Name: アペレットヒト産物からのガンマデルタ(γδ)T細胞の増殖と濃縮 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-09-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 51 s
Description: 学ぶガンマデルタT細胞の増殖法。アペレットヒト産物からゾレドロン酸とIL-2を用いて20万倍以上に拡張し、磁気分離でαβT細胞を除去、人工抗原提示細胞と共培養して高純度製剤を得る。がん免疫療法への応用に有用です。

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私たちは、このプロトコル開発のための資金を提供するためのモフィット癌センターからの細胞免疫療法 -研究者開始試験賞の壁内資金機会に感謝します。また、クラウディオ・アナセッティ博士の貴重な支援と指導に感謝します。最後に、ジャスティン・ブーシェ博士の洞察と原稿のレビューに感謝します。

注:IRBの承認を得て、ドナーからインフォームド・コンセントを得ました。
1. リンパ球の分離
<ol><li>アペレシス製品をクリーンルームに移します。 注: プロセス検証は、原料材料収集規則に準拠した外部の商用ベンダーからの通常のドナーアペレシスを使用して実行されました。</li>
	<li>滅菌試験、細胞数、細胞のフェノタイピング用のサンプルを収集します。</li>
	<li>1%のヒト血清アルブミン(HSA)と生理食塩水の二次媒体(0.9%塩化ナトリウム注入USP)またはダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を有するハンクスバランス塩溶液の一次培地を使用したカウンターフロー遠心分離装置上のElutriate。溶出遠心速度を900× g に設定し、流量と時間に基づいて分数を収集します。</li>
	<li>分数2からサンプルを収集し、次のテストを実行します: 2 mL の滅菌試験。アクリジンオレンジ/ヨウ化プロピジウム(AO/PI)を使用した細胞数および生存率の0.5 mL;5 ×フローサイトメトリーによる細胞フェノタイピング用106 細胞。</li>
	<li>1L閉系バイオリアクターで10×106 細胞/cm2 で培養中の純粋なリンパ球分画(画分2)を、ゾレドロン酸5μmol/L、IL-2の300 IU/mLを含む1L閉系バイオリアクターで拡張します。</li>
	<li>5%CO2で37°Cに設定インキュベーターで7日間インキュベート。</li>
</ol>2. α-β(αβ) T細胞枯渇
<ol><li>1 L閉系バイオリアクターフラスコから細胞を収穫する。滅菌溶接1L転写パックを閉系バイオリアクターの赤線に、適切な製薬ポンプを使用して細胞を移送パックに移す。</li>
	<li>次のサンプルを取る:使用済み中型の無菌性のための10 mL;AO/PIを使用した細胞数および生存率のための細胞の0.5 mL;5 × 106 細胞のフローサイトメトリー</li>
	<li>リン酸緩衝生理食塩分(PBS)または(PBS/エチレンアミンテトラ酢酸(EDTA))緩衝液+0.5%HSAおよびビオチン化TCRαβ特異的抗体中の108 細胞/mL×〜5個で細胞を再懸濁させる。</li>
	<li>冷蔵庫にシェーカーを入れ、2~8°Cで約15分間揺れながらインキュベートします。</li>
	<li>合計600 mLのPBS/EDTAバッファー+ 0.5% HSA で細胞を洗浄します。遠心分離機は2〜8°Cで15分間200〜500× g で非結合抗体を除去した。 PBS/EDTA バッファー内の約 5 × 108 細胞/mL + 0.5% HSA を抗ビオチン特異的マイクロビーズ (7.5 mL/1 バイアル) で再中断します。</li>
	<li>冷蔵庫にシェーカーを入れ、2~8°Cで約15分間揺れながらインキュベートします。インキュベーション後、2〜8°Cで15分間200〜500× g で細胞を遠心分離し、バインドされていないマイクロビーズを除去します。PBS/EDTA バッファー + 0.5% HSA で~6 個の × 107 個のセル/mL を再中断し、転送パック バッグに移します。</li>
	<li>メーカーの指示に従って臨床グレードの磁気細胞分離装置にチューブセットを取り付け、PBS/EDTAバッファーとトランスファーパックを機器にセル製品と一緒に置き、機器の指示に従ってスパイクします。</li>
	<li>ラベル付きαβ T細胞の枯渇のための 枯渇1.2 プロトコルを選択します。</li>
	<li>遠心分離機は、標的分画(エンリッチ化したγδT細胞)を、10%ヒトAB血清を添加した培地中で細胞を再懸濁する。</li>
	<li>0.5 mLサンプルを採取し、AO/PI染色で細胞数と生存率を実行します。細胞を約1×106 個の細胞/mLの最終濃度にします。フローサイトメトリーフェノタイピングポスト枯渇のための製品の5×106 細胞のサンプルを取る。</li>
</ol>3. aAPCとの共同文化
<ol><li>X線発生装置で100Gyで5×107 aAPC/フラスコを照射します。</li>
