Name: 翻訳調節におけるRNA-タンパク質相互作用を研究する光ピンセット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 26 s
Description: 学ぶ光ピンセットを用いたRNA-タンパク質相互作用の研究法。コンフォーカル顕微鏡と組み合わせて翻訳調節における結合事象や力学的測定をリアルタイムで観察する手法を解説します。

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原稿を批判的に見直してくれたアヌジャ・キベ教授とレドモンド・スミス教授に感謝します。私たちは、専門家の技術支援のためにタチアナ・コッホに感謝します。私たちは、実験的なビデオを記録する助けのためにクリスティナペカルコワに感謝します.当研究室での研究は、ヘルムホルツ協会と欧州研究評議会(ERC)グラント・Nr・948636(NC)からの資金提供によって支援されています。

1. サンプル準備
<ol><li>対象の配列を、ハンドル配列として機能するラムダDNAフラグメントを含むベクターにクローン化します(図2)43,50。</li>
	<li>まず、PCRを介して後続 のインビトロ 転写用のDNAテンプレートを生成する(図2B;反応1)。このPCRステップでは、T7プロモーターがセンスDNA分子32、33、43、50の5'末端に添加される。 表1に従ってPCR反応を設定する。サーモサイクラーで適切なサイクルで50 μLアリコートでPCRを実行します。</li>
	<li>2つの別々のPCR反応でハンドルを準備します(表1、 図2B、反応2および3)。まず、PCRで5'ハンドルを生成します。次に、3'ハンドルを生成し、同時に5'ジゴキシゲニン標識プライマー32、33、43、50を使用してジゴキシゲニンでそれをラベル付けします。</li>
	<li>PCR後、シリカスピンカラムを用いてDNAを精製する。</li>
	<li>T7 RNAポリメラーゼを用いたインビトロ転写反応を行う(表2)32、33、43、50。RNAの長さに応じて、37°Cで2〜4時間反応をインキュベートします。次に、DNase Iを反応に加え、37°Cで30分間インキュベートし、DNAテンプレートを消化します。シリカスピンカラムを使用してRNAを精製します。</li>
	<li>5'ハンドルの標識反応(表3)の間に、T4 DNAポリメラーゼ38,50によってハンドルの3'端部にビオチン-16-dUTPを加える。室温で1〜2時間反応を行う。その後、シリカスピンカラムを用いてDNAを精製する。 メモ:5'ハンドルは3'の端にラベル付けする必要があるため(図2B)、PCR中にラベル付けを行うことはできません。</li>
	<li>上記の成分を混合する - 5'ハンドル(ビオチンで標識3')、3'ハンドル(5'ジゴキシゲニンで標識)、およびRNA - アニール緩衝液中の1:1:1モル比(80%ホルムアミド、400mM NaCl、40mM HEPES、pH 7.5、0.5 mEDTA、pH)を得る/4つのDNAハイブリッド(DNA)を得る。焼鈍混合物を85°Cまで10分間加熱し、4°Cまでゆっくりと冷まします。</li>
	<li>アニールサンプルを3M酢酸ナトリウム(pH5)の1/10容量と混合し、3量の氷冷エタノールを混合し、-80°Cで1時間または-20°Cで一晩でインキュベートします。</li>
	<li>サンプルを4°Cで30分間15,000× g で遠心します。 上清を捨て、真空下でペレット(通常は目に見えない)を乾燥させます。</li>
	<li>最後に、再懸濁し、ペレットをRNaseフリー水の50μLで、アリコートを作ります。アリコートは使用するまで-80°Cで保管してください。短期保存のために、サンプルはまた-20°Cで貯えることができる。</li>
</ol>2. 計器のセットアップ
メモ:次のプロトコルは、LUMICKS社の商用光ピンセット計器C-Trap用に最適化されています。したがって、他の光ピンセット機器を使用する場合、提示されたステップの調整が必要になる場合があります。使用しない場合、機械のマイクロ流体システムは漂白剤(次亜塩素酸ナトリウム溶液)に保たれ、使用前に洗浄する必要があります。
<ol><li>漂白剤を捨て、RNaseフリーの水を1mLで注射器に充填します。</li>
	<li>0.5 Mナトリウムチオ硫酸ナトリウムの50 μLを少なくとも1mLのRNaseフリー水に加え、システム(1バー、0.5mL以上)を十分に洗浄して、システム内の残りの漂白剤を除去します。</li>
	<li>チオ硫酸ナトリウム溶液を注射器から捨てます。注射器を新鮮なものに交換し、RNaseフリー水の少なくとも0.5 mLでシステムを洗浄してください。 注:マイクロ流体システムは、システム内の気泡を避けるために乾燥して実行することはありませんので、注意してください。</li>
	<li>2滴の浸漬油(1.33の屈折率)または約70μLの水を目的の上に置きます。</li>
	<li>フローセルを保持フレーム内の位置に配置します。</li>
	<li>流動セルの上に2滴の浸漬油(1.51の屈折率)を入れます。</li>
	<li>ピンセットマシンでレーザーデバイスの電源を入れます。実行したら、ソフトウェアインターフェイスのトラップレーザーを100%でオンにします。</li>
	<li>診断カメラ(Zファインダー)を使用して、マイクロスクリューを回して、屈折リングが最大である第2反射と第3反射(インタフェース)の間のチャンバーの中央にZ軸を調整します。 注:目的が測定チャンバーに近づき、目的の焦点面が2つのフェーズ間の界面を横切るたびに、Zファインダーモードで反射を認識することができます。可能な4つのインターフェースがあります:(i)水/浸漬油および底ガラス(ii)チャンバー内の底部ガラスおよび緩衝液(iii)チャンバー内の(iii)緩衝液、上部ガラス(iv)上部ガラスおよび凝縮器用浸漬油。</li>
	<li>コンデンサの位置を調整し(トラップレーザーを約50%)、コンデンサが測定室の上に浸漬油に触れるようにします。</li>
