Name: マウスのカルシウム過渡研究のためのベースメッキと対物レンズで事前に固定されたミニスコープの使用 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: 学ぶマウスのカルシウム過渡研究のためのベースメッキと対物レンズで事前に固定されたミニスコープの使用方法。歯科用セメントの収縮によるミスアライメントを最小限に抑え、深部脳領域での安定した蛍光イメージングを実現します。

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<ol><li>Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+activity+with+genetically+encoded+calcium+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal activity with genetically encoded calcium indicators.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), 647-656 (2012).</li>
<li>Grienberger, C., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+calcium+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging calcium in neurons.</a> Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Campos, P., Walker, J. J., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diving+into+the+brain%3A+deep-brain+imaging+techniques+in+conscious+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Diving into the brain: deep-brain imaging techniques in conscious animals.</a> Journal of Endocrinology. 246 (2), 33-50 (2020).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nature Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>de Groot, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NINscope%2C+a+versatile+miniscope+for+multi-region+circuit+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations.</a> Elife. 9, 49987(2020).</li>
<li>Aharoni, D., Hoogland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circuit+investigations+with+open-source+miniaturized+microscopes%3A+past%2C+present+and+future%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Circuit investigations with open-source miniaturized microscopes: past, present and future.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 141(2019).</li>
<li>Resendez, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+cortical%2C+subcortical+and+deep+brain+neural+circuit+dynamics+during+naturalistic+mammalian+behavior+with+head-mounted+microscopes+and+chronically+implanted+lenses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with head-mounted microscopes and chronically implanted lenses.</a> Nature Protocols. 11 (3), 566-597 (2016).</li>
<li>Aharoni, D., Khakh, B. S., Silva, A. J., Golshani, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+the+light+that+we+can+see%3A+a+new+era+in+miniaturized+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All the light that we can see: a new era in miniaturized microscopy.</a> Nature Methods. 16 (1), 11-13 (2019).</li>
<li>Lee, H. S., Han, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+in+vivo+calcium+imaging+with+a+head-mount+miniaturized+microscope+in+the+amygdala+of+freely+behaving+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Successful in vivo calcium imaging with a head-mount miniaturized microscope in the amygdala of freely behaving mouse.</a> Journal of Visualized Experiments. (162), e61659(2020).</li>
<li>Cai, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shared+neural+ensemble+links+distinct+contextual+memories+encoded+close+in+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A shared neural ensemble links distinct contextual memories encoded close in time.</a> Nature. 534 (7605), 115-118 (2016).</li>
<li>Chen, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothalamic+switch+for+REM+and+Non-REM+sleep%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A hypothalamic switch for REM and Non-REM sleep.</a> Neuron. 97 (5), 1168-1176 (2018).</li>
<li>Shuman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakdown+of+spatial+coding+and+interneuron+synchronization+in+epileptic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice.</a> Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).</li>
<li>Jimenez, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anxiety+cells+in+a+hippocampal-hypothalamic+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Anxiety cells in a hippocampal-hypothalamic circuit.</a> Neuron. 97 (3), 670-683 (2018).</li>
<li>Hart, E. E., Blair, G. J., O'Dell, T. J., Blair, H. T., Izquierdo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemogenetic+modulation+and+single-photon+calcium+imaging+in+anterior+cingulate+cortex+reveal+a+mechanism+for+effort-based+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Chemogenetic modulation and single-photon calcium imaging in anterior cingulate cortex reveal a mechanism for effort-based decisions.</a> Journal of Neuroscience. , 2548(2020).</li>
