な実験では、安定した脂質単層をセンサーチップ上に組み立てます。コリントランスポーターを含むプロテオリポソーム製剤を適用した後、実験の成功に不可欠であるとして良好な導電性および容量性のチェックが行われる。高ノイズのバックグラウンド電流により容易に観察される実験中に膜の完全性が損なわれた場合、低雑音状態の回復が難しいため、新しいチップへの変更が推奨されます。一般に、異なるチップを使用する場合、ナノボディによる輸送と阻害の測定の間で非常に良好な再現性を観察しました。
ナノボディのスクリーニング...

ナノボディは構造生物学の重要なツールであり、治療法の開発に大きな可能性を秘めています。しかし、抑制性を有するナノボディの選択は困難であり得る。ここでは、電気原性膜輸送体を標的とする抑制性および非阻害性ナノボディの分類に対する固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学の使用を実証する。

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

Single domain antibodies (nanobodies) have been extensively used in mechanistic and structural studies of proteins and they pose an enormous potential as ...

提示されたプロトコルは、プロテオリポソームで再構成されるか、膜小胞に存在する電気原性トランスポーターを標的とする阻害および非阻害性ナノボディのハイスループットスクリーニングおよび同定に使用される。転写アッセイの設計は、特にラベル付き基板が利用できない場合に、複数のケースで難しい場合があります。同じ電気生理学は、SSM電気生理学は標識された基質を必要としないので、事実上任意の電気電化輸送器のための輸送に対するナノボディの効果を研究することを可能にする場合。ナノボディは、医療用途での使用について調査されています。この技術は、ヒトまたはヒト病原体の特定の電気原性輸送体を標的とする潜在的な阻害剤をスクリーニングするのに役立つ。まず、10個のクリーンチューブを取り、非活性化固体支持膜、またはSSMの緩衝液の10ミリリットルを各チューブに移します。活性化SSMバッファーを準備するには、期待される半分の最大濃度の周りに一連の濃度を使用して、チューブに基板を追加します。SSM ソフトウェアを起動し、マシンを自動的に初期化します。データの保存パスを設定します。OKボタンを押して確認します。ワークフロー オプションで標準の初期クリーニング プロトコルを選択し、[実行] をクリックします。次に、プロテオリポソームコーティングされたチップをソケットに取り付けます。腕を動かしてチップをロックします。取り付けたチップをキャップで囲みます。ワークフロー内のプログラム CapCom を選択し、そのプログラムを実行して導電率とキャパシタンスを決定します。導電率が5ナノシーメン以下であり、容量が15〜35ナノファラドの間であることを確認してから、測定に使用してください。活性化ソリューションをバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファーを配置します。非活性化バッファーをリザーバに移し、右側のリザーバの位置にあるチップホルダーの隣に置きます。3 つの測定を実行し、10 個すべてのバッファーの次のアクティブ化バッファーに移動するループで、非アクティブ化、アクティブ化、非アクティブ化の一連のソリューション シーケンス、または BAB シーケンスを使用して、ワークフローのプロトコルを作成します。BAB シーケンスの 1 秒、1 秒、1 秒の流量で毎秒 200 マイクロリットルのデフォルトの流量を使用し、クリックして測定を開始します。プロトコルを保存し、再生ボタンをクリックしてワークフローを実行させます。次に、タンパク質フリーリポソームを用いて同様の実験を行う。データ分析に任意の好ましいソフトウェアを使用して、測定電流対時間をプロットし、活性化バッファの追加範囲でピーク高さの推定に関数を使用します。基板濃度に対してピーク電流をプロットし、非線形回帰を介して基板の濃度(EC50)の半分の最大効果を決定します。非活性化SSMバッファーの50ミリリットルをクリーンチューブに移します。5 ミリモルの最終濃度に基質コリンを追加し、陽性の制御測定にこれを使用します。.非活性化SSMバッファーの10ミリリットルをクリーンチューブに移します。5 ミリモルに基質コリンを追加し、500 ナノモルの最終濃度に nanobody.実演したように、各ナユーザーごとにこの手順を繰り返して、アクティベートソリューションを準備します。SSMマシンを起動し、先に示したように、プロテオリポソームコーティングチップの容量と導電率を測定します。ナ誰もせずに活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファを入れます。ナノ誰もせずに非活性化バッファーをリザーバに移し、プローブサンプラーに置きます。