Name: 乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする Ex Vivo 脳スライスモデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: 学ぶ乳がん脳転移性腫瘍の増殖メカニズムと治療効果評価法。ex vivo脳スライスモデルを用いて薬剤・放射線応答をリアルタイムで測定し、腫瘍微小環境における治療戦略を探索する。

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ジュリア・ファーナン、ケイラ・グリーン、ティツィアナ・デアンジェリスの技術支援に感謝します。この研究は、ペンシルベニア州ユニバーサル研究強化助成金プログラム(MJR、JGJ)、UO1CA244303(MJR)、R01CA227479(NLS)、R00CA207855(EJH)、およびW.W. Smith Charitable Trusts(EjH)によって部分的に支援されました。

このプロトコルは、ドレクセル大学医学部施設動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認され、動物ケアガイドラインに従っています。Nu/Nu無胸腺雌マウス(6〜8週齢)を本研究に使用した。
1. 腫瘍細胞の頭蓋内注射
<ol><li>滅菌インジケータを含む滅菌パウチで、オートクレーブの乾燥サイクル下ですべての機器(ピンセット、はさみ、縫合はさみ、ハンドドリル)を滅菌します。複数の動物に対して手術を行う場合は、加熱ビーズ滅菌器(最大3倍)を使用して動物間のツールを滅菌してください。</li>
	<li>ユーザーの動物ケアプロトコル(例えば、イソフルラン(誘導用4%、維持1〜2%)に従ってマウスを麻酔し、手術開始前に鎮痛(皮下、0.1mg / kgブプレノルフィンSR-LABの0.1mL)を投与する。つま先のピンチで最適な麻酔の深さを確保します。</li>
	<li>マウスを定位フレームに入れ、標準的なイヤーバーを使用して頭を固定します(図1A)。眼科用軟膏を目に塗布する。</li>
	<li>切開前にヨウ素綿棒と70%エタノールを繰り返し交互に塗布(3倍)して、頭部の表面を滅菌する。</li>
	<li>外科用メスを使用して、マウスの脳を2つの対称的な半分に分割して頭蓋骨を露出させる虚線に対してわずかに斜めの角度で皮膚を通る1cmの正中線切開を行う。綿棒で血を拭きます。</li>
	<li>皮膚を横方向にそらして注射部位を露出させる:右側2mm、ブレグマ(+2平側(+2ML)、+1吻側/尾側(+1RC)を参照して前方に1mm)。</li>
	<li>バービット(0.73 mm)を使用して頭蓋骨+2ML、+1RCをブレグマに貫通し、わずかな圧力とねじれ運動を使用して穴を開けます。</li>
	<li>脳注射器を使用して、最初にシリンジを脳に深さ3.5mm挿入することにより、滅菌1x PBSに100,000個のMDA-MB-231BR(GFP-ルシフェラーゼを安定発現する)細胞/μL溶液5 μLを注入する。</li>
	<li>シリンジを2分間落ち着かせます。それを約1mm引き上げ、2分後、体積の前半をゆっくりと注入する。</li>
	<li>残りを注入する前にさらに2分間待ってから、最終注射の3分後にシリンジをゆっくりと引きます。 注:低速注射は、体積が脳組織によく吸収され、シリンジを引っ張った後に漏れを生じさせないようにするために経験的であり、癌細胞が意図した部位の外側に増殖する可能性がある。</li>
	<li>頭蓋骨の注射部位に骨ワックスを塗布し、ポリプロピレン縫合糸を使用して組織を縫合する。マウスは麻酔の除去後5分以内に回復する。</li>
	<li>手術直後の行動を約10分間、3時間後、翌日に監視し、生理食塩水注射、柔らかい食べ物などの特別な治療が迅速な回復に役立つかどうかを判断します。</li>
	<li>イメージングシステム上の生物発光イメージングを介して腫瘍の成長を監視します。<ol>
<li>このためには、まず、イメージングシステムの酸素とイソフルランをオンにします。両方をイメージングボックスの外側の別々のチャンバに分配できるようにします。</li>
		<li>次に、ソフトウェアの電源を入れ、機器を初期化し、マウス本体全体を視覚化してキャプチャするための適切なオプションを選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>イソフルランでマウスを別々のチャンバーに入れ、つま先のピンチで最適な麻酔の深さを確保します。マウスに200 μLの30 mg/mLルシフェリンを腹腔内に注射する。</li>
	<li>マウスの胃を、酸素とイソフルランを供給した画像チャンバーの鼻先に移す。チャンバーをロックし、2分間の露光を選択してイメージングを開始します。</li>
	<li>ソフトウェアのROI(関心領域)ツールを使用して、腫瘍の生物発光シグナルを定量化します。</li>
	<li>腫瘍のサイズを分析するには、円の形状ツールを選択し、腫瘍の形状とサイズの周りに合わせます。ROIを測定し、合計測定値を報告します。</li>