<li>Gulati, S., Cao, V. Y., Otte, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-layer+cortical+Ca2%2B+imaging+in+freely+moving+mice+with+prism+probes+and+miniaturized+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multi-layer cortical Ca2+ imaging in freely moving mice with prism probes and miniaturized fluorescence microscopy.</a> Journal of Visualized Experiments. (124), e55579(2017).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniscope+GRIN+lens+system+for+calcium+imaging+of+neuronal+activity+from+deep+brain+structures+in+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Miniscope GRIN lens system for calcium imaging of neuronal activity from deep brain structures in behaving animals.</a> Current Protocols in Neuroscience. 86 (1), 56(2019).</li>
<li>Corder, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amygdalar+neural+ensemble+that+encodes+the+unpleasantness+of+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An amygdalar neural ensemble that encodes the unpleasantness of pain.</a> Science. 363 (6424), 276-281 (2019).</li>
<li>Liberti, W. A., Perkins, L. N., Leman, D. P., Gardner, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open+source%2C+wireless+capable+miniature+microscope+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neural+Engineering%22%5BJournal%5D)">An open source, wireless capable miniature microscope system.</a> Journal of Neural Engineering. 14 (4), 045001(2017).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MIN1PIPE%3A+A+miniscope+1-photon-based+calcium+imaging+signal+extraction+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">MIN1PIPE: A miniscope 1-photon-based calcium imaging signal extraction pipeline.</a> Cell Reports. 23 (12), 3673-3684 (2018).</li>
<li>Giovannucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaImAn+an+open+source+tool+for+scalable+calcium+imaging+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">CaImAn an open source tool for scalable calcium imaging data analysis.</a> Elife. 8, 38173(2019).</li>
<li>Lee, A. K., Manns, I. D., Sakmann, B., Brecht, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+recordings+in+freely+moving+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Whole-cell recordings in freely moving rats.</a> Neuron. 51 (4), 399-407 (2006).</li>
<li>Burger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+AAV+viral+vectors+pseudotyped+with+viral+capsids+from+serotypes+1%2C+2%2C+and+5+display+differential+efficiency+and+cell+tropism+after+delivery+to+different+regions+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Recombinant AAV viral vectors pseudotyped with viral capsids from serotypes 1, 2, and 5 display differential efficiency and cell tropism after delivery to different regions of the central nervous system.</a> Molecular Therapy. 10 (2), 302-317 (2004).</li>
<li>Royo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+AAV+serotypes+stably+transduce+primary+hippocampal+and+cortical+cultures+with+high+efficiency+and+low+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Specific AAV serotypes stably transduce primary hippocampal and cortical cultures with high efficiency and low toxicity.</a> Brain Research. 1190, 15-22 (2008).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Ziv, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+dynamics+of+CA1+hippocampal+place+codes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes.</a> Nature Neuroscience. 16 (3), 264-266 (2013).</li>
<li>Gargiulo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mice+anesthesia%2C+analgesia%2C+and+care%2C+Part+I%3A+anesthetic+considerations+in+preclinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Mice anesthesia, analgesia, and care, Part I: anesthetic considerations in preclinical research.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (1), 55-69 (2012).</li>
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これは業界が支援する研究ではありません。著者らは、金銭的利益相反は報告していない。

本報告では、2レンズUCLAミニスコープシステムを使用する研究者向けの詳細な実験プロトコルについて説明します。私たちのプロトコルで設計されたツールは、 in vivo カルシウムイメージングを試したい研究室にとって比較的手頃な価格です。ウイルス注入、レンズ埋め込み、ダミーベースメッキ、ベースメッキなどの一部のプロトコルは、カルシウムイメージングの成功率を向上させるために、ミニスコープシステムの他のバージョンにも使用できます。ウイルス注入に関する一般的な問題、およびミニスコープのバージョンに関係なく修正する必要があるレンズ埋め込みの他に、UCLAベースプレートの構造は位置シフトを引き起こす可能性があり、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離の不一致につながる可能性があります(図1C)。2つのレンズの位置シフトを最小限に抑えるために、修正された実験プロトコルが開発されました(図2、図 4、 図5)。カルシウムイメ...