	<li>コンデンサーでゆっくりと下に移動してフォーカスを調整し、月モード(診断カメラ)で約10個の光バンドが表示されるようにします。</li>
</ol>3. サンプル測定
<ol><li>インキュベート抗ジゴキシゲニンコーティングビーズ(AD)サンプル構成体(3 μLの0.1%(w/v)ADビーズ懸濁液+4 μLサンプル)と、RNase阻害剤1 μLおよび8μLのアッセイバッファー(300 mM KCl、 5 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7.6, 0.05% Tween 20, 5 mM DTT) RTで 10-20 分間.インキュベーション後、サンプルを500 μLのアッセイバッファーで希釈します。 注:酸化的損傷を防ぐために、特に蛍光測定時に酸素捕捉剤をバッファーに追加することをお勧めします。ここでグルコース(8.3mg/mL)、グルコースオキシダーゼ(40 U/mL)およびカタラーゼ(185 U/mL)を含む脱酸素剤系が使用された。</li>
	<li>0.8 μLの 1%(w/v)ストレプトアビジンコーティング(SA)ビーズを1 mLのアッセイバッファーと混合します。</li>
	<li>注射器から水を捨て、それぞれの懸濁液/溶液で注射器を充填します。約1バーで少なくとも2分間洗ってから、ビーズを捕まえ始めます。 メモ:実験用のセットアップによっては、異なるチャンネル配置が使用される場合があります(図3)。典型的には、1つの流路はRNA分子を運ぶ抗ジゴキシゲニンビーズで満たされる。第2のチャネルは、ストレプトアビジンコーティングビーズで満たされています。バッファチャネルは、テザーを形成するために使用されます。第4のチャネルは、RNA結合タンパク質をロードするために使用することができる(図3C)、または代わりに、RBPを直接バッファチャネルに加えることができる(図3B)。</li>
	<li>ビーズをキャプチャするには、光トラップを互いに離して動かします。まず AD チャネルに移動し、トラップ 1 で AD ビーズをキャッチします。次に、ステージを SA チャネルに移動し、トラップ 2 で単一の SA ビーズをキャッチします。 注:すでに捕まえられたビードを失うことを避けるために、または同じトラップによって複数のビーズを捕まえるのを防ぐために、バッファとビードチャネルのインターフェイスにとどまるようにしてください。</li>
	<li>適切なサイズのビーズがキャプチャされたら、バッファーチャネルに移動し、層流を停止します。次に、トラップの剛性をチェックするために力のキャリブレーションを行います。それぞれの剛性の値は、X/Y 軸で 10 ~ 15% 以上異なってはなりません。 注:ビードサイズに応じて、レーザーパワーまたはレーザー分割をトラップ間で調整します。ビードテンプレートが一致する限り、すべてのビードペアに対してフォースキャリブレーションを行う必要はありません(類似度スコア&gt;0.9)。しかし、定期的に行うか、または少なくともアッセイ条件が変化するたびに行われるべきである。</li>
	<li>ビーズを互いに近くに移動し、数秒間待ってから離れて戻し、テザーが形成されるまで繰り返すことによって、テザーの釣りを開始します。テザー形成は、2つのビーズを互いに引き離した場合に測定力の増加をもたらす。 注: 複数のテザーの形成を避けるために、ビーズを近くに移動しすぎないようにしてください。2つのビーズの間にテザーを挟んだ後、過延伸高原を見つけることによってテザーの品質を確認することができます。単一のテザーの場合、高原は50〜60 pNの間でなければなりません。</li>
	<li>テザーを取得した後、測定を開始します。研究した現象に応じて、異なる測定設定を選択する必要があります(図1B-D)。 注: 通常、実験の開始時に、テザーの品質を確認し、動作を調査するフォースランプ実験が行われます。その後、状態遷移をさらに研究するために、一定力または定位置実験を開始してもよい。RNAサンプルで十分な数の測定が行われ、その挙動を決定すると、標識された因子をシステムに追加して共焦点測定を行うことができます。</li>
	<li>蛍光測定を行う場合は、光ピンセット装置の共焦点レーザーと光子カウンターユニットをオンにします。</li>
	<li>ソフトウェアインターフェースで希望波長の励起レーザーをオンにし、蛍光色素に応じてレーザーのパワーを5%以上に設定します。 注:測定を行わないうち、励起レーザーの電力設定を0%に下げて、サンプルへの過度の光害を避けてください。</li>
	<li>ソフトウェアのイメージ機能を使用してサンプルのイメージングを開始します。 注意:画像を十分に焦点を合わせるには、共焦点顕微鏡と光学トラップの焦点面を整列させる必要があります。この目的のために、青色レーザーチャネルにおけるポリスチレンビーズの自己蛍光を採用することができる。オプティカル トラップの焦点面は、ビーズの画像が最も高い直径に達するまで Z 軸で上下に移動します。この位置では、ビーズ間につながれた分子からの蛍光シグナルを測定することができる。</li>
	<li>キモグラフ機能を使用するには、ビーズ間のテザーを検出できるように、キモグラフ軸のx-y位置を指定します。</li>
	<li>測定全体を通して、緩衝組成物はビーズを異なるチャネルに移動するか、マイクロ流体システムで供給されるバッファを変えることによって容易に変えることができる。</li>
</ol>4. データ分析
<ol><li>生データの前処理<ol>
<li>単純なスクリプトを使用して、(i) 後続のデータ処理を高速化するのに十分な量の未加工データをダウンサンプルしますが、(ii) すべての重要な情報を含んでいます (図 4A)。通常、100-5000 Hzはこの目的に適しています。 注:光ピンセット実験のデータ収集頻度は、多くの場合、分析に必要なよりも高いです - 提示された実験では、データ収集周波数はデフォルトで78 125 Hzに設定されています。記憶領域が限られているため、データのサンプリングレートを低減するのに便利で時間を節約できます。ここでは、生データを30倍にダウンサンプリングしました。</li>