	<li>脳スライスを生成する前に、固形腫瘍の増殖を12〜14日間(またはルシフェラーゼが約7.0 x106 単位に達するまで)許可する(図1B)。 注:注射する細胞の数を増やすと、腫瘍の増殖が速くなります。したがって、脳スライスの生成は12日より早く起こり得る。一方、腫瘍が大きくなると、14日間増殖させるとGFP+スライスが増えます。14日後、マウスの健康は急速に悪化し始める。したがって、動物の健康モニタリングは、10日間の時点以降に1日1回に増加し、痛みおよび/または不快感の徴候を示すマウスはスライスを生成するために使用されるべきである。</li>
</ol>2.脳スライスを生成する
メモ: 脳の分離後に、滅菌層流フードで手順を実行します。典型的には、MDA-MB-231BR細胞を注射した1匹のマウスから腫瘍細胞(ルシフェラーゼシグナル)を含む35〜40個の個々のスライスを生成することが可能である(図1C)。
<ol><li>オートクレーブ内のすべての手術器具を滅菌する。滅菌層流フードに組織スライサーを置き、すべてのツールと器具を70%エタノールで洗浄します。</li>
	<li>頭蓋内MDA-MB-231BR細胞注射後12〜14日後に、1.2に記載されているように、ユーザーの動物ケアプロトコルに従ってマウスを麻酔する。つま先のピンチで最適な麻酔の深さを確保します。</li>
	<li>280 mM スクロース、5 mM KCl、2 mM MgCl 2、1 mM CaCl 2、20 mM グルコース、10 mM HEPES、5 mM Na+-アスコルビン酸塩、3 mM チオ尿素、2 mM Na+、29 mM ピルビン酸で構成される氷冷(4°C)スクロース-ACSFに脳を素早く(45秒以内に)除去して配置する。pH=7.3。</li>
	<li>鋭利で滅菌されたメスまたはカミソリの刃を使用して、脳の底部を含むすべての側面から腫瘍を含まない脳の余分な部分を切り取ります。</li>
	<li>脳の形を完璧でない立方体に持ってきて、スライスを容易にするために60mmの皿蓋の上のACSF濡れろ紙の上に平らに座ります。 注:腫瘍が成長した可能性が低い脳の余分な組織は、スライス前に除去され、主にGFP +スライスを生成し、器具の表面上で安定し、スライスによって引き起こされる振動によって動揺しない脳の形状を作り出す。</li>
	<li>プリウェット(ACSF付き)ろ紙を数枚切断プラットフォーム上に置き、ブロックされた組織をこの上に置きます。</li>
	<li>付属の定規で装置のカットサイズを2または2.5単位に設定して、組織を200〜250μmのセクションにスライスします。 メモ: 最大 350 μm または 100 μm の薄さのスライスは実行可能です。<200μmのスライスの場合は、ビブラトームまたは圧縮トームを使用します。</li>
	<li>ペイントブラシ(クロテン)を使用して、脳のスライスをスクロースACSFを含む皿に移し、27G針を使用して光学顕微鏡下でスライスを分離する。</li>
	<li>蛍光顕微鏡下でGFP陽性スライスを同定し、滅菌1mLの切断ピペット(広い開口部)を使用して、2〜3mLの成人スライス培地(Neurobasal medium A、2% B12サプリメント、1%N2サプリメント、1%グルタミン、0.5%グルコース、10U/mLペニシリン、および100μg/mLストレプトマイシン)を含む新しい60mmディッシュに移す。 注:脳表面上に増殖する腫瘍細胞を含む脳スライス(おそらく注射細胞漏出などによる)は除外される。</li>
	<li>3~5枚のスライスを、各30 mm、0.4 μmの孔径の組織培養インサート上に、互いに成長できない距離で6ウェルプレートに移す。</li>
	<li>P1000ピペットを用いてインサートの表面から過剰の培地を取り出し、各インサートの下に1mLの成体マウススライス培地を加え、スライスする前にインキュベーター内の培地を平衡化します。</li>
	<li>イメージング前に、組織を37°C、5%CO2、 および95%湿度で24時間インキュベートする。</li>
</ol>3. スライスのIVISイメージング
注: ルシフェラーゼおよび阻害剤の添加手順は、滅菌層流フード内で行います。
<ol><li>インサートの下の培地に30 mg/mLルシフェリン溶液5 μLをピペットで入れ、インサートを鉗子で持ち上げ、ウェル内の培地にルシフェリンを添加した後、ウェルに戻します。</li>
	<li>固定カメラの下の機器の撮像チャンバ内に蓋付きの6ウェルプレートを置き、チャンバドアをロックします。</li>
	<li>ソフトウェアを開き、計測器を初期化します。</li>
	<li>画像ごとに 1 つのウェルのみの視覚化とキャプチャを可能にするカメラ設定を選択します。ステージを上に移動し(視野5cm)、カメラの真下に撮影する必要がある井戸を置きます。</li>
	<li>イメージング時間を、腫瘍が放出するルシフェラーゼの強度に応じて最も適切なものに設定します(10秒から5分まで変化します)。まず10秒に設定し、信号が低い場合は増やしますが、実験が終了するまですべての時点と条件について一貫性を保ちます(図1D)。</li>
	<li>ROIツール(円形状ツール)を使用し、腫瘍の形状と大きさの周りにそれを合わせ、ROIを測定し、スライス上の各腫瘍の生物発光シグナルを定量化するために総測定値を報告する。</li>
	<li>プレートを滅菌層流フードに戻し、鉗子を使用してインサートをウェルからわずかに持ち上げます。</li>