	<li>aAPCを共培養でγδT細胞と10:1の比率で使用します。照射したaAAPC(5×107 細胞/フラスコ)とγδT細胞(5×106 細胞/フラスコ)を1L閉式バイオリアクターフラスコに1Lの培養培地1Lを1Lに1%ヒトAB血清で添加する。10フラスコまで播種します。</li>
	<li>培養中の細胞を37°C、5%CO2のインキュベーターで10日間培養します。</li>
	<li>ストリップ、グルコース、乳酸メーターを使用して、3〜4日ごとにグルコースおよび乳酸塩レベルを監視します。</li>
	<li>グルコースが250mg/dLに低下した場合、フラスコ内の体積を200mLに減らし、1L転写パックを閉系バイオリアクターの赤線に無菌溶接して製薬ポンプを使用します。</li>
	<li>残りの200mLの細胞を混合し、AO-PI染色による細胞の計数および生存率測定のための0.5 mLサンプルを取る。細胞数が109≥場合は、1つのフラスコを2つのフラスコに分割し、各フラスコを10%のヒトAB血清で補ったAIM-Vで最大1 Lに充填します。細胞数が109<の場合、10%のヒトAB血清を添加した新鮮な1リットルの培養培地で細胞を供給する。</li>
	<li>すべてのフラスコに対してステップ3.6を繰り返し、37°Cおよび5%CO2のインキュベーターに戻します。3 日から 4 日ごとに手順 3.4 ~ 3.7 を繰り返します。</li>
</ol>4. 細胞の収穫
<ol><li>共培養で10日間の終わりに、すべてのバイオリアクターフラスコを収穫する。一度に1つのバイオリアクターフラスコを収穫し、適切なサイズの移動パックにすべての細胞をプールします。滅菌溶接は、閉系バイオリアクターの赤線に転送パックを溶接し、そして、移送パックに細胞を転送するために、製薬ポンプを使用します。</li>
	<li>以下の品質管理サンプルを除去する:血液培養およびグラム染色による無菌性のための薬剤製品(DP)の1%;AO/PIを使用したセルカウントおよび生存率の場合は0.5 mL。5-10 ×フローサイトメトリー用106 細胞(gating戦略の 図1 を参照)。0.5 mL の内毒素;グラム染色のための0.5 mL;106 細胞は、マイコプラズマ試験のために使用済み培地の10 mLにスパイクしました。</li>
	<li>室温で15分間200〜500× g で細胞を遠心分離し、上清を捨てます。</li>
	<li>バランスのとれた結晶溶液+0.5%HSAの溶液で細胞を室温で15分間200〜500× g で洗浄します。バランスのとれた結晶溶液+ 0.5%HSAの目標体積100〜300mLで再懸濁します。</li>
</ol>5. リリーステスト
<ol><li>以下のγΔT細胞DPの品質管理試験を行う:純度および同一性(生/死)、CD45、CD3、TCR αβ、TCR γδ、CD20、CD56、CD16;AO/PI染色による生存率;内毒素;ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によるマイコプラズマ試験;グラム染色と好気性および嫌気性血液培養による滅菌;フローサイトメトリーによる残留K562アッセイ(CD3-CD16-CD56-CD71+)。</li>
</ol>

<ol><li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia+relapsing+after+allogeneic+hematopoietic+cell+transplantation%3A+a+center+for+international+blood+and+marrow+transplant+research+study%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Blood+and+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Survival of patients with acute myeloid leukemia relapsing after allogeneic hematopoietic cell transplantation: a center for international blood and marrow transplant research study.</a> Biology of Blood and Marrow Transplantation. 21 (3), 454-459 (2015).</li>
<li>Bejanyan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+outcomes+of+AML+patients+relapsing+after+matched-related+donor+and+umbilical+cord+blood+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Bone+Marrow+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Clinical outcomes of AML patients relapsing after matched-related donor and umbilical cord blood transplantation.</a> Bone Marrow Transplantation. 49 (8), 1029-1035 (2014).</li>