次に、活性化および非活性化溶液を有するナノボディを含むすべての溶液に対してこのプロセスを繰り返します。BAB シーケンスを使用してワークフローのプロトコルを作成します。ナノボディのないバッファを使用してBABシーケンスの3つの測定、ナノnobodyを含むバッファを含むBAB配列の2つの測定、ナnobodyとの120秒遅延時間インキュベーション、およびナnobodyを含むバッファを含むBAB配列の3つの測定を行うループを作成します。ワークフローを保存し、再生ボタンをクリックしてワークフローを実行させます。次に、BAB シーケンスと 5 つの測定値のループを使用して、可逆的にバインドされたナノ ボディを洗い流すワークフロー用の新しいプロトコルを作成します。ワークフローを保存し、再生ボタンをクリックしてワークフローを実行させます。測定の最後のピーク電流を初期基板のみの測定と比較します。ピーク電流が初期値に達すると、ナナnobodyは正常に洗浄され、初期条件が再確立されました。それ以外の場合は、ワークフローを繰り返すか、新しいチップに変更します。各ナノースクリーンに対して個別のチップを使用してこのプロセスを繰り返すか、同じチップを使用して複数のナノボディで繰り返します。データ分析に任意の優先ソフトウェアを使用して、測定電流対時間をプロットします。その後、ソフトウェアは自動的に活性化バッファの追加の範囲でピーク高さの推定のための関数を選択します。進む基板のみの測定に基づいて、ピーク電流とナノーの存在を正規化します。ヒストグラム内のピーク電流をプロットし、基質のみの測定のピーク電流をナノボディの存在下で測定されたピーク電流と比較して、阻害性のあるナノボディを同定します。非活性化SSMバッファーの50ミリリットルをクリーンチューブに移し、5ミリモルの最終濃度に基質コリンを加え、これをポジティブコントロールの活性化溶液として使用します。非活性化溶液の5ミリリットルを8つのクリーンチューブに加え、その後、予想されるIC50範囲の濃度でチューブに基質コリンと阻害nanobodyを追加します。8つのチューブに非活性化溶液の10ミリリットルを加え、非活性化緩衝液に対応する各チューブに阻害nanobodyを加えます。SSMセットアップを開始し、プロテオリポソームコーティングチップの容量と導電率を測定します。ナネラなしで活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーに入れる。次に、nanobodyなしで非活性化バッファーを貯水池に移し、右側のチップホルダーの隣のリザーバーの位置に置きます。ナノボディを含む活性化および非活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファーを配置します。BAB シーケンスを使用して、ワークフローのプロトコルを作成します。各濃度を2回測定し、120秒間インキュベートし、さらに3回測定するループを含める。データ分析に任意の優先ソフトウェアを使用して、測定電流対時間をプロットし、活性化バッファの追加範囲でピーク高さの推定関数を選択します。非線形回帰を介してIC50を決定するために、ナノミの濃度に対してピーク電流をプロットします。ナノボディのスクリーニング中に使用する基質濃度を決定するために、電気原性輸送を異なる基質濃度で測定し、EC50を決定した。飽和状態に対応する基質濃度を、5ミリモル、選択し、全ての活性化緩衝液において一定に保った。電気原性輸送に対する抑制性ナノボディの効果を、ピーク電流の振幅の減少から可視化した。ナナの束縛を可能にする洗浄プロトコルを実行した後、初期ピーク電流振幅の80〜95%の回復が観察された。非活性化条件から活性化条件に変化する場合、これらの緩衝液に存在するナノボディによって有意なアーティファクト電流は導入されなかった。阻害特性を有するナノボディを選択した後、個々のナノボディに対するIC50値を決定した。nanobodyを含むバッファーをチップ上のプロテオリポソームのキャリブレーションに十分な時間を与える必要があります。結合は可逆的であるため、nanobodyは活性化バッファーと非アクティブ化バッファーの両方に存在する必要があります。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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培養細胞における官能化ナノボディを用いたエンドサイトーシス輸送の生細胞イメージング

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膜タンパク質の単一分子局在顕微鏡法による単一抗体標識法

学ぶ固体支持膜電気生理学を用いたナノボディスクリーニング法。電気性トランスポーターの阻害・非阻害ナノボディを高スループットで同定し、IC50値を決定できます。ラベルフリーで大規模ライブラリーのスクリーニングが可能です。

固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

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