	<li>培地を吸引し、1mLの新鮮な培地と交換し、インサートをウェルに戻す。</li>
	<li>スライスをインヒビター、代謝産物などの各種化合物で処理する実験では、1.5 mLチューブ内の1.2 mLの脳スライス培地に適切な濃度の試薬を調製し、スライスを含むウェルに1 mLを移します。</li>
	<li>研究期間中、このプロセスを48時間ごとに繰り返します。</li>
</ol>4. 生体外 脳スライスにおける腫瘍増殖のライブイメージング
注: インサートには、ライブイメージング中に培地を追加することはできないため、実験の長さを持続させるのに十分な培地 (1.5 mL) をインサートに供給してください。
<ol><li>6ウェルプレートをインキュベーター内の自動顕微鏡プレートホルダー(37°C、5%CO2、 湿度95%)の上に置きます。</li>
	<li>ソフトウェアを開き、最初の象限の明視野をオンにして、スライスを表示するために必要な露出を調整します。スライスの位置(座標「xy」)を見つけるには、2番目の象限で「xy」でナビゲートして、顕微鏡の座標「xyz」を制御します。</li>
	<li>この実験に使用したラボウェアとして6ウェルプレートを選択します。ROIマップエディタを選択し、新しいROIを選択してその位置を登録し、そのROIを追加して保存する。</li>
	<li>他の井戸の他のすべての関心領域についても同じ手順を繰り返します。すべてのROIを追加したら、すべてのROIを保存します。</li>
	<li>[プロトコル]で、[既存のクリア]を選択し、[集録]で[タイムラプス]を選択してから、目的のチャネル(この場合はGFP)を選択します。</li>
	<li>フォーカス設定で オート フォーカスをオフにし、すべてのスライスの適切な フォーカス に手動で調整します。最後に、 明視野強度 と 蛍光チャンネルの励起 と 露光時間を 適切なレベルに調整します。</li>
	<li>48 時間の間、15 分ごとに画像を取得するようにプロトコルを設定します。</li>
	<li>プロトコルを保存して実行します。実験の終了時に、保存されたファイルには、ROIごとにキャプチャされた明視野画像とGFP画像の両方が含まれます。</li>
	<li>ビデオ内の画像を組み合わせるには、関心のあるすべての画像の名前を同じ名前に変更し、その後に2進数を付けて、キャプチャされた順序で整理します(ROI1(1)、RO1(2) など)。</li>
	<li>ImageJを開き、[ファイル]をクリックして画像 >インポートし、画像シーケンス>インポートします。リストに表示されるファイル名を選択し、ビデオ用に選択されたファイルを識別するために表示される [ファイル名を含む] ボックスにファイル名の内容を書き込みます。</li>
	<li>結合された画像を 「ファイル」>「名前を付けて保存」> AVI に保存します。</li>
</ol>5. MTSアッセイと生体外 脳組織の免疫組織化学
<ol><li>MTSアッセイ<ol>
<li>組織の縁に沿って各スライスの下の組織培養膜を切断することによってスライスを切除し、まだ膜に付着したままの組織を96ウェルプレートに移す。</li>
		<li>培養培地および0.01%トリトン(1x)と1:5の比率で混合したMTS試薬を、各ウェルに120μLの総容量で組織に溶液を浸透させるために加える。</li>
		<li>4%パラホルムアルデヒド(PFA)を、脳スライスを生存不能にするための薬剤として使用し、したがって、この実験のための陽性対照とする。MTSアッセイを進める前に、目的の脳スライスをRT(室温)で1時間、または4°Cで一晩浸漬する。</li>
		<li>MTS試薬をスライスに4時間反応させ、ウェルからスライスを取り出し、スライスを基準として持たない空のウェルを含むすべての条件について490nmでの吸光度を測定します。</li>
		<li>デジタルノギス定規で測定した組織スライス面積の関数として測定値を報告します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>免疫組織化学製剤<ol>
<li>メンブレンインサート表面に付着した脳スライスを10%ホルマリンに4°Cで一晩浸漬する。</li>
		<li>埋め込み、処理、ブロッキングを行い、組織の染色されていないスライドを生成します。標準的な免疫組織化学染色プロトコルを使用して、H&E、Ki-67、γ-H2AX、CC3、GFAP、GFP、DAPI を染色する</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 生体外 脳スライスにおける腫瘍の照射
<ol><li>腫瘍に6Gy(310kVpのX線)を照射する。 注:6 Gyの総線量を得るために入力された単位は、前述のようにR単位(Victoreen電気計を使用して測定)とシンブル、空気密度、およびcGy/Rの補正を考慮した後、3522単位です18。露光時間は130.9秒です。</li>
	<li>0.25 mm Cu + 1 mm Al添加ろ過、50 cm SSD、125 cGy/分を使用してください。</li>
	<li>一次標準に対して較正されたインザビームイオン化チャンバによって線量測定を行う。</li>
	<li>湿度、温度、気圧を毎日修正します。</li>
</ol>

