アレルギー診断のための好塩基球活性化試験

好塩基球活性化試験は、薬物、食品、または吸入剤、および一部の形態の慢性蕁麻疹によって引き起こされる反応に有用であることが示されているIgEを介したアレルギー反応を評価するための無料の体外診断試験です。.この試験は、フローサイトメトリーによる活性化マーカーの測定を通じて、アレルゲンまたは薬物架橋IgE活性化に対する好塩基球応答を決定することに基づいています。好塩基球活性化試験は、特に重度の生命を脅かす反応を経験している被験者において、アレルギー診断を確認するための制御されたチャレンジ試験を回避するための有用で補完的なツールとなり得る。

さらに、この試験は、少数の薬物およびアレルゲンに対してのみ利用可能な他のin vitro方法と比較して、任意の薬物またはアレルゲンに対する反応を分析できるという利点を有する。テストの主な制限は、特に薬物アレルギーにおける最適でない感度に関連しています。サンプル抽出後24時間以内にテストを実行する必要性と、ラボと診断アルゴリズムの間の標準化の欠如。

まず、9ミリリットルのヘパリン化チューブで末梢血を収集し、サンプルをローターに入れて、実験プロトコルに必要になるまで室温に維持します。ネガティブコントロールとポジティブコントロールのためにそれぞれ2つの5ミリリットルサイトメーターチューブにラベルを付けます。また、テスト対象の異なるアレルゲンまたは薬物濃度について、それぞれ1本のチューブにラベルを付けます。

次に、チューブが滑らずに完全にフィットするように、チューブをラックに入れます。最初の陽性対照のために、好塩基球の品質を確認するために、0.05%PBS-T中のN-ホルミルメチオニル-ロイシル-フェニルアラニンまたはfMLPの4マイクロモル溶液を調製します。2番目のポジティブコントロールでは、PBS-Tを使用して1ミリリットルあたり0.05ミリグラムの抗IgE溶液を調製します。

刺激バッファー20マイクロリットルあたりCCR3-APC、CD203c-PE、およびCD63-FITC抗体をそれぞれ1マイクロリットル添加することにより、染色ミックスを調製します。次に、この染色ミックスを23マイクロリットル各チューブに追加します。ネガティブコントロールチューブに100マイクロリットルのPBS-Tを追加します。

100マイクロリットルのfMLPをポジティブコントロールチューブの1つに追加し、もう1つのチューブに100マイクロリットルの抗IgE Eを追加します。異なるアレルゲンまたは薬物濃度の100マイクロリットルを加え、摂氏37度で10分間インキュベートします。インキュベーション後、溶血を避けるために各チューブに100マイクロリットルの血液を穏やかに追加します。

次に、チューブを静かにボルテックスし、中程度の攪拌を伴う恒温槽で摂氏37度で25分間インキュベートします。脱顆粒を止めるために、チューブを摂氏4度に少なくとも5分間保ちます。各チューブに、赤血球を溶解するために2ミリリットルの溶解バッファーを追加します。

各チューブをボルテックスし、室温で5分間チューブをインキュベートします。チューブを摂氏4度で300gで5分間遠心分離します。次に、ラックをシンクにひっくり返して、細胞がチューブの底に残っている間に上清をデカントします。

各チューブに3ミリリットルのPBS-Tを加えて細胞を洗浄し、チューブをボルテックスします。同じパラメータセットを使用して2回目の遠心分離を実行し、ラックをシンクにひっくり返して上清をデカントします。その後、フローサイトメトリーまでサンプルを摂氏4度に保ち、光から保護します。

フローサイトメーターをコンピューターソフトウェアに接続し、サイトメーターの準備ができるまで待ちます。テンプレートと楽器の設定を、テキスト原稿の説明に従ってロードします。サンプル取得のプロセスを開始します。

活性化好塩基球を選択するには、まず、側方散布図-前方散布図からリンパ球をゲートします。次に、リンパ球集団から好塩基球をCCR3 + CD203c +細胞としてゲートし、チューブあたり少なくとも500個の好塩基球を獲得します。ネガティブコントロールチューブを使用してCD63閾値を約2.5%に設定し、サンプルを分析します。

IgE依存性過敏反応は、アレルゲンと薬物を用いて好塩基球活性化試験(BAT)を行うことによって調査されました。好塩基球感受性は、50%好塩基球またはEC50の反応を誘発するアレルギー濃度を決定するのに役立つ複数の減少するアレルゲン濃度での反応性を測定することによって分析されました。まず、リンパ球を側方散乱-前方散布図からゲーティングした。

次に、好塩基球をリンパ球集団からCCR3 + CD203c +細胞としてゲーティングしました。次に、CCR3-CD63プロットを使用して、CD63を2つの薬物および異なる濃度のアレルゲンの活性化マーカーとして使用して好塩基球の活性化を分析しました。検査は新鮮な全血で行われ、採血後24時間以内に実施する必要があります。

試験で使用される刺激には賦形剤が含まれていてはならず、薬物の化学的特性を考慮する必要があります。IgE媒介アレルギー反応の診断、またはsIgEの測定、またはヒスタミン放出試験のための他の追加のインビトロ方法。