固体支持膜(SSM)ベースの電気生理学によるトランスポーター標的阻害ナノボディの選択

提示されたプロトコルは、プロテオリポソームで再構成されるか、膜小胞に存在する電気原性トランスポーターを標的とする阻害および非阻害性ナノボディのハイスループットスクリーニングおよび同定に使用される。転写アッセイの設計は、特にラベル付き基板が利用できない場合に、複数のケースで難しい場合があります。同じ電気生理学は、SSM電気生理学は標識された基質を必要としないので、事実上任意の電気電化輸送器のための輸送に対するナノボディの効果を研究することを可能にする場合。

ナノボディは、医療用途での使用について調査されています。この技術は、ヒトまたはヒト病原体の特定の電気原性輸送体を標的とする潜在的な阻害剤をスクリーニングするのに役立つ。まず、10個のクリーンチューブを取り、非活性化固体支持膜、またはSSMの緩衝液の10ミリリットルを各チューブに移します。

活性化SSMバッファーを準備するには、期待される半分の最大濃度の周りに一連の濃度を使用して、チューブに基板を追加します。SSM ソフトウェアを起動し、マシンを自動的に初期化します。データの保存パスを設定します。

OKボタンを押して確認します。ワークフロー オプションで標準の初期クリーニング プロトコルを選択し、[実行] をクリックします。次に、プロテオリポソームコーティングされたチップをソケットに取り付けます。

腕を動かしてチップをロックします。取り付けたチップをキャップで囲みます。ワークフロー内のプログラム CapCom を選択し、そのプログラムを実行して導電率とキャパシタンスを決定します。

導電率が5ナノシーメン以下であり、容量が15〜35ナノファラドの間であることを確認してから、測定に使用してください。活性化ソリューションをバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファーを配置します。非活性化バッファーをリザーバに移し、右側のリザーバの位置にあるチップホルダーの隣に置きます。

3 つの測定を実行し、10 個すべてのバッファーの次のアクティブ化バッファーに移動するループで、非アクティブ化、アクティブ化、非アクティブ化の一連のソリューション シーケンス、または BAB シーケンスを使用して、ワークフローのプロトコルを作成します。BAB シーケンスの 1 秒、1 秒、1 秒の流量で毎秒 200 マイクロリットルのデフォルトの流量を使用し、クリックして測定を開始します。プロトコルを保存し、再生ボタンをクリックしてワークフローを実行させます。

次に、タンパク質フリーリポソームを用いて同様の実験を行う。データ分析に任意の好ましいソフトウェアを使用して、測定電流対時間をプロットし、活性化バッファの追加範囲でピーク高さの推定に関数を使用します。基板濃度に対してピーク電流をプロットし、非線形回帰を介して基板の濃度(EC50)の半分の最大効果を決定します。

非活性化SSMバッファーの50ミリリットルをクリーンチューブに移します。5 ミリモルの最終濃度に基質コリンを追加し、陽性の制御測定にこれを使用します。.非活性化SSMバッファーの10ミリリットルをクリーンチューブに移します。

5 ミリモルに基質コリンを追加し、500 ナノモルの最終濃度に nanobody.実演したように、各ナユーザーごとにこの手順を繰り返して、アクティベートソリューションを準備します。SSMマシンを起動し、先に示したように、プロテオリポソームコーティングチップの容量と導電率を測定します。

ナ誰もせずに活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファを入れます。ナノ誰もせずに非活性化バッファーをリザーバに移し、プローブサンプラーに置きます。次に、活性化および非活性化溶液を有するナノボディを含むすべての溶液に対してこのプロセスを繰り返します。

BAB シーケンスを使用してワークフローのプロトコルを作成します。ナノボディのないバッファを使用してBABシーケンスの3つの測定、ナノnobodyを含むバッファを含むBAB配列の2つの測定、ナnobodyとの120秒遅延時間インキュベーション、およびナnobodyを含むバッファを含むBAB配列の3つの測定を行うループを作成します。ワークフローを保存し、再生ボタンをクリックしてワークフローを実行させます。

次に、BAB シーケンスと 5 つの測定値のループを使用して、可逆的にバインドされたナノ ボディを洗い流すワークフロー用の新しいプロトコルを作成します。ワークフローを保存し、再生ボタンをクリックしてワークフローを実行させます。測定の最後のピーク電流を初期基板のみの測定と比較します。

ピーク電流が初期値に達すると、ナナnobodyは正常に洗浄され、初期条件が再確立されました。それ以外の場合は、ワークフローを繰り返すか、新しいチップに変更します。各ナノースクリーンに対して個別のチップを使用してこのプロセスを繰り返すか、同じチップを使用して複数のナノボディで繰り返します。

データ分析に任意の優先ソフトウェアを使用して、測定電流対時間をプロットします。その後、ソフトウェアは自動的に活性化バッファの追加の範囲でピーク高さの推定のための関数を選択します。進む基板のみの測定に基づいて、ピーク電流とナノーの存在を正規化します。

ヒストグラム内のピーク電流をプロットし、基質のみの測定のピーク電流をナノボディの存在下で測定されたピーク電流と比較して、阻害性のあるナノボディを同定します。非活性化SSMバッファーの50ミリリットルをクリーンチューブに移し、5ミリモルの最終濃度に基質コリンを加え、これをポジティブコントロールの活性化溶液として使用します。非活性化溶液の5ミリリットルを8つのクリーンチューブに加え、その後、予想されるIC50範囲の濃度でチューブに基質コリンと阻害nanobodyを追加します。

8つのチューブに非活性化溶液の10ミリリットルを加え、非活性化緩衝液に対応する各チューブに阻害nanobodyを加えます。SSMセットアップを開始し、プロテオリポソームコーティングチップの容量と導電率を測定します。ナネラなしで活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーに入れる。

次に、nanobodyなしで非活性化バッファーを貯水池に移し、右側のチップホルダーの隣のリザーバーの位置に置きます。ナノボディを含む活性化および非活性化溶液をバイアルに移し、プローブサンプラーにバッファーを配置します。BAB シーケンスを使用して、ワークフローのプロトコルを作成します。

各濃度を2回測定し、120秒間インキュベートし、さらに3回測定するループを含める。データ分析に任意の優先ソフトウェアを使用して、測定電流対時間をプロットし、活性化バッファの追加範囲でピーク高さの推定関数を選択します。非線形回帰を介してIC50を決定するために、ナノミの濃度に対してピーク電流をプロットします。

ナノボディのスクリーニング中に使用する基質濃度を決定するために、電気原性輸送を異なる基質濃度で測定し、EC50を決定した。飽和状態に対応する基質濃度を、5ミリモル、選択し、全ての活性化緩衝液において一定に保った。電気原性輸送に対する抑制性ナノボディの効果を、ピーク電流の振幅の減少から可視化した。

ナナの束縛を可能にする洗浄プロトコルを実行した後、初期ピーク電流振幅の80〜95%の回復が観察された。非活性化条件から活性化条件に変化する場合、これらの緩衝液に存在するナノボディによって有意なアーティファクト電流は導入されなかった。阻害特性を有するナノボディを選択した後、個々のナノボディに対するIC50値を決定した。

nanobodyを含むバッファーをチップ上のプロテオリポソームのキャリブレーションに十分な時間を与える必要があります。結合は可逆的であるため、nanobodyは活性化バッファーと非アクティブ化バッファーの両方に存在する必要があります。