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著者は宣言する財政的な矛盾はありません。

この研究は、外植異種移植片脳腫瘍のための新規なex vivo 脳培養方法を確立する。我々は、マウスの脳に頭蓋内注射されたBCBM細胞MDA-MB-231BR細胞が 、エクスビボ 脳スライス中で生存および増殖し得ることを示す。この研究はまた、頭蓋内注射されたU87MG膠芽腫(GBM)細胞を試験し、これらの癌細胞が脳スライスで生き残り、増殖することも見出した(データは示されていない)。このモデルは、BCBMやGBMを超えて、肺がんや黒色腫など、脳に容易に転移する他のがんにも拡張できると考えています。乳癌脳栄養細胞の頭蓋内注射は、脳腫瘍を発生させるための単純かつ迅速な方法であり、脳大転移の適切なモデルとみなされるため、選択された25。しかしながら、同様の腫瘍スライスモデルは、心臓内接種または原発性脂肪パッドへの同所性注射のいずれかから開発することができる。無血清培地中で成体脳スライスを増殖させ、48時間ごとに新鮮な培地を供給することによる培養条件の最適化は、組織生存率および腫瘍の生存および増殖のより良い保存をもたらした。インキュベーターの高酸素条件下で利用され...

乳がんの脳転移(BCBM)は、原発性乳房腫瘍から脳に細胞が広がると発症します。乳がんは、肺がんに次いで脳転移の2番目に頻繁な原因であり、転移は患者の10〜16%で起こる1。残念なことに、患者の>80%が脳転移診断後1年以内に死亡し、神経機能障害のために生活の質が損なわれているため、脳転移は依然として不治の病のままです2。より効果的な治療選択肢を特定することが急務です。単層二次元または三次元培養モデルは、実験室で治療薬を試験する際に最も一般的に使用される方法である。しかし、それらは、腫瘍表現型および増殖の主要な要因である複雑なBCBM微小環境を模倣していない。これらのモデルは有用であるが、腫瘍の複雑な間質相互作用、固有の代謝要求、および腫瘍の不均一性を捉えていない3。腫瘍間質相互作用と微小環境の不均一性をより忠実に再現するために、我々のグループと他のグループは、患者由来の腫瘍細胞(原発性または転移性)または癌細胞株を用いて有機型脳転移「スライス」培養物を生成し始めている4,5,6。古典的なin vitroシステムと比較して、この短期のex vivoモデルは、大型動物コホートにおける前臨床評価の前に新しい治療法をスクリーニングするためのより関連性の高い条件を提供する可能性がある。
エクスビボモデルは、主に様々な癌の成功した治療法の同定のために構築され、首尾よく使用されてきた。評価には数日が必要であり、さらに患者固有の薬物スクリーニングに合わせて調整することができます。例えば、ヒト膀胱および前立腺癌エクスビボ組織は、ドセタキセルおよびゲムシタビンの用量依存的な抗腫瘍応答を示している7。同様の結腸直腸癌のエクスビボ組織が、化学療法薬オキサリプラチン、セツキシマブ、およびペムブロリズマブ8をスクリーニングするために開発された。この用途は、間質環境と膵管腺癌の遺伝子型および表現型特性との間の本質的な相互作用を考慮して、膵臓癌において広く使用されている9,10。さらに、このような有機型モデルが、頭部、頸部、胃、および乳房腫瘍における同様のスクリーニングのために開発されている11、12。
ここで、異種移植乳癌脳転移性腫瘍細胞のエクスビボ脳スライスモデルをそれらの微小環境において生成させている。マウスに乳癌脳転移性脳栄養性MDA-MB-231BR細胞13を大脳皮質頭頂葉-TNBC転移14、15の共通部位に頭蓋内注射し、腫瘍を発症させた。脳スライスを、これらの異種移植動物から生成し、16、17に記載のように器官型培養物としてエクスビボで維持した。この新規なエクスビボモデルは、脳実質内のBCBM細胞の成長の分析を可能にし、脳微小環境内の腫瘍細胞に対する治療薬および放射線効果の試験に使用することができる。