蛍光活性レポーターは、感度が高く、ダイナミックレンジが大きいため、ニューロン活動のイメージングに最適です1,2,3。そのため、蛍光顕微鏡を使用して神経活動を直接観察する実験が増えています1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。最初の小型化された一光子蛍光顕微鏡(ミニスコープ)は、2011年にMark Schnitzerらによって設計されました5。このミニスコープにより、研究者は自由に行動する動物5の小脳細胞の蛍光ダイナミクスをモニターできます(つまり、動物への身体的拘束、頭部拘束、鎮静、または麻酔なし)。現在、この技術は、皮質6,8,15,16などの表在脳領域を監視するために適用することができる。背海馬8,11,13,14および線条体6,17などの皮質下領域。腹側海馬14、扁桃体10,18、視床下部8,12などの脳深部領域。
近年、いくつかのオープンソースのミニスコープが開発されています4,5,6,7,11,13,17,19.ミニスコープは、カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームが提供する段階的なガイドラインに従っていれば、研究者が経済的に組み立てることができます。4,7,11,13.神経活動の光学的モニタリングは光透過の限界によって制限されるため7 関心のあるニューロン集団との間で、リレーGRINレンズ(またはリレーレンズ)から中継される視野を拡大するために、対物レンズ勾配屈折率(GRIN)レンズ(または対物レンズ)をミニスコープの下部に事前に固定する必要があるミニスコープが設計されました。6,7,8,10,16,17.このリレーレンズは、標的脳領域の蛍光活動がリレーレンズの表面に中継されるように、標的脳領域に埋め込まれる。6,7,8,10,16,17.正弦波周期の約1/4の光が対物レンズ(~0.25ピッチ)を通過します(図 1A1)、拡大蛍光画像が得られます6,7.対物レンズは必ずしもミニスコープの下部に固定されているわけではなく、リレーレンズの埋め込みも必要ありません。6,7,11,13,15.具体的には、ミニスコープに固定された対物レンズと脳に埋め込まれたリレーレンズの2つの構成があります。8,10,12,14,16 (図 1B1)と取り外し可能な対物レンズだけの別のレンズ6,7,11,13,15 (図 1B2).固定対物レンズと埋め込み型リレーレンズの組み合わせに基づく設計では、脳からの蛍光信号がリレーレンズの上面に運ばれます(図 1A1)7,8,10,12,14,16.その後、対物レンズは、リレーレンズの上面から視野を拡大して透過させることができます(図 1A2).一方、取り外し可能な対物レンズGRINレンズの設計はより柔軟であるため、脳へのリレーレンズの事前埋め込みは必須ではありません(図 1B2)6,7,11,13,15.取り外し可能な対物レンズ設計に基づくミニスコープを使用する場合、研究者はターゲットの脳領域にレンズを埋め込む必要がありますが、対物レンズを埋め込むこともできます6,7,11,13,15 または脳内のリレーレンズ6,7.移植用の対物レンズまたはリレーレンズの選択によって、研究者が使用しなければならないミニスコープの構成が決まります。たとえば、V3 UCLAミニスコープは、取り外し可能な対物レンズGRINレンズ設計に基づいています。研究者は、関心のある脳領域に対物レンズを直接埋め込み、「空の」ミニスコープを対物レンズに取り付けるかを選択できます。6,7,11,13,15 (一眼システム; 図 1B2)または、脳にリレーレンズを埋め込み、対物レンズで事前に固定されたミニスコープを取り付ける6,7 (2レンズシステム; 図 1B1).次に、ミニスコープは蛍光カメラとして機能し、遺伝的にコードされたカルシウムインジケーターによって生成されたニューロン蛍光のライブストリーム画像をキャプチャします1,2,3.ミニスコープをコンピュータに接続すると、これらの蛍光画像をコンピュータに転送し、ビデオクリップとして保存できます。研究者は、いくつかの分析パッケージで蛍光の相対的な変化を分析することにより、ニューロン活動を研究できます20,21 または、将来の分析のためにコードを記述します。