		<li>次に、信号フィルタを用いて、信号からの高周波測定ノイズを低減する(図4A)。フィルターの度合いとカットオフ周波数のパラメータを調整して、異なる実験のデータ出力を最適化します(図5)。 注意:信号フィルタの中で、バターワースfilter51 は最も広く使用されているの一つです。生データの事前処理を可能にするカスタム記述の Python スクリプトが補足データに提供されます。ダウンサンプリングと信号フィルタリングパラメータ(カットオフ周波数、フィルタ度)は、さまざまな実験に合わせて最適化する必要があります。</li>
	</ol></li>
	<li>フォース ランプ データ解析では、次の手順を実行します。<ol>
<li>フォース軌道プロット上の対応する点を見つけるか、カスタム記述スクリプトを使用して、手動でステップをマークします。展開ステップは、力距離(FD)曲線の距離の増加と組み合わせた急激な力の低下によって特徴付けられる。</li>
		<li>展開イベントがマークされたら、適切なモデルを使用して FD カーブの異なる領域にフィットします(図 4D)。 注: 最初の展開手順の前の領域では、テザーは「二本鎖」とみなされ、一般的に拡張可能なワームのようなチェーン モデル(WLC)47,52,53 を使用してフィットします。最初の展開イベントの後の部分は、二本鎖ヌクレオチド(ハンドル)と一本鎖ヌクレオチド(展開されたRNA分子)の組み合わせと考えられています。したがって、データフィッティングはより複雑です - 通常、2つのWLCモデルまたはWLCと自由結合チェーン(FJC)モデルの組み合わせが採用されています36,39,52。拡張可能 WLC モデルには、輪郭の長さ(LC)と持続性の長さ(LP)の 2 つのメイン フィット パラメータがあります。輪郭の長さは、完全に伸びた分子の長さに対応し、持続長は対象の分子の曲げ特性を定義する。モデルは、以下の式(1)で記述することができる。WLC は、折り畳まれた領域と展開された領域の両方の動作をモデル化するために使用できますが、これらごとに異なるパラメータを持つ別々のモデルを採用する必要があります。 (1) <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq01.jpg"> ここで、Xは伸長、LC は輪郭の長さ、Fは力、LP は持続長、kB はボルツマン定数、Tは熱力学温度、Sはストレッチ係数です。 自由関節チェーン(FJC)と呼ばれる2番目のモデルは、一般的に展開された単一の立ち往生領域の挙動を記述するために使用されます。ポリマーの同様のパラメータを使用するが、ここで展開された単一鎖領域のヌクレオチドに対応する「鎖」の各単位を剛性ロッドとして扱う。次の式 (2) は、このモデルを説明します。 (2) <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/62589/62589eq02.jpg"> 注:私たちの研究室は最近、「実用的な光ピンセット分析TOol(POTATO)54」と呼ばれる生の力ランプデータのバッチ処理を可能にするアルゴリズムを開発しました。アルゴリズムは、データをダウンサンプリングしてフィルタリングし、展開可能なステップを特定し、最終的にデータフィッティングを実行します。ポテトはユーザーフレンドリーなグラフィカルユーザーインターフェイス(GUI)(https://github.com/REMI-HIRI/POTATO)で造られる。</li>
	</ol></li>
	<li>定数強制データは、次のように処理します。 注: 次の手順は、定数位置データに対して類似的に適用できます。<ol>
<li>一定力データの場合、時間の経過に対する距離をプロットします(図5)。位置の相対的な変化に対する異なる立体の頻度(カウント)を示すヒストグラムは、さまざまな支配的およびマイナーな状態を特徴付ける便利な方法です(図7)。</li>
		<li>(複数の)ガウス関数を使用してヒストグラムを適合させ、特定の力で個々の適合者の全体的な割合を推定します(図7C)。ガウスは、適合、平均位置、標準偏差は、異なる集団間の力関連関係を概説します。 注: 事前処理と定数力データの基本的な二重モーダルガウスフィッティングを可能にするカスタム記述されたPythonスクリプトは、補足データに提供されています。パラメータ(カットオフ周波数、フィルタ度、期待値、標準偏差値、振幅)は、さまざまな実験に合わせて最適化する必要があります。</li>
		<li>次に、隠しマルコフモデルを使用して状態をさらに分析し、追加の折りたたみ中間体(適合者)55を明らかにする可能性があります。定数力および隠されたマルコフモデルの詳細については、1つは55、56、57、58を参照することができます。</li>
	</ol></li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

ここでは、蛍光結合型光ピンセットを用いて、RNA分子と様々なリガンドの相互作用と動的挙動を研究する方法を示す。以下に、本技術の重要なステップと限界について説明します。
プロトコルの重要なステップ 他の多くの方法と同様に、サンプルの品質は信頼性の高いデータを得るために極めて重要です。したがって、可能な限り最高の品質のサンプルを得るために、サンプル調製のための手順を最適化するために時間を費やす価値があります。最適化ステップには、適切なプライマー設計、アニーリング温度、RNAおよびタンパク質精製ステップが含まれます。
RNaseフリー条件を維持するためには、実験全体を通して、フィルター処理されたチップとソリューションの使用が重要です。また、マイクロ流体システムは、使用しない場合に漂白剤に保たれます。測定を開始する前に、システムから漂白剤を除去するために、チオ硫酸ナトリウムとRNaseフリー水でシステムを適切に洗浄することが重要です。
実験...