<table><tbody><tr><td>1 mLシリンジ、スリップチップ</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>30 G1/2 ニードル</td><td>BD</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>Genessee</td><td>25-105</td><td></td></tr><tr><td>自動顕微鏡およびLUMAVIEWソフトウェア</td><td>Etaluma</td><td>LS720</td><td></td></tr><tr><td>B27 (GEM21)</td> <td>Gemini Bio-Products</td><td>400-160</td><td></td></tr><tr><td>ビーカー 50 mL</td><td>フィッシャー</td><td>10-210-685</td><td></td></tr><tr><td>鈍いセーブル絵筆、サイズ#5/0</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>66100-50</td><td></td></tr><tr><td>骨蝋</td><td>ModoMed</td><td>DYNJBW25</td><td></td></tr><tr><td>脳注射 シリンジ</td><td>ハミルトン社</td><td>80430</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP510-250</td><td></td></tr><tr><td>切断されたカスパーゼ3</td>抗体<td>細胞シグナル伝達</td><td>14220S</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>D-ルシフェリンカリウム塩</td><td>パーキンエルマー</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>両刃カミソリ刃</td><td>VWR</td><td>55411-060(95-0043)</td><td></td></tr><tr><td>濾紙、定量的サークル、4.25 cm</td><td>フィッシャー</td><td>09-805a (1001-042)</td><td></td></tr><tr><td>ファインセーブル絵筆 #2/0</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>66100-20</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Gamma-H2AX antibody</td><td>Millipore</td><td>05-636</td><td></td></tr><tr><td>GFAP抗体</td><td>Thermo Fisher</td><td>13-0300</td><td></td></tr><tr><td>GFP抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>SC-9996</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine (200 mM)</td><td>Corning cellgrow</td><td>25-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>のH&EおよびKI-67</td><td>ジェファーソンコアファシリティ病理学</td><td></td><td></td></tr>染色<tr><td>ハンドドリルセット、マイクロミニツイストドリルビットAmazon</td><td></td><td>YCQ2851920086082DJ</td><td></td></tr><tr><td>HEPES、遊離酸</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP299-1</td><td></td></tr><tr><td>マウス用だけ 定位固定装置フレーム</td><td>ハーバード装置(米国マサチューセッツ州ホリストン)。</td><td>72-6049、72-6044</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>大型手術用ハサミ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>14001-18</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231BR細胞</td>パ<td>トリシアスティーグ博士提供</td><td>Ref 14</sup</td>><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot;6H2O</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>マウスイメージングデバイス</td><td>Perkin Elmer</td><td>IVIS 200システム</td><td></td></tr><tr><td>マウスイメージングソフトウェア</td><td>キャリパーライフサイエンス(ウォルサム、マサチューセッツ州、米国)。</td><td>リビングイメージソフトウェア</td><td></td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>Tecan Spark</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mounting solution</td><td>Invitrogen</td><td>P36935</td><td></td></tr><tr><td>MTS 試薬</td><td>Promega CellTiter 96 Aqueous One Solution</td><td>(Cat:G3582)</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>Nu/Nu 無気力マウス</td><td>Charles Rivers Labs (Wilmington, MA, USA)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>145140-122</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレン縫合糸</td><td>Medex 供給</td><td>ETH-8556H</td><td></td></tr><tr><td>ポビドン ヨウ素 綿棒</td><td>DME 供給 USA</td><td>猫: 689286X</td><td></td></tr><tr><td>メスの刃#11(100のpk)</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10011-00</td><td></td></tr>メス<tr><td>ハンドル#3</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>S8636</td><td></td></tr>スパ<tr><td>チュラ/プローブ</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>10090-13SS</td><td></td></tr><tr><td>ダブルエッジコーティングされていないカミソリの刃(アメリカの安全かみそり共同(95-0043))</td><td>VWR</td><td>55411-060</td><td></td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>アムレスコ</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td>外科用メス</td><td>エクセリン</td>ト <td>インターナショナル D29702</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュ チョッパー</td><td>ブリンクマン</td> <td>(マキルウェイン タイプ)</td><td></td></tr> <tr><td>組織培養インサート</td><td>ミリポア</td><td>PICMORG50 または PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>X 線装置</td><td>精密 250 kVp</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする ex vivo 脳スライスモデル

An Ex Vivo Brain Slice Model to Study and Target Breast Cancer Brain Metastatic Tumor Growth