V3 UCLAミニスコープは、ユーザーが1レンズまたは2レンズシステムでニューロン活動を画像化するかどうかを決定できる柔軟性を提供します7。記録システムの選択は、ターゲット脳領域の深さとサイズに基づいています。簡単に言うと、1レンズシステムは、メーカーが特定のサイズの対物レンズしか製造していないため、表面的(深さ約2.5 mm未満)で比較的大きい(約1.8 x 1.8 mm2より大きい)領域しか撮像できません。対照的に、2レンズシステムは、任意のターゲット脳領域に適用できます。しかし、地板を接着するための歯科用セメントは、対物レンズとリレーレンズの距離が変わるとズレが発生しやすく、画質が低下します。2レンズシステムを使用する場合、最適な画像品質を達成するために、2つの作動距離を正確にターゲットにする必要があります(図1A)。これらの2つの臨界作動距離は、ニューロンとリレーレンズの底面の間、およびリレーレンズの上面と対物レンズの底面の間です(図1A1)。レンズの位置がずれたり、作動距離外にずれたりすると、イメージングに失敗します(図1C2)。対照的に、ワンレンズシステムは1つの正確な作動距離しか必要としません。しかし、対物レンズのサイズは、脳深部領域のモニタリングへの用途を制限します(ミニスコープに適合する対物レンズは約1.8~2.0mmです6,11,13,15)。したがって、マウス11、13における皮質6、15および背角アンモニス1(CA1)などの表面および比較的大きな脳領域の観察のための対物レンズの移植は制限される。さらに、背側CA1を標的とするために皮質の広い領域を吸引する必要があります11,13。脳深部領域のイメージングを妨げる1レンズ構成の制限により、市販のミニスコープシステムは対物レンズ/リレーレンズ(2レンズ)を組み合わせた設計のみを提供します。一方、V3 UCLAミニスコープは、対物レンズが取り外し可能であるため、1レンズまたは2レンズのいずれかのシステムに変更することができます6,11,13,15。つまり、V3 UCLAミニスコープのユーザーは、脳の表面観察(深さ2.5 mm未満)を含む実験を行うときに、脳に埋め込む(ワンレンズシステムを作成する)、またはミニスコープに事前に固定してリレーレンズを脳に埋め込む(2レンズシステムを作成する)ことで、取り外し可能なレンズを利用できます。 脳深部観察を含む実験を行う場合。2レンズシステムは脳の表面観察にも適用できますが、研究者は対物レンズとリレーレンズの間の正確な作動距離を知っている必要があります。1レンズシステムの主な利点は、2レンズシステムで最適な画像品質を達成するために正確にターゲットを絞る必要がある2つの作動距離があることを考えると、2レンズシステムよりも作動距離を逃す可能性が低いことです(図1A)。したがって、表面的な脳の観察にはワンレンズシステムを使用することをお勧めします。ただし、実験で脳深部でのイメージングが必要な場合、研究者は2つのレンズのずれを回避することを学ぶ必要があります。
実験用ミニスコープの2レンズ構成の基本プロトコルには、レンズの埋め込みとベースメッキが含まれます8,10,16,17。ベースプレーティングとは、ベースプレートを動物の頭に接着して、ミニスコープを最終的に動物の上に取り付け、ニューロンの蛍光信号をビデオテープに収めることです(図1B)。この手順では、歯科用セメントを使用してベースプレートを頭蓋骨に接着しますが(図1C)、歯科用セメントの収縮は、埋め込まれたリレーレンズと対物レンズの間の距離に許容できない変化を引き起こす可能性があります8,17。2つのレンズ間の距離が大きすぎると、セルに焦点を合わせることができません。
ミニスコープを用いた脳深部カルシウムイメージング実験の詳細なプロトコルはすでに公開されています8,10,16,17.これらのプロトコルの作成者は、Inscopixシステムを使用しています8,10,16 または他のカスタマイズされたデザイン17 ウイルスの選択、手術、およびベースプレートの付着に関する実験手順について説明しました。ただし、それらのプロトコルは、V3 UCLAミニスコープシステム、NINscopeなどの他のオープンソースシステムに正確に適用することはできません。6、およびフィンチスコープ19.2つのレンズのミスアライメントは、ベースプレートを頭蓋骨にセメントで固定するために使用される歯科用セメントの種類が原因で、UCLAミニスコープを使用した2レンズ構成での記録中に発生する可能性があります。8,17 (図 1C).本プロトコルが必要なのは、埋込まれたリレーレンズと対物レンズの間の距離が、ベースプレーティング手順中の歯科用セメントの望ましくない収縮のためにシフトする傾向があるためです。ベースプレーティングでは、ミニスコープとリレーレンズの上部の間の距離を調整して、埋め込まれたリレーレンズと対物レンズの間の最適な作動距離を見つける必要があり、この理想的な位置にベースプレートを接着する必要があります。対物レンズと埋め込みリレーレンズの正しい距離を設定すると、セル分解能(図 1B; in vivo 録音)。