mRNAを介したDNAからタンパク質への遺伝情報の伝達は、細胞内の高分子相互作用を通じてあらゆるレベルで正確に調節される複雑な生化学的プロセスです。翻訳調節では、RNAとタンパク質の相互作用は、様々な刺激およびシグナルに迅速に反応する重要な役割を与える1,2。RNAとタンパク質の相互作用の中には、mRNAの安定性に影響を与え、RNAが翻訳的に活性である時間を変化させるものがあります。他のRNA-タンパク質相互作用は、ストップコドンの読み取り、バイパス、またはプログラムリボソームフレームシフト(PRF)3,4,5,6,7などの再コードメカニズムに関連しています。最近では、多くのRNA結合タンパク質(RRP)が、細胞内でいつ、どのくらいのリコードが起こるかを決定するために、刺激性mRNA要素および翻訳機械と相互作用することが実証されています7,8,9,10,11。したがって、翻訳におけるRNA結合タンパク質の役割と、RNA構造および安定性を調節する方法を解剖するためには、RNA-タンパク質複合体の相互作用原理と機械的特性を詳細に研究することが極めて重要です。
数十年にわたる作業は、速度と精度を達成するために翻訳機械のRNAとタンパク質成分の間の複雑なコミュニケーションに依存する翻訳のマルチステップおよびマルチコンポーネントプロセスを研究するための基礎を築いてきました12,13,14。複雑な規制事象を理解するうえで重要な次のステップは、翻訳中の力、タイムスケール、構造決定要因を高精度で決定することです12,15,16,17。RNAの立体構造ダイナミクス、特に翻訳中のRNA構造に対するトランス作用補助因子の作用の研究は、光ピンセットやゼロモードの導波ガイドを含む単分子ツールの出現によってさらに明るやかされています16,17,18,19,20,21,22,23,24 ,25,26.
光ピンセット(OT)は、転写を含む多くの種類のRNA依存性動的プロセスを研究するために適用された非常に正確な単分子技術を表し、翻訳26,28,28,29,30,31,32。光ピンセットの使用により、分子相互作用、核酸構造、熱力学的特性、運動論、およびこれらのプロセスのエネルギーの詳細な調査が可能になりました17,22,33,34,35,36,37,38,39 .光ピンセットアッセイは、焦点を合わせるレーザービームを有する微視的な物体の封じ込めに基づいている。典型的なOT実験では、目的の分子は2つの透明(通常はポリスチレン)ビーズ(図1A)27の間につながれである。これらのビーズは、その後、スプリングのように動作する光学トラップによってキャッチされます。したがって、分子に適用される力は、焦点を合わせるレーザー光(トラップ中心)の中心からのビードの変位に基づいて計算することができる。近年、光ピンセットを共焦点顕微鏡(図1B)と組み合わせて、蛍光またはフェルスター共鳴エネルギー伝達(FRET)測定40,41,42を可能にしました。これにより、同時測定が可能な実験の全く新しい分野が開き、力分光法と蛍光データの正確な相関が可能になります。
ここでは、光ピンセットと共焦点顕微鏡を組み合わせて、並進フレームシフトを調節するタンパク質とRNAの相互作用を研究する実験を行う。目的と凝縮器の間に、5つのチャネルを持つフローセルは、層流を用いた連続的なサンプル塗布を可能にする。マイクロ流体チャネルを介して、様々な成分を直接注入することができ、実験全体を通してサンプル消費をほとんど行わず、実践的な時間を短縮します。
まず、OT実験の設計を支援する基本的なガイドラインを提案し、様々なセットアップの落とし穴と同様に利点を議論する。次に、サンプルの調製と実験ワークフローについて説明し、データ分析のためのプロトコルを提供する。例を示すために、代替読み取りフレーム43からのウイルスRNAの翻訳を変化させるジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質(ZAP)のトランス作用因子を用いてSARS-CoV-2フレームシフトRNA元素(図2A)を研究するRNAストレッチ実験から得られた結果を概説する。さらに、このOT共焦点アッセイでは蛍光標識リボソームを採用できることが実証されており、翻訳機械の加工性と速度を監視するのに役立ちます。ここで提示される方法は、翻訳のさまざまな側面を研究するために、異なるバッファー、リガンド、または他の細胞成分の効果を迅速にテストするために使用することができます。最後に、一般的な実験的な落とし穴と、それらのトラブルシューティング方法について説明します。以下に、実験計画の重要なポイントを概説します。
設計の構築 原則として、OT適合性RNA構築物を作成するための2つの一般的なアプローチがあります。最初のアプローチは、相補的なDNAハンドルとハイブリダイズされる長いRNA分子を採用し、したがって、真ん中に一本鎖RNA配列を横切る2つのRNA/DNAハイブリッド領域からなる構築物を生み出す(図2B)。このアプローチは、ほとんどのOT RNA実験で33,44,45に採用されています。
2 番目のアプローチでは、dsDNA ハンドルの短い (約 20 nt) のオーバーハング数 15,17 を利用します。これらのオーバーハングは、RNA分子とハイブリダイズされます。設計は複雑ですが、dsDNAハンドルを使用すると、DNA/RNAハイブリッドシステムの制限を克服できます。原則として、非常に長いハンドル(>10kb)でも実装できるため、共焦点測定に便利です。さらに、RNA分子をDNAハンドルに連結してテザー安定性を高めることができる。
エンドラベリング戦略 構築物は強い分子相互作用によってビーズにつながれなければならない。ハンドルの共有結合にはbeads46へのアプローチがありますが、ストレプトアビジン-ビオチンおよびジゴキシゲニン抗体などの強いが非共有的な相互作用は、OT実験15,33,35,45で一般的に使用されています。記載されたプロトコルにおいて、構築物はビオチンまたはジゴキシゲニンで標識され、ビーズは、それぞれ、ジゴキシゲニンに対するストレプトアビジンまたは抗体でコーティングされる(図1A)。このアプローチは、最大約60pN(テザー当たり)47の力を加えるのに適しています。さらに、異なる5'および3'ラベル付け戦略を使用することで、ビーズ17の間に形成されるテザーの方向を決定することができる。
蛍光測定用タンパク質標識 共焦点イメージングでは、蛍光標識にはいくつかの一般的に使用されるアプローチがあります。例えば、フルオロフォアは、タンパク質に自在に見られるアミノ酸残基に共有結合したり、反応性有機基を介して部位特異的突然変異誘発によって導入されたりする。チオールまたはアミン反応性染料は、システイン残基およびリジン残基の標識にそれぞれ使用できる。標識48,49の特異性を高めるための可逆的な保護方法はいくつかありますが、ネイティブタンパク質は通常、複数の残基で標識されます。蛍光素の小さなサイズは利点を与えるかもしれませんが、非特異的標識はタンパク質活性を妨げる可能性があり、したがってシグナル強度は49変わることがあります。また、標識効率に応じて信号強度が異なる実験によって異なる場合がある。したがって、実験の前にアクティビティチェックを実行する必要があります。