脳転移は、これらの腫瘍が治療が困難であり、臨床転帰不良と関連しているため、女性にとって乳癌の重篤な結果である。乳癌脳転移(BCBM)増殖の前臨床マウスモデルは有用であるが高価であり、脳実質内での生細胞および腫瘍細胞浸潤を追跡することは困難である。ここに提示されるのは、頭蓋内注射された乳癌脳シーククローンサブラインを含む異種移植マウスからの ex vivo 脳スライス培養のためのプロトコールである。 MDA-MB-231BR ルシフェラーゼタグ付き細胞をNu/Nu雌マウスの脳に頭蓋内注射し、腫瘍形成後、脳を単離、スライス、 エクスビボで培養した。腫瘍スライスを画像化して、ルシフェラーゼを発現する腫瘍細胞を同定し、脳実質におけるそれらの増殖および浸潤を最大10日間モニターした。さらに、このプロトコルは、電離放射線または化学療法による治療後の腫瘍細胞の増殖および浸潤挙動を画像化するためのタイムラプス顕微鏡の使用を記載している。治療に対する腫瘍細胞の応答は、ライブイメージング顕微鏡、生物発光強度の測定、およびBCBM細胞を含む脳スライスの組織学の実施によって視覚化することができる。したがって、この エキソビボ スライスモデルは、脳微小環境内の個々の患者の乳癌脳転移増殖を標的とするようにパーソナライズされた薬物を同定するために、新規治療薬を単独で、または放射線と組み合わせて迅速に試験するための有用なプラットフォームであり得る。

MDA-MB-231BR-GFP-ルシフェラーゼ細胞を、上記で説明したように4~6週齢のNu/Nuマウスの右半球に頭蓋内注射し(図1A)、12~14日間増殖させ、その間、腫瘍の成長を生物発光イメージングによってモニターした(図1B)。他のグループ19で報告されているように、100,000個のがん細胞を頭蓋内に注射しましたが、20,000個の細胞20個まで注射することは可能です。脳スライス生成(図1C)に続いて、上述のように、スライスをIVIS上で画像化し、24時間インキュベーション後に生物発光イメージングを介して腫瘍存在を決定した。これは 0 日目と見なされます。腫瘍増殖は、48時間ごとに生物発光シグナル伝達を定量化することによってモニターされ、これは6日間にわたる漸進的な増殖を示した(図1D)。H&amp...

乳がん脳転移細胞の薬物および放射線応答を器官型脳スライスモデルでリアルタイムに測定するためのプロトコルを紹介します。本方法は、脳微小環境界面内での乳癌からの脳転移に対する様々な治療の治療効果を ex vivo 方式で調査するための定量的アッセイを提供する。

乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする Ex Vivo 脳スライスモデル

Brain metastasis is a serious consequence of breast cancer for women as these tumors are difficult to treat and are associated with poor clinical ...