リレーレンズの作動距離の最適範囲が小さいため(50〜350μm)4,8、硬化中の過度のセメント収縮は、対物レンズと埋め込みリレーレンズを適切な範囲内に保つことを困難にする可能性があります。このレポートの全体的な目標は、収縮の問題を減らすためのプロトコルを提供することです。8,17 ベースプレーティング手順中に発生し、2レンズ構成での蛍光信号のミニスコープ記録の成功率を高めます。成功したミニスコープ記録は、自由に行動する動物における個々のニューロンの蛍光の顕著な相対的変化のライブストリームの記録として定義されます。歯科用セメントのブランドが異なれば収縮率は異なりますが、研究者は以前にテストされたブランドを選択できます6,7,8,10,11,12,13,14,15,16,22.ただし、一部の国/地域では、医療材料の輸入規制により、すべてのブランドを簡単に入手できるわけではありません。したがって、利用可能な歯科用セメントの収縮率をテストする方法を開発し、重要なことに、収縮の問題を最小限に抑える代替プロトコルを提供します。現在のベースプレーティングプロトコルに対する利点は、実験室で簡単に入手できるツールとセメントを使用したカルシウムイメージングの成功率の向上です。例としてUCLAミニスコープが使用されますが、プロトコルは他のミニスコープにも適用できます。このレポートでは、最適化されたベースメッキ手順について説明し、UCLAミニスコープ2レンズシステム(図 2A).UCLAミニスコープを使用した2レンズ構成の移植成功例(n=3匹)と移植失敗例(n=2匹)を、成功と失敗の理由について議論とともに紹介します。

<table><tbody><tr><td>0.7 mmドリルビット</td><td>&nbsp;#19008-07</td><td>ファインサイエンスツール;手術</td><td>のための</td>米国</tr><tr><td>0.1&ndash;10 &mu;lピペットチップ</td><td>104-Q;QSP</td><td>フィッシャーサイエンティフィック;歯科</td><td>用セメント</td></tr><tr><td>20 G IVキャター</td>の試験のためのシンガポール <td>#SR-OX2032CA</td><td>テルモコーポレーション;東京、日本</td><td>、手術用</td></tr><tr><td>27 G ニードル</td><td>AGANI、AN*2713R</td><td>テルモ株式会社;東京、日本</td><td>外科用</td></tr><tr><td>AAV9-syn-jGCaMP7s-WPRE#</td><td>104487-AAV9; 1.5*10^13</td><td>Addgene viral prep;マサチューセッツ州、ウイルス</td><td>注射用</td></tr><tr><td>米国アトロピン硫酸塩</td><td></td><td>アスタート;台湾・新竹</td><td>市、手術用/ダミーベースメッキ/ベース</td></tr><tr><td>メッキ ベースプレート</td><td>V3</td><td>http://miniscope.org</td><td>ダミーベースメッキ/ベースメッキ用</td></tr><tr><td>BLU TACK</td><td>#30840350</td><td>Bostik;米国マサチューセッツ州チェルシー</td><td>再利用可能な接着粘土; 手術用/ダミーベースメッキ/ベースメッキ</td></tr><tr><td>ボーンロンガーフリードマン</td><td>13 cm</td><td>ディーナー;ドイツ、トゥットリンゲン、</td><td></td></tr><tr><td>ブプレノルフィン</td><td></td><td>INDIVIORのベースメッキ。手術</td><td>のための</td>英国</tr><tr><td>Carprofen</td><td>Rimadyl</td><td>Zoetis;ペンシルベニア州エクストン</td><td>鎮痛剤</td></tr><tr><td>Ceftazidime</td><td></td><td>台湾バイオテクノロジー;台湾</td>は<td>感染を防ぎます</td></tr><tr><td>UCLAミニスコープのデータ収集PCB</td><td>https://www.labmaker.org/collections/neuroscience/products/data-aquistion-system-daq</td><td></td><td>でベースメッキのために</td>購入</tr><tr><td>歯科用セメントセット</td><td>Tempron</td><td>GC