分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

このプロトコルに記載されている脂質二重層膜の構築は、医薬品、環境毒性物質、さらには生物学的化合物との膜相互作用に関する重要な情報を得るために使用することができる。これらの技術は、様々な液体の複雑さの膜を製造するために使用され、膜内の化合物の透過性、吸収、および埋め込みを評価するために使用することができます。まず、脂質ストック溶液の適切な量をクリーンガラスのvileに加え、水分補給後に1ミリリットル当たり2.5ミリグラムの最終小胞濃度を達成します。

窒素ガスの流れを用いて、脂質溶液からクロロホルムを除去する。クロロホルムを完全に除去するために、乾燥した脂質膜を真空に少なくとも4時間接続します。乾燥した脂質膜をトリスナトリウムクロリドバッファーの必要量で水分補給し、1ミリリットル当たり2.5ミリグラムの最終小胞濃度を得るために、約15〜30秒間渦を生じさせる。

ベシクル懸濁液をドライアイス付きの容器に移し、約30分間凍結します。試料を完全に凍結した後、30〜40度の摂氏水浴で懸濁液を解凍する。解凍された小胞懸濁液を渦。

1ミリリットル以下の小胞を作るためには、ミニ押出機を入手する。フィルターサポートを超純水で予め濡らし、その後、Oリング内の膜支持面に置きます。2番目の内部膜支持について繰り返します。

押出機の外側のケーシングに1つの内部膜支持体を置く。100ナノメートルのポリカーボネート膜を、フィルター支持体の上に直接内部膜支持体に置きます。第2の内部膜支持体を、ポリカーボネート膜に面したOリングとフィルター支持側の押出機外ケースに配置します。

ポリテトラフルオロエチレンベアリングをリテーナーノットに取り付け、押出機の外枠で締めます。押出機を加熱ブロックにクリップします。脂質小胞懸濁液を注射器の1つにロードし、注射器を押出機のヒートブロックに配置し、針を押出機の一端に完全に挿入します。

2番目の空のシリンジを反対側に挿入し、ヒートブロックのアームクリップを使用して両方のシリンジをロックします。小胞の懸濁液を空のシリンジにゆっくりと押し込み、元のシリンジに戻します。ポリカーボネート膜を通過する合計21回に対してさらに20回繰り返します。

脂質小胞を清潔なガラスの下に移して保管してください。5~50ミリリットルの小胞を押し出すために、大きな穴スクリーン支持体、中央のディスク、ドレインディスク、ポリカーボネート膜を押出し下げ支持体のスペースに配置して大きな押出機を組み立てます。4本のネジを使用して押出機の上下支持を接続し、締め付けします。

押出機ユニットをサンプルシリンダーに取り付け、底部にスクラブし、レンチで締めて固定します。サンプルシリンダーに超純水を充填し、サンプルをサンプルシリンダーに追加する前に、押出機ユニットを通して水を押し出します。脂質ベシクル懸濁液をサンプルシリンダーに加え、上部を閉じます。

サンプルが1秒あたり約2〜3滴の速度で押出機ユニットから滴り始めるまで、ゆっくりと圧力を高め、きれいなガラスの下品に入ります。すべてのサンプルが押し出されたら、窒素供給をオフにし、圧力リリーフバルブをゆっくりと開けてサンプルシリンダーの圧力を解放します。脂質小胞をサンプルシリンダーに戻し、前のステップをさらに9回繰り返して合計10回の押出を行います。

ベシクル懸濁液を適切なキュベットに積み込み、動的光散乱計に挿入し、サンプルの詳細を入力し、関連するソフトウェアを使用して測定を行います。ゼタセルをサンプルチャンバに入れ、電極が接触していることを確認し、サンプルホルダーの蓋を閉じます。関連ソフトウェアで、サンプルの詳細を入力し、測定値を収集します。

シリカコード化された水晶センサーをフローモジュールに挿入し、結晶上のT字型がモジュールのT形状と一致していることを確認し、フローモジュールを閉じます。複数のチャンバーを備えた機器では、追加の二重層を並列に形成することができます。流入口と出口チューブをフローモジュールとポンプに接続します。

チューブを保持ガードに入れ、アナライザーシステムの蓋を閉じます。ポンプの出口に廃棄物容器を置き、使用済みのソリューションを収集します。クリーニングを行う場合は、まずポンプをオンにし、流速を毎分400マイクロリットルに設定します。

入口チューブを超純水に挿入し、モジュールを通して5〜10ミリリットルを流します。チューブをSDSに切り替え、モジュールを通して5〜10ミリリットルを流します。チューブを超純水に戻し、モジュールを通して10〜20ミリリットルを流します。

最後に、残りの溶液が回収されなくなるまで、モジュールを通して空気を流します。フローモジュールからセンサーを取り外し、超純水でセンサーをすすきます。センサーとフローモジュールを窒素ガス流で駆動し、電極が常に液体を使い果たさないようにします。

