マウスのカルシウム過渡研究のためのベースメッキと対物レンズで事前に固定されたミニスコープの使用

このミニスコープは、地板手順中の歯科用セメントの収縮問題を軽減し、2つの長さ構成での蛍光シグナルのミニスコープ記録の成功率を高めることができます。ベースプレーティング中に蛍光過渡現象が観測できない場合は、カルシウムインジケーターの発現と脳スライス上のリレーレンズの位置を確認してください。直径1ミリメートルの20ゲージの静脈内カテーテルの内側の針を定位固定装置アームに取り付けることから始めます。

カテーテルを腹側コーンアンモニス1に下げて、ターゲット領域にします。次いで、マイクロインジェクション針を毎分100〜200マイクロメートルの速度で腹側角膜1に下ろし、毎分25ナノリットルの速度で200ナノリットルのウイルスベクターを標的領域に注入する。ウイルスを10分間拡散させた後、毎分100〜200マイクロメートルの速度でマイクロインジェクションニードルを引き抜きます。

リレーレンズを消毒した後、埋め込みまで冷たいパイロジェンフリー生理食塩水にレンズを浸します。熱収縮チューブ付きのマイクロブルドッグクランプを使用して、リレーレンズを持ち、毎分100〜200マイクロメートルの速度でターゲット領域の上に置きます。次に、歯科用セメントでレンズを安定させます。

ミニスコープを設定するには、対物レンズを底面に固定し、ベースプレートをミニスコープに組み立てます。地板の外側に10センチのパラフィンフィルムを巻き付けます。再利用可能な接着粘土を使用して、脳定位固定装置アームプローブでミニスコープを持ちます。

対物レンズをリレーレンズの上に合わせ、レンズ間のスペースをできるだけ小さくします。歯科用セメントを使用して、セメントがパラフィンフィルムにのみ接触するように、ベースプレートの位置を固定します。歯科用セメントが乾いたら、パラフィンフィルム、ベースプレート、ミニスコープを取り外し、歯科用セメントベースを中空に保ちます。

リレーレンズを成形用シリコーンゴムで密封し、シリコーンゴムを歯科用セメントの薄層で覆います。マウスを定位固定装置から外し、マウスを回収チャンバーに入れます。ベースメッキの場合は、歯科用セメント屋根の薄層を骨ロンジャーで慎重にカットし、シリコーンゴムを取り除きます。

リレーレンズの表面を75%アルコールで清掃します。ベースプレートの横にある止めネジを締めて、ミニスコープの下部に固定します。フォーカススライドをメインハウジングから約2.7〜3ミリメートルになるように調整します。

設定が完了したら、ミニスコープをデータ収集ボードに接続し、ミニスコープをコンピューターのUSB 3.0ポートに接続します。UCLAチームが開発したデータ集録ソフトウェアを実行します。露出を255に、ゲインを64倍に、励起LEDを5%に調整しますミニスコープをデータ収集ソフトウェアに接続するには、接続ボタンをクリックして、リレーレンズのマージンを目印としてデータ集録ソフトウェアのライブストリームを視聴します。

リレーレンズが見つかったら、ミニスコープの対物レンズをリレーレンズに手で合わせます。ミニスコープのさまざまな角度と距離を調整し、蛍光信号の検索を開始します。ミニスコープを最適な位置に保持し、定位固定装置アームをミニスコープに向かって動かし、再利用可能な接着粘土でミニスコープを定位固定装置アームに接着します。

X、Y、Z アームを少し調整して、最適なビューを検索します。対物レンズの表面とリレーレンズの表面の角度を調整するには、イヤーバー、歯のバー、または再利用可能な接着粘土をZ軸で回します。ウイルス発現および水晶体移植は、少なくとも1つの細胞がベースプレーティング中に蛍光過渡現象を置換したときに成功する。

最適な位置が変化しないように、関心領域を監視しながら、可能な限り少量の歯科用セメントでベースプレートをしっかりと固定します。代表的な研究では、ダミーベースメッキの手順は、元の手順よりもベースプレートの位置のシフトが小さいため、有利であることが証明されました。地板のずれは、歯科用セメントの高さにも影響されました。

頭蓋骨の0.5センチメートル上に固定された地板は、頭蓋骨の1センチメートル上に固定された地板よりも大幅に小さくシフトしました。ベースプレーティング手順中の成功した画像化の例では、麻酔をかけた動物において血管と共に蛍光トランジェントが注目された。蛍光トランジェントは、ベースプレーティングの5日後に、マウスがホームケージ内でわずかに位置を移動して自由に行動している場合でも観察されました。

その後のマウスのカルシウムイメージングを行った。いくつかの例では、ベースメッキ手順中に、均一な背景や白血球のマージンが見える以外に何もないなどの問題が発生しました。蛍光過渡現象なし。

可能な限り少ない量の歯科用セメントでベースプレートをターゲット領域にしっかりと固定することが重要です。スレート技術を使用すると、研究者はこれ全体の神経活動を縦断的に観察できます。適切なライセンスがあれば、この手順は視野内のニューラルネットワークを観察するためにも適用できます。