Corp;東京、</td><td>日本、歯科用セメントの試験用</td></tr><tr><td>歯科用セメントセット</td><td>Tokuso Curefast</td><td>Tokuyama Dental Corp.;東京、日本、</td><td>歯科用セメント/手術/ダミーベースメッキ/ベースプレーティングのテスト用</td></tr>デュアル<tr><td>ラボスタンダードとマウスとラットアダプター#</td><td>51673</td><td>Stoelting Co;米国イリノイ州</td>、<td>手術用/ダミーベースメッキ/</td></tr><tr><td>デュラテア軟膏</td><td></td><td>アルコンのベースプレーティング。ジュネーブ、スイス</td><td>、手術用/ダミーベースプレーティング/ベースプレーティング</td></tr><tr><td>Ibuprofen</td><td></td><td>YungShin;台湾</td><td>鎮痛剤</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td></td><td>パニオン&BFバイオテック株式会社;台湾桃園、</td><td>手術/ダミーベースメッキ/ベースプレーティング</td></tr><tr><td>Inscopix</td><td>nVistaシステム</td><td>Inscopix;カリフォルニア州パロアルト</td>(<td>V3 UCLA Miniscope</td></tr><tr><td>Ketamine</td><td></td><td>Pfizerとの比較用)NY、</td><td>NY安楽死手術</td></tr><tr><td>のための</td><td>通常の生理食塩水</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロブルドッグクランプ#</td><td>12.102.04</td><td>Dimedo;Tuttlingen、レンズ</td><td>移植のための</td>ドイツ</tr>マイクロ<tr><td>リットルマイクロシリンジ、2.0 &micro;L、25ゲージ</td><td>#88400</td><td>ハミルトン;ボナドゥーツ、ウイルス</td><td></td></tr><tr><td>射出成形シリコーンゴム</td><td>ZA22 Thixo</td><td>Zhermackのためのスイス。Badia Polesine、ダ</td><td>ミーベースプレーティング</td></tr><tr><td>Objective Gradient index(GRIN)レンズ</td><td>#64519</td><td>Edmund Optics;ニュージャージー州、</td><td>米国、ダミーベースメッキ/ベースメッキ</td></tr><tr><td>パラフィルム</td> <td>#PM996</td><td>ベミス。ニーナ、ダ</td><td>ミーベースメッキ用</td></tr><tr><td>米国ポータブル吸引</td> <td>#DF-750</td><td>Doctor's Friend Medical Instrument Co., Inc.、台中、台湾</td><td>手術用</td></tr><tr><td>リレーGRINレンズ</td><td>#1050-002177</td><td>Inscopix;パロアルト、カリフォルニア州、米国</td><td>、ダミーベースメッキ用、</td></tr><tr><td>ステンレス鋼アンカーネジ</td>、<td>直径1.00mm、手術用全長3.00mm</td><td></td><td></td></tr>ステレオ<tr><td>顕微鏡</td> <td>#SL720</td><td>セージビジョン;台湾の新北市、</td><td>手術用/ダミーベースプレーティング/ベースプレーティング</td></tr><tr><td>Stereotaxic apparatus</td><td>#51673</td><td>Stoelting;イリノイ州、手術</td><td>用/ダミーベースメッキ/ベースプレーティング</td></tr><tr><td>UV硬化接着剤</td><td>#3321</td><td>ロックタイト;D&uuml;ドイツ、セルドルフ、</td><td>歯科用セメント</td></tr><tr><td>V3 UCLAミニスコープ</td>、<td>手術/ダミーベースメッキ/ベースメッキのために</td><td>https://www.labmaker.org/products/miniscope-complete-set-of-components</td><td></td> に購入</tr><tr><td>キシラジン</td><td>X1126</td><td>Sigma-Aldrich; 安</td><td>楽死のために</td>ミズーリ州セントルイス</tr><tr><td>キシロカインポンプスプレー10%</td><td></td><td>アストラゼネカ;S&ouml;dert&auml;lje, スウェーデン</td><td>手術用</td></tr></tbody></table>