<li>Schmid, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment%2C+risk+factors%2C+and+outcome+of+adults+with+relapsed+AML+after+reduced+intensity+conditioning+for+allogeneic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Treatment, risk factors, and outcome of adults with relapsed AML after reduced intensity conditioning for allogeneic stem cell transplantation.</a> Blood. 119 (6), 1599-1606 (2012).</li>
<li>Siegers, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-leukemia+activity+of+in+vitro-expanded+human+gamma+delta+T+cells+in+a+xenogeneic+Ph%2B+leukemia+model%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Anti-leukemia activity of in vitro-expanded human gamma delta T cells in a xenogeneic Ph+ leukemia model.</a> PLoS One. 6 (2), 16700(2011).</li>
<li>Airoldi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B3%CE%B4+T-cell+reconstitution+after+HLA-haploidentical+hematopoietic+transplantation+depleted+of+TCR-%CE%B1%CE%B2%2B%2FCD19%2B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">γδ T-cell reconstitution after HLA-haploidentical hematopoietic transplantation depleted of TCR-αβ+/CD19+ lymphocytes.</a> Blood. 125 (15), 2349-2358 (2015).</li>
<li>Acuto, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+T+cell+receptor%3A+appearance+in+ontogeny+and+biochemical+relationship+of+alpha+and+beta+subunits+on+IL-2+dependent+clones+and+T+cell+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The human T cell receptor: appearance in ontogeny and biochemical relationship of alpha and beta subunits on IL-2 dependent clones and T cell tumors.</a> Cell. 34 (3), 717-726 (1983).</li>
<li>Xiao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+with+engineered+K562+feeder+cells+in+G-Rex+vessels+and+their+use+as+chimeric+antigen+receptor-modified+effector+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Large-scale expansion of Vγ9Vδ2 T cells with engineered K562 feeder cells in G-Rex vessels and their use as chimeric antigen receptor-modified effector cells.</a> Cytotherapy. 20 (3), 420-435 (2018).</li>