目的のタンパク質に His タグやストレップ タグなどの N または C 端子タグが含まれている場合、これらのタグの特定の標識は別の一般的なアプローチを表します。さらに、タグ標的標識は、フルオロフォアがタンパク質活性を妨害する可能性を低減し、溶解度49を高めることができる。しかし、タグ特異的標識は通常、モノフルオロフォア標識タンパク質を生み出し、検出が困難である可能性があります。特異的標識の別の方法は、抗体を採用することによって達成することができる。
マイクロ流体セットアップ OTとマイクロ流体システムの組み合わせにより、異なる実験条件間の迅速な移行が可能になります。さらに、現在のシステムはフローセル内の層流を維持することを利用し、流れ方向に対して垂直方向の他のチャネルからの液体の混合を妨げる。そのため、層流は実験計画に特に有利である。現在、最大5チャンネルのフローセルが一般的に使用されています(図3)。

<table><tbody><tr><td>Bacterial Strains</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E. coli HB101</td><td>lab collection</td><td>N/A</td><td>cloning of the vectors</td></tr><tr><td>Chemicals and enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31424</td><td>Buffers</td></tr><tr><td>Biotin-16-dUTP</td><td>Roche</td><td>11093070910</td><td>Biotinylation</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4737</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>カタラーゼ</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>酸素スカバンジャーシステム</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td> <td>Melford Labs</td><td>D11000</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>DNAse I ウシ膵臓由来</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527</td><td>in vitro 転写</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Th.Geyer</td><td>11786181</td><td>PCR</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>バッファー ホルムアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11814320001</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270-1KG</td><td>酸素スカバンジャーシステム</td></tr><tr><td>グルコースオキシダーゼ</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>酸素スカバンジャーシステム</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>カールロス</td><td>HN78.3</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>カールロス</td><td>2189.1</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>Phusion DNA ポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td>ギブソン アセンブリ、クローニング</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>メルク</td><td>529552-1KG</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>PrimeSTAR GXL DNA ポリメラーゼ</td><td>タカラ バイオ クロンテック</td><td>R050A</td><td>PCR</td></tr><tr><td>ピロホスホターゼ、サーモスタビレ、無機</td><td>NEB</td><td>M0296L</td><td>in vitro 転写</td></tr><tr><td>RNase 阻害剤</td><td>Molox</td><td>1000379515 Buffer</td><td></td></tr><tr><td>rNTPS</td><td>Life Technologies</td><td>R0481</td><td>in vitro転写</td></tr><tr><td>チオスロファ酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6672-500G</td><td>漂白剤の不活性化</td></tr><tr><td>Sytox Green</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>共焦点測定</td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td>ビオチン化</td></tr><tr><td>T5 エキソヌクレアーゼ</td><td>NEB</td><td>M0363S</td><td>ギブソンアセンブリ、クローニング</td></tr><tr><td>T7 RNA ポリメラーゼ</td><td>社内で生産</td><td>N/A</td><td>in vitro 転写</td></tr><tr><td>Taq DNA ポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0267S</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Taq リガーゼ</td><td>Biozym</td><td>L6060L</td><td>ギブソンアセンブリ、クローニング</td></tr><tr><td>TWEEN 20 BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td>バッファー</td></tr><tr><td>Kits</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>モノリスタンパク質ラベリングキット