マウスのカルシウム過渡研究のためのベースメッキと対物レンズで事前に固定されたミニスコープの使用

Using Baseplating and a Miniscope Preanchored with an Objective Lens for Calcium Transient Research in Mice

神経科学者は、小型顕微鏡(ミニスコープ)を使用して、自由に行動する動物の神経活動を観察します。カリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)のミニスコープチームは、研究者が自分でミニスコープを構築するためのオープンリソースを提供しています。V3 UCLAミニスコープは、現在使用されている最も人気のあるオープンソースミニスコープの1つです。表在皮質に埋め込まれた対物レンズ(1レンズシステム)を介して遺伝子組み換えニューロンから放出される蛍光トランジェントのイメージング、または脳深部に埋め込まれたリレーレンズとミニスコープに事前に固定された対物レンズの組み合わせ(2レンズシステム)を介して、脳深部領域のイメージングを可能にします。最適な条件下(ニューロンが蛍光インジケーターを発現し、リレーレンズが適切に埋め込まれている場合)でも、セメント硬化時にベースプレートと頭蓋骨への付着との間の歯科用セメントの体積変化により、対物レンズとリレーレンズの間の距離が変化してずれ、画質が低下する可能性があります。ベースプレートは、ミニスコープを頭蓋骨に取り付け、対物レンズとリレーレンズの間の作動距離を固定するのに役立つプレートです。したがって、ベースプレートの周りの歯科用セメントの体積の変化は、レンズ間の距離を変化させる。本プロトコルは、歯科用セメントの体積変化によって引き起こされるミスアライメントの問題を最小限に抑えることを目的としています。このプロトコルは、リレーレンズの埋め込み中に歯科用セメントの初期基礎を構築することにより、ミスアライメントを低減します。移植後の回復時間は、歯科用セメントの基礎がベースプレートを完全に硬化させるのに十分であるため、できるだけ少ない新しいセメントを使用して、ベースプレートをこの足場にセメントで固定できます。本稿では、ミニスコープに固定された対物レンズで神経活動のイメージングを可能にするマウスのベースプレーティング戦略について説明します。

歯科用セメントの体積変化の評価 歯科用セメントの体積は硬化プロセス中に変化するため、GRINレンズの作動距離が約50〜350μmであることを考えると、画像品質に大きな影響を与える可能性があります4,8。したがって、この場合、移植および下地めっき手順の前に、2つの市販の歯科用セメント、テンプロンとトクソがテストされました(図5)。最初にビデオを評価してセメントが収縮したかどうかを確認し、次に完全に乾燥したときのセメントの体積を比較しました。歯科用セメントの初期混合物の同じ濃度および量をピペットチップに装填し、ビデオテープを貼った(補足ビデオS1)。ビデオS1は、両方のセメントが乾燥プロセス中に収縮したことを示しました。特捜はテンプロンよりも優れた性能を発揮しました(つまり、縮小後もテンプロンよりも体積が大きかった):図3B;テンプロ...

硬化中の歯科用セメントの収縮は、ベースプレートを変位させます。このプロトコルは、ベースプレートをセメントで固めるスペースを残す歯科用セメントの初期基礎を作成することにより、問題を最小限に抑えます。数週間後、ベースプレートは、ほとんど新しいセメントを使用してこの足場の所定の位置にセメントで固定できるため、収縮が減少します。

Neuroscientists use miniature microscopes (miniscopes) to observe neuronal activity in freely behaving animals. The University of California, Los Angeles ...