<li>Peters, C., Kouakanou, L., Oberg, H. H., Wesch, D., Kabelitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+expansion+of+V%CE%B39V%CE%B42+T+cells+for+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">In vitro expansion of Vγ9Vδ2 T cells for immunotherapy.</a> Methods in Enzymology. 631, 223-237 (2020).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+V%CE%B39V%CE%B42+T-cell+immunotherapy+exhibits+promising+clinical+safety+and+prolongs+the+survival+of+patients+with+late-stage+lung+or+liver+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+%26+Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Allogeneic Vγ9Vδ2 T-cell immunotherapy exhibits promising clinical safety and prolongs the survival of patients with late-stage lung or liver cancer.</a> Cellular & Molecular Immunology. 18 (2), 427-439 (2021).</li>
</ol>

著者らは開示する利益相反はない。

Moffit細胞療法ラボは、臨床試験でDPとして使用するための高純度γδT細胞の二倍体膨張を有するプロトコルを開発しました。このプロトコルは、ゾレドロン酸およびWCB aAPCによって正常に活性化および拡張される非常に純粋なγδT細胞DPをもたらす閉じたシステムにおけるcGMPガイドラインの下での製造方法を提供する。このプロトコルは、AML患者のための同種γδT細胞DPの製造のためにFDAによって承認されている。健康なドナーを用い、ドナーγδT細胞の小集団を2.06±0.45%から54.45%±28.34%にわずか7日間で拡大することに成功しました。ゾレドロン酸による7日間の拡張後、ドナー2はNK個体数の増加を示した。
ゾレドロン酸は、単球におけるファルネシル二リン酸合成酵素(FDPS)を阻害し、これは、T細胞および天然NK細胞の増殖の有意な増加と相関しているイソペンテニルピロリン酸(IPP)の蓄積をもたらす7,8,9。このNK個体数の増加は、aAAPcがNK細胞のさらなる拡大に寄与するだけとなるため、aAAPCとの第2段階の拡大を妨げる。このため、ドナー基準は、NK集団の多いドナーを除外するように変更された。αβT細胞の枯渇後、γδT細胞をさらに27.51%±76.61まで濃縮した。このユニークなプロトコルは、γδT細胞内のCD8、CD28、およびCD127L受容体を標的とするモビット製造aAPCを利用する第2の拡張を含む。この第2のaAPCを用いた膨張期は、CD3+TCRγδ+T細胞、≤1%TCRαβT、<35%CD3-CD16+CD56+NK細胞に対して≥65%のDPを生み出した。K562由来のaAPCを使用したため、これらのaAAPCが最終製品の1%<で構成されていることを実証する必要がありました。
Moffit CTFは、最終DPの残存K562細胞の割合を測定するために放出基準に使用されるフローサイトメトリックアッセイを開発した。このフローサイトメトリックアッセイは、細胞表面抗原を利用してK562細胞を同定するという問題をすべて軽減します。活性化T細胞はCD71を発現することができるので、CD3-CD56-およびCD16-集団をgatingし、その後、K562細胞となるCD71+細胞を調べることによって、すべてのT細胞およびNK細胞を除外する戦略を考案した。このプロトコルは、γΔT細胞DPが0.48±0.42%の残留K562細胞を生成し、pcrによる≥70%生存率、マイコプラズマ否定性、グラム染色によって見られない生物、≤2 EU/mLの内毒素、および成長なしの最終的な(14日間)血液培養滅菌の全ての放出基準を満たすことを示している。

白血病再発は、AML1,2,3患者における造血細胞移植(HCT)後の死亡の主な原因である。より良い白血病を含まない生存率は、移植片対宿主病(GVHD)4のリスクを増加させることなく、HCT後の血中γδT細胞の回復の増加とともに報告された。γδ T細胞がMHC非依存的な方法で抗原を認識し、強力な細胞分解性およびTh1様エフェクター機能を開発する能力は、このT細胞の小さな亜集団を再発の危険で同種移植を受けているAML患者の治療に理想的にする。Vγ9Vδ2 T細胞は、周辺のT細胞の0.5%から5%の範囲のTリンパ球のマイナーサブセットであることを考えると、我々は臨床試験のための潜在的に治療用量を達成するために、この稀な血液細胞集団を拡大するための堅牢なシステムを確立することに着手した。