RED-NHS 第2世代(アミン反応性)</td><td>ナノテンパー</td><td>MO-L011</td><td>リボソームラベリングに使用</td></tr><tr><td>Purefrex 2.0</td><td>GeneFrontier</td><td>PF201-0.25-EX</td><td>リボソーム ラベリング</td></tr><tr><td>Oligonucleotides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5' handle T7 forward</td><td>Microsynth</td><td>カスタムオーダー</td><td>5フィート- CTTAATACGACTCACTATAGGTC CTTTCTGTGGACGCC - 3', PCR 1</td></tr><tr><td>3' ハンドル リバース</td><td>マイクロシンセ</td><td>カスタム オーダー</td><td>5' -&nbsp;GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3', PCR 1 でOT in vitro転写テンプレートを生成するために使用</td></tr><tr><td>5' ハンドルフォワード</td><td>Microsynth</td><td>カスタムオーダー</td><td>5' - TCCTTTCTGTGGACGCCGC - 3' , PCR で 5' ハンドルを生成するために使用 2</td></tr><tr><td>5' ハンドルリバース</td><td>マイクロシンセ</td><td>カスタムオーダー</td><td>5' - CATAAATACCTCTTTACTAATATA TATACCTTCGTAAGCTAGCGT - 3', PCR 2 で 5' ハンドルを生成するために使用</td></tr><tr><td>3 'ハンドルフォワード</td><td>Microsynth</td><td>カスタムオーダー5</td><td>'-ATCCTGCAACCTGCTCTTCTCGCC AG - 3 '、PCRで3'ハンドルを生成するために使用されます</td></tr><tr><td>3 'ハンドルリバース5 'ジゴキシゲニンで標識</td><td>Microsynth</td><td>カスタムオーダー</td><td>5' -[Dig]-GTCAAAGTGCGCCCCGTTATCC - 3' で標識、PCRで3'ハンドルを生成するために使用 3</td></tr><tr><td>DNA vectorspMZ_OT</td><td></td><td></td><td></td></tr> で<tr><td></td>、<td>社内で製造された</td><td>N/A</td> 「<td>Structural studies of Cardiovirus 2A protein reveal the molecular basis for RNA recognition and translational control」 Chris H. Hill, Sawsan Napthine, Lukas Pekarek, Anuja Kibe, Andrew E. Firth, Stephen C. Graham, Neva Caliskan, Ian Brierley bioRxiv 2020.08.11.245035;土井:</td></tr> <tr><td>https://doi.org/10.1101/2020.08.11.245035Software and Algorithms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Atom</td><td>https://atom.io/packages/ide-python</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>Bluelake</td><td>Lumicks</td><td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>グラフパッド</td><td>https://www.graphpad.com/</td> <td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>InkScape 0.92.3</td><td>https://inkscape.org/</td> <td>該当なし</td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>https://www.mathworks.com/products/matlab.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>ポテト</td><td></td> https://github.com/lpekarek/POTATO.git <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>RNAstructure</td><td>https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructure.html</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Spyder</td><td>https://www.spyder-ide.org/</td> <td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>その他</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン被覆ポリスチレン粒子、1.5-1.9 &micro;m、5 ml、1.0% w/v</td><td>Spherotech</td><td>SVP-15-5</td><td></td></tr><tr><td>抗ジゴキシゲニン被覆ポリスチレン粒子、2.0-2.4 &micro;m、2 ml、0.1% w/v</td><td>Spherotech</td><td>DIGP-20-2</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>VWR</td><td>テルモ SS+03L1</td><td></td></tr><tr><td>Devices</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C-trap</td><td>Lumicks</td><td>N/A</td><td>&nbsp;共焦点顕微鏡と組み合わせた光ピンセット</td></tr></tbody></table>