このプロトコルは、脳転移性腫瘍細胞の形成および既成腫瘍に対する薬物有効性および放射線の迅速な試験を可能にするex vivo脳スライスの生成を可能にする。この技術の主な利点は、脳-腫瘍-宿主相互作用を維持する生理学的に関連する環境で複数の薬物または治療法を迅速に試験できることである。この方法は、脳転移細胞がどのように成長し、生存し、脳実質に侵入するかを理解し、癌の成長および広がりにおける脳腫瘍微小環境の役割を理解するのに役立つ可能性がある。この手順を実演するのは、私の研究室の博士候補であるLorela CirakとEmily Esqueaです。まず、麻酔をかけたマウスを定位フレームに入れ、標準的なイヤーバーを使用して頭を固定します。切開前にヨウ素綿棒と70%エタノールを交互に繰り返し塗布することによって、頭部の表面を3回滅菌する。外科用メスを使用して、マウスの脳を2つの対称的な半分に分割し、頭蓋骨を露出させるために、虚数軸に対して対角線角度で1センチメートルの正中線切開を行う。綿棒で血液を拭いた後、皮膚を横にそらして注射部位を露出させます。0.73ミリメートルのバリビットを使用して頭蓋骨を貫通し、わずかな圧力とねじれ運動を使用して穴を開けます。GFPルシフェラーゼを安定に発現する細胞5マイクロリットルを注入するには、高精度シリンジを脳内の深さ3.5ミリメートルに挿入する。それが2分間落ち着くのを許してから、シリンジを約1ミリメートル引き上げます。2分後、最初の半分のボリュームをゆっくりと注入し、さらに2分間待ってから残りのボリュームを注入します。3分後、ゆっくりとシリンジを引く。頭蓋骨の注射部位に骨ワックスを塗布し、ポリプロピレン縫合糸で組織を縫合する。手術直後のマウスの行動を定期的に監視して、生理食塩水注射やソフトフードなどの特別な治療が迅速な回復に役立つかどうかを判断する。生物発光イメージングを介して腫瘍の成長を監視するには、まずイメージングシステム上の酸素とイソフルランをオンにし、両方をイメージングボックスの外側の別々のチャンバに分配できるようにします。次に、ソフトウェアをオンにして機器を初期化した後、マウス本体全体を視覚化してキャプチャするための適切なオプションを選択します。次に、酸素とイソフルランを供給した撮像箱の外側のチャンバーにマウスを移す。マウスが麻酔効果を受けたら、マウスに200マイクロリットルのルシフェリン1ミリリットルあたり30ミリグラムを腹腔内に注射する。マウスを、胃が鼻唇を撮像室に下に向けて画像化室内に置く。チャンバーをロックし、露光時間 2 分を選択してイメージングを開始し、イメージングを完了します。組織スライサーを滅菌層流フードに入れた後、すべてのツールと器具を70%エタノールで洗浄します。マウスを安楽死させた後、脳を取り出し、氷冷スクロースACSF溶液に素早く入れます。ヘラを使用して、60ミリメートルの皿蓋の上のACSF濡れろ紙に脳を移す。鋭利で滅菌されたカミソリの刃を使用して、脳の底部を含む腫瘍を含まない脳の余分な部分を切断し、脳の形状を非完全な立方体にする。ACSFで濡らしたろ紙を数枚切断プラットフォーム上に置いた後、ブロックされた組織をろ紙の上に置きます。組織を厚さ 200 ~ 250 マイクロメートルのセクションにスライスするには、プロバイダ定規で切断サイズを 2 または 2.5 単位に設定し、切断を開始します。ペイントブラシを使用して脳スライスをスクロース-ACSFを含む皿に移し、27ゲージの針を使用して光学顕微鏡下でスライスを分離します。蛍光顕微鏡下でGFP陽性スライスを同定する。次いで、広い開口部を有する滅菌1ミリリットルの壊れたピペットを用いて、同定されたスライスを、2〜3ミリリットルの成人スライス培地を含む新しい60ミリシャーレに移す。次いで、6ウェルプレートの各ウェル内の各組織培養インサート上に3〜5枚のスライスを安全な距離で移す。インサートの表面から余分な培地を除去した後、各インサートの下に平衡化した成体マウススライス培地を1ミリリットル加える。イメージングする前に、組織を摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%で24時間インキュベートします。1ミリリットル当たり30ミリグラムのルシフェリン溶液5マイクロリットルを滅菌フード内のインサートの下の培地にピペットする。固定カメラの下の機器の撮像チャンバ内に蓋付きの6ウェルプレートを置き、チャンバドアをロックします。ソフトウェアを開き、計測器を初期化します。画像ごとに 1 つのウェルのみの視覚化とキャプチャを可能にするカメラ設定を選択したら、イメージするウェルをカメラの真下に配置します。ROIツールを使用して、腫瘍の形状と大きさの周りにそれを合わせ、ROIを測定し、総測定値を報告して、スライス上の各腫瘍の生物発光シグナルを定量化します。プレートを滅菌層流フードに戻した後、鉗子を使用してインサートをウェルからわずかに持ち上げます。培地を吸引した後、培地を1ミリリットルの新鮮な培地と交換し、差し込み口をウェルに戻します。スライスを阻害剤や代謝産物などの各種化合物で処理する実験では、1.5ミリリットルのチューブで1.2ミリリットルの脳スライス培地に適切な試薬濃度を調製し、スライスを含むウェルに1ミリリットルの試薬を移します。MDA-MB-231 BR-GFPルシフェラーゼ細胞をヌードマウスに注射し、腫瘍を増殖させ、腫瘍を有する脳を解剖し、スライスし、エクスビボで増殖させ、腫瘍増殖を生物発光イメージングによってモニターした。H&E染色およびGFP陽性蛍光は、脳スライスにおける腫瘍の存在を確認した。Ki−67染色の増加は、増殖性の高い癌細胞の存在を確認した。照射に曝されなかった脳スライス中の腫瘍は、エクスビボで増殖し続けたが、放射線照射に曝露された腫瘍は、持続的な成長を示した。腫瘍を含む脳スライスもライブイメージングを介してモニターし、照射処理後の腫瘍増殖を可視化した。生物発光イメージングと一致して、対照癌細胞はGFP強度が増加し、細胞が脳実質に侵入し始めるにつれて急速に成長した。対照的に、照射で処理した脳スライス中の癌細胞は細胞増殖抑制され、GFP強度は維持されていた。大きな多核癌細胞およびIR処理癌細胞におけるDNA損傷マーカーの染色の増加が検出された。また、反応性アストロサイトの増加も検出された。IR処置誘発性アポトーシスは、腫瘍のないマウス脳スライスでは検出されなかった。腫瘍を含む脳スライスを、化学療法薬であるパクリタキセルの異なる濃度で処理した。治療は、治療の10日目に腫瘍のサイズを有意に減少させた。アポトーシスの増加は、パクリタキセル処理腫瘍細胞において検出された。インヒビター治療は脳組織の生存率を変化させなかった。アポトーシスの増加は、パクリタキセル処理された腫瘍のないマウス脳スライスにおける切断されたカスパーゼ−3染色によって測定されなかった。目的の薬物による治療が終了したら、スライスを免疫細胞化学、オミック研究を通じてタンパク質発現について分析するか、フローサイトメトリーに適した単一細胞懸濁液を達成することができます。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