他の人はゾレドロン酸、さらにはaAPCを用いてγδT細胞を拡大することに成功しているが、我々は潜在的に229,749倍のγδT細胞を拡大することができるプロセスを開発した。拡大は二機体性である:まず、リンパ球は分離器具を用いた溶出によって得られる。装置は逆流遠心によってサイズ、形および密度に基づいて細胞の分離を可能にする閉鎖されたシステムを提供する。リンパ球の濃縮後、Vγ9Vδ2 T細胞の選択的拡張は、ゾレドロン酸およびIL-2で7日間の処理によって達成される。この処理の直後に、TCR-αβ T細胞は、マイクロビーズ技術を用いて枯渇し、その後、K562由来のaAPCを有するγδT細胞の増殖を可能にする。
プロセス検証のために、aAPCとの相2共培養拡張に使用されたのは、106 ×のゾレドロン酸拡張γδT細胞に対してのみ使用された。この第2段階の拡張では、γδ T細胞は、遺伝子組み換えK562由来aAPC(K562VL6(K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA)の現在のグッドマニュファクチャリングプラクティス(cGMP)準拠の作業セルバンク(WCB)を使用して活性化されます。この二相膨張の理論的根拠は、単球におけるファルネシル二リン酸合成酵素(FDPS)を阻害するゾレドロン酸の能力に基づいており、Vγ2Vδ2細胞を直接刺激するイソペンテニルピロリン酸の蓄積をもたらす。拡張の第2段階では、K562由来のaAPC(K562VL6(K562VL6(scFv-CD3-41BBL;scFv-CD28-IL15-RA))は、すべてのT細胞に強い刺激を与えます。しかし、細胞産物はγδT細胞について既に濃縮されており、γδT細胞の強健な膨張をもたらす。
特定の装置およびフラスコを使用することで、プロセスは機能的に閉鎖されたシステムであり、汚染のリスクを減少させる。さらに、1 L閉系バイオリアクターは、摂食の必要性を最小限に抑え、培地の総体積1Lにおける細胞の最大成長および拡張を促進する。Moffitt法の利点は、同種投与のための高純度のドナー由来γδT細胞産物を製造する迅速、再現性、および高い実現可能なGMPシステムを提供することにある。この方法は、Vγ2Vδ2 T細胞受容体を発現するヒトγδT細胞を、部分的かつ完全寛解の癌患者における微生物および腫瘍に対する免疫を媒介する養子免疫療法として使用することを目的とするあらゆる臨床試験に適用することができる。また、γδキメラ抗原受容体陽性(CAR+)T細胞の開発および生産のための堅牢なプラットフォームを提供する。

<table><tbody><tr><td>ハンクスバランスソルトソリューション</td><td>R&D</td><td>285-GMP</td><td></td></tr><tr><td>ヒト アルブミン 25%</td><td>グリフォリス</td><td>65483-16-071</td><td></td></tr><tr><td>血漿溶解物 A</td><td>フィッシャー</td><td>2B2543Q</td><td></td></tr><tr><td>ゾレドロン酸 (ゾメタ)</td> <td>ホスピラ</td><td>4215-04--8</td><td>FDA 承認薬</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>WAK-CHEMIE MEDICAL GMBH</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>CS10</td><td>バイオライフ ソリューション</td><td>210374</td><td></td></tr><tr><td>3 mLシリンジ</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>20 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>50 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>100 mL シリンジ</td><td>JMS</td><td>992861</td><td></td></tr><tr><td>18g ニードル</td><td>フィッシャー</td><td>305198</td><td></td></tr><tr><td>クライオバイアル 1.8 mL</td><td>フィッシャー</td><td>375418</td><td></td></tr><tr><td>5 mLピペット</td><td>Fisher</td><td>1367811D</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ピペット</td><td>Fisher</td><td>1367610Q</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ピペット</td><td>Fisher</td><td>1367811E</td><td></td></tr><tr><td>100 mL