翻訳調節におけるrna-タンパク質相互作用を研究する光ピンセット

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNAは、その機能に不可欠な多様な構造フォールドを採用しており、細胞内の多様なプロセスに影響を与える可能性があります。また、RNAの構造と機能は、タンパク質、代謝物、または他のRNAなどの様々な トランス作用因子によって変調することができます。例えば、フレームシフトRNA分子は、リボソームを別のオープンリーディングフレームに直接翻訳し、遺伝子スイッチとして機能するコード領域に位置する調節RNAです。彼らはまた、タンパク質または他の トランスファクターに結合した後に異なる折り目を採用することができます。翻訳におけるRNA結合タンパク質の役割と、RNAの構造と安定性を調節する方法を解剖するには、これらのRNA-タンパク質複合体の相互作用と機械的特徴を同時に研究することが重要です。この研究は、単分子蛍光結合光ピンセットを採用して、RNA-タンパク質複合体の立体構造および熱力学的景観を高解像度で探索する方法を示しています。一例として、SARS-CoV-2プログラムリボソームフレームシフトエレメントと、ジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質の 経作用因子短いアイソフォームとの相互作用が詳述される。さらに、蛍光標識リボソームを共焦点単位でモニタリングし、最終的に翻訳伸びの研究を可能にした。蛍光結合OTアッセイは、多様なRNAタンパク質複合体または翻訳を調節する トランス作用因子を探索するために広く適用することができ、RNAベースの遺伝子調節の研究を容易にする可能性があります。

このセクションでは、主に蛍光光ピンセットによるRNA-タンパク質/リガンド相互作用の測定に焦点を当てています。一般的なRNA光学ピンセット実験および対応する代表的な結果の説明については、32を参照してください。RNA/DNA-タンパク質相互作用の詳細については、1,26,59,60も参照してください。
原則として、RNA上のRBPまたは他の 任意の作用因子の結合は、分子の立体構造を安定化、不安定化、または変化させる可能性がある。以下に、各効果に対する機械的観測の描写を示す。しかし、所定のRNA-タンパク質複合体に対して実際に観察された効果は、これらの以下のシナリオに限定されない。
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このプロトコルは、光ピンセットを用いたRNAとタンパク質の相互作用を研究するための完全な実験的ワークフローを提示する。光ピンセットと共焦点顕微鏡の組み合わせを含むいくつかの可能な実験セットアップが概説されている。

翻訳調節におけるRNA-タンパク質相互作用を研究する光ピンセット

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

次の方法の記事の全体的な目標は、共焦点顕微鏡と結合された光ピンセットを用いて、タンパク質または他の因子とのRNA相互作用を研究するのに有用なプロトコルを実証することです。過去10年間で、単一の高分子の特性を調べるためのいくつかの洗練された技術が開発されました。これらの技術の1つは、単一分子光ピンセットである。新しい蛍光支援光ピンセットを使用すると、RNA分子の展開に必要な力だけでなく、翻訳中の結合事象も詳細に監視できます。ここでは、RNA分子が翻訳を調節する取引因子の有無にかかわらず伸ばされる測定に焦点を当てます。また、ラベル付きリボソームを用いた翻訳を監視する方法についても説明します。このプロトコルは、私のグループの2人の大学院生、ルーカス・ペカレクとステファン・パークによって実証されます。このビデオでは、光ピンセット実験のセットアップと実行について説明します。また、単純なデータ分析ワークフローの概要も説明します。この手法の利点は、簡単で堅牢な方法です。分子は2つのビーズの間につながれ、レーザービームの焦点に縛られ、変位時の変化と力は、いわゆるフォースランプ実験で正確に測定することができます。テザー内部の二次構造は、分子の内部エネルギーに応じてある程度の力で展開します。複数の構造間のこの動的な遷移は、一定の力の測定によってさらに調査することができる。さらに、蛍光イメージングの並列使用により、結合事象をリアルタイムで可視化することができます。テザーの明確な力距離プロファイルは、安定性に影響を与える潜在的な取引因子の結合後に変化する可能性があります。まず、目的のRNAをDNAベクターにクローン化する必要があります。この配列の上流および下流では、追加の部品、ハンドルがビーズ間の最終的なDNA-RNA構築物をテザーするために必要である。プラスミドのクローニングと増幅が成功した後、3つの異なるPCR反応が行われます。PCR反応ごとに、プロトコルの表1に従って試薬を混合します。適切なサーマルサイクラーで50マイクロリットルのアリコートでPCRを実行します。最初の1つは、その後のインビトロ転写のためのT7プロモーターを有する全構築物の二本鎖DNAをもたらす。2 番目の PCR では、5 つの素数ハンドルが生成されます。一方、最後の反応は3つの素数ハンドルで生じる。5素数および3素数ハンドルの両方が使用されるビーズに従ってラベル付けする必要があります。3つの素数ハンドルは、ジゴキシゲニン標識リバースプライマーを使用してPCR中に標識され、5つの素数ハンドルはビオチン化を通して余分なステップでラベル付けする必要があります。5つの素数ハンドルの3つのプライムビオチン化は、T40およびポリメラーゼを用いて行われる。反応は室温で1〜2時間行う。次に、T7ポリメラーゼを用いてインビトロ転写を行う。RNAの長さに応じて、反応を37度から4時間インキュベートします。最後の1つのステップでは、ハンドルは、二本鎖ハンドル間の関心のある単一鎖領域を有する最終的なDNARNA構築物を得るために、インビトロ転写からRNAでアニールされます。目的のRNA-DNAハイブリッドをアニールするには、ハンドルとRNAをアニーリングバッファーに混ぜます。熱、焼鈍混合物を85度まで10分間加熱し、サンプルをゆっくりと4度に冷却する。アニールサンプルを酢酸臼歯3ナトリウムの1/10体積と、氷冷エタノール3ボリュームと混合し、少なくとも1時間はマイナス80度のインキュベートを行います。サンプルを15,000 xgで4度で30分間遠心する。上清を捨て、ペレットを真空下で乾燥させます。再懸濁されたペレットの小さなアリコートは液体窒素で凍結され、使用されるまでマイナス80度に保たれる。まず注射器から漂白剤を取り出し、RNaseフリーウォーターの1mLを埋めます。0.5モルナトリウムチオ硫酸ナトリウムの50マイクロリットルを追加し、1つのバーでシステムを洗います。マイクロ流体システムは、システム内の気泡を避けるために、乾燥して実行することはありません注意してください。次に、残りのチオ硫酸ナトリウム溶液を廃棄し、注射器を新しいものに交換します。その後、RNaseフリー水の少なくとも0.5mLで再び洗浄します。