出典:Ciraku, L., et.alです。乳がんの脳転移性腫瘍の成長を研究し、標的とするためのex vivo Brain Sliceモデル。J. Vis. Exp.(2021).このビデオは、器官型マウス脳スライスにおけるルシフェラーゼ発現腫瘍細胞のイメージングを示しています。ルシフェリンを培地に添加し、プレートをin...

器官型マウス脳スライスにおける腫瘍増殖を評価するための生物発光イメージング

乳癌脳転移マウスモデルをMDA-MB231/Br-GFP細胞の超音波画像誘導の心臓内注射で確立される。多焦点頭蓋内転移の発生は、高解像度の9.4 T MRIを用いて長手方向にモニタされた。...

縦MRIが続く乳がんの脳転移のマウスモデルを開発するために、超音波画像誘導心臓内注射

多くの種類のヒト脳腫瘍は、脳内の特定の領域に局在しており、培養で成長するのが困難です。このプロトコルは、腫瘍微小環境の役割に対処し、器官型マウス脳スライスで増殖する蛍光初代脳腫瘍細胞を分析することにより、新しい薬物治療を調査します。...

腫瘍微小環境と標的薬物療法研究のための脳の腫瘍/器官スライス共培養系

脳転移は、治療の選択肢が緩和的に残っているが、その発生率が増加しているとして緊急に満たされていない医療ニーズとなっています。癌細胞の頸動脈内動脈注射を介して脳転移の実験動物モデルを作成することは、疾患の生物学および新規介入計画の評価の機構研究を容易にします。...

脳転移のマウスモデルを生成するために頸動脈内癌細胞注入

頭蓋内脳転移のモデル化は、腫瘍の大きさと治療に対する反応を正確かつタイムリーな方法で監視できないことによって複雑になる。提示された方法論は、磁気共鳴画像分析と頭蓋内腫瘍注射を組み合わせ、これを組み合わせると、正確で一貫した注射、強化された動物モニタリング、および正確な腫瘍体積測定を育成する。...

頭蓋内注射と磁気共鳴画像による脳転移のモデル化

ここでは、血液脳関門転移性腫瘍微小環境を調製し培養し、共焦点イメージングと人工知能(機械学習)を用いてその状態を定量化するためのプロトコルを提示する。...

臓器オンAチップ3Dモデル、機械学習、共焦点断層法による脳転移性腫瘍微小環境の定量化

内因的にHER2増幅された炎症性乳癌細胞株の尾静脈注射によって生成された乳癌脳転移の異種移植マウスモデルについて説明します。...

炎症性乳癌細胞の尾静脈注射による脳転移のモデル化

脳転移は、癌患者の重度の罹患率と死亡率の原因です。ほとんどの脳転移マウスモデルは、死亡率および治療介入結果の交絡分析を混乱させる全身性転移によって複雑になります。ここに提示されるのは、最小限の全身腫瘍で一貫した頭蓋内腫瘍を生成する癌細胞の内部頸動脈注射のためのプロトコルです。...

がん細胞の内頸動脈注射による脳転移のモデル化

ニワトリ胚は、 ovo および ex vivo 脳スライス共培養におけるヒト膠芽腫(GBM)脳腫瘍の研究に使用されます。GBM細胞の挙動は、 ex vivo 共培養におけるタイムラプス顕微鏡によって記録することができ、両方の調製物は、詳細な3D共焦点分析によって実験エンドポイントで分析することができる。...

ニワトリ胚脳をモデルとしてヒト膠芽腫細胞挙動の in vivoおよび ex vivo 解析(英語)

立体定位頭蓋内注射技術は、マウス皮質への腫瘍細胞の正確かつ局所的な移植を可能にし、脳の転移性コロナゼーションを研究する強力なモデルとなっています。...

脳転移のモデル化:立体定位皮質内注射による転移性コロナゼーションおよび組織学的成長パターンの標準化解析

学ぶ乳がん脳転移性腫瘍の増殖メカニズムと治療効果評価法。ex vivo脳スライスモデルを用いて薬剤・放射線応答をリアルタイムで測定し、腫瘍微小環境における治療戦略を探索する。

乳がん脳転移性腫瘍増殖を研究し、標的とする Ex Vivo 脳スライスモデル

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