ピペット</td><td>Fisher</td><td>07-200-620</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐</td>形 <td>Fisher</td><td>05-539-12</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 円錐</td>形 <td>Fisher</td><td>05-539-7</td><td></td></tr><tr><td>250 mL 円錐</td>形<td>フィッシャー</td><td>430776</td><td></td></tr><tr><td>600 mL トランスファー パック</td><td>TERUMO BCT INC</td><td>1BBT060CB71</td><td></td></tr><tr><td>4" プラズマ トランスファー セット</td><td>INDEPENDENT MEDICSL ASSOCIATES</td><td>03-220-90</td><td></td></tr><tr><td>Elutra チューブ セット</td><td>テルモ BCT</td><td>70800</td><td></td></tr><tr><td>100 MCS GREX</td><td>WILSON WOLF MFG CORP</td><td>81100-CS</td><td></td></tr><tr><td>アシュトン 滅菌ポンプ 液体ディスペンシング システム</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-246660</td><td></td></tr>ア<tr><td>カシアポンプブーツ</td><td>MPSメディカル</td><td>17789HP3MLL</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS PBS / EDTA</td><td>バッファーMiltenyi Biotec Inc</td><td>130-070-525</td><td></td></tr><tr><td>Dornase Alpha</td><td>Genentech、Inc</td><td>50242-100-40 / 186-0055</td><td>FDA承認薬</td></tr><tr><td>1000mL 0.22 umフィルター</td><td>フィ</td><td>ッシャー157-0020</td><td></td></tr><tr><td>血液フィルター170um</td><td>B.ブラウン</td><td>V2500</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACsチューブセット</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-090-719</td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS TCR&alpha;/&beta;キット</td><td>Miltenyi Biotec Inc</td><td>130-021-301</td><td></td></tr><tr><td>Y 型血液セット</td><td>Fenwal</td><td>FWL4C2498H</td><td></td></tr><tr><td>75 mL フラスコ</td><td>フィッシャー</td><td>430641U</td><td></td></tr><tr><td>IL-2</td><td>プロメテウス</td><td>65483-116-071</td><td>FDA 承認薬</td></tr><tr><td>AIM-V</td><td>フィッシャー</td><td>0870112BK</td><td></td></tr><tr><td>ヒト AB 血清</td><td>ジェミニ バイオ製品</td><td>100H41T</td><td></td></tr><tr><td>3リットルトランスファーパック</td><td>インディペンデントメディカルアソシエイツ</td><td>T3109</td><td></td></tr><tr><td>1000&nbsp; ピペットチップ</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>5991040</td><td></td></tr><tr><td>CF-250</td><td>コルビオ</td><td>CF-250</td><td></td></tr><tr><td>エルトラ</td><td>テルモブクト</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CliniMACS</td><td>ミルテニー バイオテック株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GatheRex リキッドハンドリング、セルハーベストポンプ</td><td>ウィルソンウルフ MFGCORP</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HERAcell Vios CO2インキュベーター</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