機械の光学系をセットアップするには、目的に浸漬油を2滴入れます。フローセルを所定の位置に置き、液体がフローセルに触れるまで目的を上げます。その後、フローセルの上に浸漬油を2滴入れます。トラップステアリングユニットとトラッピングレーザーをオンにします。目的は、マシンの診断カメラのZファインダーツールを使用して調整されます。マイクロスクリューを回すことで、Z軸は第2と第3の反射の間のチャンバの中央に調節される。屈折リングが最大である場所。診断カメラをムーンモードに切り替え、トラップレーザーを約50%に減らしてから、凝縮器を下げ、約10個の光バンドが見える位置を調整します。測定室には5つのチャネルがあり、実験の前に、異なるセットアップの可能性を考慮する必要があります。単純なフォースランプ実験では、ビーズバッファビーズは便利なチャネル配置です。蛍光リボソームや取引因子などの第4化合物を用いた測定では、ビーズ緩衝因子はより良い配置ですが、ビーズを捕まえるのが難しくなります。アニール構造のアリコートは、3マイクロリットルADビーズ懸濁液、1マイクロリットルRNase阻害剤、および8マイクロリットルのアッセイバッファーを室温で10〜20分間インキュベートする。次いで、サンプルを500マイクロリットルアッセイバッファーで希釈し、それぞれのチャネルに入れます。第2種のビーズについては、0.8マイクロリットルのアッセイビーズをアッセイバッファーの1 mLと混合し、対応するチャネルに投与する。チャネルは開かれ、低い圧力で洗浄される。今、トラップレーザーをオンにします。ビーズをキャッチするには、レーザーが互いに離れて移動し、ADビーズがトラップ1に巻き込まれる。次に、ステージは SA ビーズ チャネルに移動し、ビードはトラップ 2 に捕らえます。ビーズを失うことを避けるため、または同じトラップで 2 つ目のビードをキャッチするために、ステージはバッファー チャネルに移動され、すべてのチャネルが閉じられます。バッファ内では、トラップキャリブレーションが実行されます。キャッチビードは、後続の測定のための視覚的なテンプレートとして設定する必要があります。類似性スコアは、比較可能性を保証するために、測定値間で90%以上に保つ必要があります。最後に、ビーズを近づけて、1つのテザーを捕まえることができます。これは、数秒間ビーズを近くに移動し、ゆっくりと再びビーズを出発します。テザー形成は、2つのビーズを互いに引き離した場合に測定力の増加をもたらす。テザーの数と品質は、伸縮高原を見つけ、軌道を自由に関節鎖またはワーム状の鎖モデルと比較することによって確認することができる。過延伸高原は、単一のテザーに対して50〜60ピコニュートンの間でなければなりません。蛍光測定を行うためには、ユニットと光ピンセットマシンの共焦点レーザーと光子数をオンにします。その後、所望の波長とソフトウェアインターフェースの励起レーザーをオンにし、蛍光色素に応じてレーザーのパワーを5%以上に設定します。ソフトウェアの画像または動体機能を使用してイメージングを開始できるようになりました。焦点を合わせた画像を得るためには、共焦点顕微鏡と光学トラップの焦点面が揃っていることを確認してください。この目的のために、青色レーザーチャネルにおけるポリスチレンビーズの自己蛍光を採用することができる。ビーズの自己蛍光が最高径になるまで、光トラップの焦点面で上下に移動します。この位置では、テザーリングされた分子で起こる蛍光信号を検出することができます。どちらの機能でも、適切な領域を選択することが重要です。測定バッファー組成物全体を通して、ビーズを異なるチャネルに移動するか、マイクロ流体システムで供給されるバッファーを変更することによって容易に変更できます。光の消光を避けるために、測定しない場合は必ず励起レーザーをオフにしてください。デバイスからの生データ出力には、多くの場合、多くのノイズが含まれています。したがって、散乱データをさらに解析するために、まずそれらを事前処理する必要があります。最初のステップは、ローパスバターワースフィルターでデータをダウンサンプルしてフィルタリングし、良好な結果が得られた。フォースランプ実験では、最初の距離曲線の折り畳まれた展開された領域で展開イベントをマークする必要があり、ワームのようなチェーンまたは自由にジョイントされたチェーンモデルを使用して取り付けることができます。一定力データでは、時間の経過に対する距離をプロットすることができ、特定の力で優勢な立体構造を定量化するためにヒストグラムを生成することが有用です。ここでは、フィルタパラメータが異なる折りたたみ状態を区別するために重要であることを示しています。この手法で何が達成できるかをより深く理解するために、いくつかの代表的な結果が示されています。これは、フォースランプ実験からの標準的な力距離曲線がどのように見えるかです。この場合、SARS-コロナウイルス-2フレームシフトエレメントを研究した。我々は、15ピコニュートンの周りの複数のステップで展開を観察した。方向が反転し、ビーズが再び近づいているとき、テザーはわずかに低い力で折り返します。ジンクフィンガー抗ウイルスタンパク質ZAPの存在下で同じRNAを測定した場合、同様の展開パターンが観察された。しかし、RNAの二次構造は再折り畳み出さなかった。これは、タンパク質結合がRNAキネティクスにどのような大きな影響を与えることができるかを示す良い例です。一定の力のデータを見ると、展開するキネティクスをさらに調査することができます。時間経過に対する距離は異なる力に対してプロットされ、異なる観測状態のヒストグラムが右側に追加されます。10ピコニュートンでは、RNAは完全に折り畳まれた状態にある。11.5ピコニュートンでは状態間を切り替え、13ピコニュートンではRNAは永久に展開された状態にある。しかし、SARS-コロナウイルス-2フレームシフトエレメントをZAPと一緒に測定すると、RNAは11ピコニュートンで完全に展開状態にあり、10ピコニュートンで折り畳まれた状態に向かってほとんど移行を示さなかった。これは、ZAP が単一のフレームシフト要素に結合し、二次構造の形成を防止することを示します。最後に、光ピンセットデータと共焦点顕微鏡を組み合わせたものを見ていい。本実験では、二本鎖核酸に標識する蛍光色素を用いたが、特に増加力を伴う。キモグラフは、ビーズが互いに離れて移動するにつれて、蛍光強度が増加し、テザーが伸び過ぎて壊れると完全に消失することを示しています。最後の図では、蛍光標識リボソームをチャネル4を介して添加した。本実験では、RNAテザーに特異的にリボソーム結合が認められた。このビデオが光ピンセットとこの信じられないほどのテクニックを実行できるものについての洞察を与えた願っています。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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翻訳調節におけるRNA-タンパク質相互作用を研究する光ピンセット

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