化学ヒュームフードで、シリカコーティングされた水晶センサーを紫外線またはオゾン洗浄器具に挿入します。器械をオンにし、少なくとも2分間の処置を許可する。センサーを慎重に取り外し、フローモジュールに戻します。

アナライザー装置をオンにして、関連するソフトウェアを接続し、支持脂質二重層を形成するための所望の値に温度を設定します。温度が目的の入力に安定するようにします。測定を構成し、すべてのセンサ共振周波数を検出し、測定を開始する前に、倍音3、5、7、9、11、および13の放散を検出します。

トリス塩化ナトリウムがモジュールを5〜10分間流れ、ベースライン周波数変化またはデルタFおよび液体中の散逸変化またはデルタD値が安定していることを確認します。ポンプを停止し、トリス塩化ナトリウム溶液から入口チューブを取り出し、慎重に脂質ベシクル溶液に挿入します。流入口チューブから気泡を取り除き、次に前進流を続けるために5秒間逆流します。

ベースラインをゼロにしてソフトウェアの測定を再開します。データ取得ソフトウェアにおいて二重層形成がリアルタイムに観察されるまでのフロー脂質小胞。次に、このステップを繰り返して、入口チューブを脂質小胞からトリス塩化ナトリウムバッファーに戻します。

脂質溶液の5マイクロリットルをドナーコンパートメントに加え、これは、0.45マイクロメートルの細孔サイズを有する多孔性ポリビニリデンジフッ化96ウェルのマルチスクリーンフィルタープレートである。すぐにフィルタープレートをアクセプタコンパートメントに沈め、リン酸緩衝生理食塩水の300マイクロリットルを含む輸送受信機プレートである。リン酸緩衝生理食塩水を200マイクロリットルの輸送ドナーコンパートメントに加えます。

ポンプを停止し、入口チューブを脂質ベシクル溶液に変更し、二重層形成を観察する前の手順に従い、次に入口チューブをアルファヘリカルまたはAHペプチド溶液に変更します。新しいソリューションの追加から周波数変化と散逸変化が観察されるまで、フローモジュールにソリューションを導入します。ポンプを停止し、AHペプチドが10分間小胞でインキュベートできるようにします。

入口チューブをトリス塩化ナトリウムに切り替え、破裂した小胞からAHペプチドを除去する流れを開始し、脂質二重層の形成に成功する。まず、分子溶媒を流し、次に、インレットチューブを、目的の分子を含む溶液に切り替え、少なくとも5分間流れる。必要に応じて、流れを停止し、目的の分子を含む液体を二重層と共にインキュベートすることを可能にする。

入口チューブを分子溶媒だけに戻します。少なくとも5分間流れ、次に入口チューブを塩化トリスナトリウムに切り替え、少なくとも5分間流します。ソフトウェアで、測定を停止し、ファイルを保存して、ポンプを停止します。

ユニ脂質懸濁二重層またはマルチ脂質懸濁二重層の直前の手順の直後に、ドナーフィルタープレートコンパートメントからPBSを取り除き、200マイクロリットルの試験溶液に置き換えます。すぐに300マイクロリットルのPBSを備えた新しい輸送受信機プレートに沈水する。摂氏25度で2時間穏やかな揺れでインキュベーションした後、ドナーとアクセクサコンパートメントから溶液の150マイクロリットルを収集します。

この分子の特性に基づいて適切な方法を用いて、両方のサンプル中の分子濃度を測定する。サイズ、多分散性、および、ユニリピッドエッグPC小胞のゼータ電位、および2つの多脂質小胞組成物を比較した。卵PC小胞と多脂質1小胞のサイズ分布はほぼ同じであった。

卵とPCの両方の多脂質1小胞は負に電荷を帯び、多脂質2小胞は正に荷電した。ユニリピッドエッグPC小胞は、周波数変化の減少、および散逸変化の増加、続いて自発的破裂の増加によって示されるように、表面に容易に吸収される。多脂質小胞は、表面に吸収され、小胞を破裂させるためにAHペプチドの添加を必要とするが、脂質二重層形成をもたらす。

脂質二重層をサポートすることで、周波数変化と散逸変化を、対象化合物の導入前後で分析することができます。例えば、DEHPと環境毒性物質と支持されたユニとの相互作用と層による多層化を調査した。同様のレベルのDEHP吸収が両方の脂質二重層タイプについて観察された。

しかし、卵PC二重層に対して見られる大きな散逸変化を有する二重層間では、散逸変化の違いが、マルチ脂質1二重層と比較して観察された。ユニおよびマルチ脂質1つの二重層の両方について、ほとんど透過が認められなかった。この手順に従って、脂質二重層を模倣する様々な細胞を開発して、医薬品から環境毒性物質に至るまでの化合物との分子相互作用を無細胞でスクリーニングできるようにすることができる。