このミニスコープは、地板手順中の歯科用セメントの収縮問題を軽減し、2つの長さ構成での蛍光シグナルのミニスコープ記録の成功率を高めることができます。ベースプレーティング中に蛍光過渡現象が観測できない場合は、カルシウムインジケーターの発現と脳スライス上のリレーレンズの位置を確認してください。直径1ミリメートルの20ゲージの静脈内カテーテルの内側の針を定位固定装置アームに取り付けることから始めます。カテーテルを腹側コーンアンモニス1に下げて、ターゲット領域にします。次いで、マイクロインジェクション針を毎分100〜200マイクロメートルの速度で腹側角膜1に下ろし、毎分25ナノリットルの速度で200ナノリットルのウイルスベクターを標的領域に注入する。ウイルスを10分間拡散させた後、毎分100〜200マイクロメートルの速度でマイクロインジェクションニードルを引き抜きます。リレーレンズを消毒した後、埋め込みまで冷たいパイロジェンフリー生理食塩水にレンズを浸します。熱収縮チューブ付きのマイクロブルドッグクランプを使用して、リレーレンズを持ち、毎分100〜200マイクロメートルの速度でターゲット領域の上に置きます。次に、歯科用セメントでレンズを安定させます。ミニスコープを設定するには、対物レンズを底面に固定し、ベースプレートをミニスコープに組み立てます。地板の外側に10センチのパラフィンフィルムを巻き付けます。再利用可能な接着粘土を使用して、脳定位固定装置アームプローブでミニスコープを持ちます。対物レンズをリレーレンズの上に合わせ、レンズ間のスペースをできるだけ小さくします。歯科用セメントを使用して、セメントがパラフィンフィルムにのみ接触するように、ベースプレートの位置を固定します。歯科用セメントが乾いたら、パラフィンフィルム、ベースプレート、ミニスコープを取り外し、歯科用セメントベースを中空に保ちます。リレーレンズを成形用シリコーンゴムで密封し、シリコーンゴムを歯科用セメントの薄層で覆います。マウスを定位固定装置から外し、マウスを回収チャンバーに入れます。ベースメッキの場合は、歯科用セメント屋根の薄層を骨ロンジャーで慎重にカットし、シリコーンゴムを取り除きます。リレーレンズの表面を75%アルコールで清掃します。ベースプレートの横にある止めネジを締めて、ミニスコープの下部に固定します。フォーカススライドをメインハウジングから約2.7〜3ミリメートルになるように調整します。設定が完了したら、ミニスコープをデータ収集ボードに接続し、ミニスコープをコンピューターのUSB 3.0ポートに接続します。UCLAチームが開発したデータ集録ソフトウェアを実行します。露出を255に、ゲインを64倍に、励起LEDを5%に調整しますミニスコープをデータ収集ソフトウェアに接続するには、接続ボタンをクリックして、リレーレンズのマージンを目印としてデータ集録ソフトウェアのライブストリームを視聴します。リレーレンズが見つかったら、ミニスコープの対物レンズをリレーレンズに手で合わせます。ミニスコープのさまざまな角度と距離を調整し、蛍光信号の検索を開始します。ミニスコープを最適な位置に保持し、定位固定装置アームをミニスコープに向かって動かし、再利用可能な接着粘土でミニスコープを定位固定装置アームに接着します。X、Y、Z アームを少し調整して、最適なビューを検索します。対物レンズの表面とリレーレンズの表面の角度を調整するには、イヤーバー、歯のバー、または再利用可能な接着粘土をZ軸で回します。ウイルス発現および水晶体移植は、少なくとも1つの細胞がベースプレーティング中に蛍光過渡現象を置換したときに成功する。最適な位置が変化しないように、関心領域を監視しながら、可能な限り少量の歯科用セメントでベースプレートをしっかりと固定します。代表的な研究では、ダミーベースメッキの手順は、元の手順よりもベースプレートの位置のシフトが小さいため、有利であることが証明されました。地板のずれは、歯科用セメントの高さにも影響されました。頭蓋骨の0.5センチメートル上に固定された地板は、頭蓋骨の1センチメートル上に固定された地板よりも大幅に小さくシフトしました。ベースプレーティング手順中の成功した画像化の例では、麻酔をかけた動物において血管と共に蛍光トランジェントが注目された。蛍光トランジェントは、ベースプレーティングの5日後に、マウスがホームケージ内でわずかに位置を移動して自由に行動している場合でも観察されました。その後のマウスのカルシウムイメージングを行った。いくつかの例では、ベースメッキ手順中に、均一な背景や白血球のマージンが見える以外に何もないなどの問題が発生しました。蛍光過渡現象なし。可能な限り少ない量の歯科用セメントでベースプレートをターゲット領域にしっかりと固定することが重要です。スレート技術を使用すると、研究者はこれ全体の神経活動を縦断的に観察できます。適切なライセンスがあれば、この手順は視野内のニューラルネットワークを観察するためにも適用できます。

using-baseplating-miniscope-preanchored-with-an-objective-lens-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶマウスのカルシウム過渡研究のためのベースメッキと対物レンズで事前に固定されたミニスコープの使用方法。歯科用セメントの収縮によるミスアライメントを最小限に抑え、深部脳領域での安定した蛍光イメージングを実現します。

マウスのカルシウム過渡研究のためのベースメッキと対物レンズで事前に固定されたミニスコープの使用

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