アペレットヒト産物からのガンマデルタ(γδ)t細胞の増殖と濃縮

Expansion and Enrichment of Gamma-Delta (&#947;&#948;) T Cells from Apheresed Human Product

Vγ9Vδ2 T細胞はTリンパ球のマイナーサブセットであるが、この集団は主要な組織適合性複合体(MHC)に依存しない方法で抗原を認識し、癌免疫療法の理想的な候補となる強力な細胞分解エフェクター機能を開発する能力のために求められている。末梢血中のγ-Δ(γδ)T細胞の低頻度に起因し、急性骨髄性白血病患者(AML)のヒトを初めて使用する薬剤製品として、高純度γδT細胞を大幅に拡大する有効なプロトコルを開発しました。健康なドナーアフェーゼを同種細胞源として使用して、リンパ球は、サイズおよび密度によって細胞を分離するカウンターフロー遠心分離法のための検証済み装置を用いて単離される。 
リンパ球が豊富な分画が利用され、γδT細胞はゾレドロン酸(FDA承認)およびインターロイキン(IL)-2で7日間優先的に活性化される。γδT細胞の優先的な拡大に続いて、臨床グレードの磁気細胞分離装置およびTCRαβビーズが、T細胞受容体(TCR)αβT細胞の汚染を枯渇させるために使用される。高エンリッチ化されたγδT細胞は、CD3およびCD28、41BBL(CD137L)およびIL15-RAをゾレドロン酸およびIL-2と共に発現するために遺伝子操作されたK562細胞に由来する人工抗原提示細胞(aAPC)を用いて2回目の拡張を行う。aAAPcとの共培養で全日7濃縮γδT細胞を播種すると、健康なドナー血液から >平均229,000倍の倍率の拡大を伴う高純度γδT細胞の製造が容易になる。

γδT細胞プロセスを、γδT細胞薬剤産物の製造に対して特徴付け、最適化した。プロセス最適化には、1)溶出を用いたリンパ球濃縮、2)γδT細胞薬物物質(DS)ゾレドロン酸による細胞特異的拡張、3)γδT細胞DSのTCRαβの枯渇、4)K562由来のaAPcを用いたγΔT細胞DSの二次拡張、および5)最終DPおよび製剤を含むプロセス最適化後、3人の健康なドナーから得られた材料を使用して、細胞処理の適合性を確認するために、スケールで確認実行を行った。すべてのデータを分析し、 表1、 表2、表 3にまとめた。逆流後遠心分離画2(F2)から分離された細胞は、平均99.23%のCD45+ 細胞(総ライブゲートの頻度として報告される)と95.80%の優れた平均生存率を有する純粋なリンパ球集団を生み出した(表1)。
ゾレドロン酸によるγδT細胞特異的膨張は、溶出後のリンパ球画分(F2)に存在するナチュラルキラー(NK)細胞の初期割合に依存した。TCRαβ枯渇を伴うγδT細胞DSの濃縮は一貫していた(表2)。3つの健常ドナーから製造されたγδT細胞DPは、0.05%のCD20+B細胞±平均0.11%、0.00%±0.00%のTCRαβ+T細胞を有し、TCRαβ+T細胞の≤1%の放出基準を満たしていた。最終製品のNK細胞の平均割合は17.06%±26.19%で、&lt;35%の放出基準を満たしています。また、最終製品におけるT細胞およびNK細胞系分陰細胞の平均割合は0.48%±0.42%であった(表3)。細胞表面染色およびフローサイトメトリック解析は、図2A-Dに示すように、DSおよびDPの同一性、純度、およびプロセス不純物を特徴付けるために利用された。
二次拡張は、aAPC(K562CL6(Cd3-CD137L:CD28-IL-15RA))の共培養からWCB及びγδT細胞DSを10:1の比率で行い、表 4に示すように全ての放出基準を満たすγδT細胞DPを生成した。また、細胞を染色し、0日目カウンターフロー遠心分離F2細胞でフローサイトメトリーにより評価し、 7日目ゾレドロン酸拡張T細胞、7-TCRαβT細胞枯渇、分化(CD)3、TCRαβ、TCRδγ、CD45RA、CD45RO、CD45RO、CCケモカイン受容体7(CCR7)、プログラムされた細胞死タンパク質-1(PD-1)、17日目の最終DP 細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4(CTLA4)、リンパ球活性化遺伝子3(LAG3)、およびT細胞免疫グロブリンおよびムシンドメイン含有タンパク質3(TIM3)。 図 3 に示すデータは、3 つの独立した実行から平均化され、細胞が枯渇していないことを示しています。モフィットCTFはまた、K562由来のaAPCに関連するDP不純物を決定するために残留K562アッセイを開発しました(図4)。
細胞タイプのパーセンテージを特徴付けるために使用されるフローサイトメトリック・ゲージ戦略は、1)TおよびNK細胞系系負母集団(CD3-CD56-CD16-)における格子化である。2)CD71+上のゲート(エリスロイド系統およびAMLで発現するトランスフェリン受容体は、残留K562細胞の検出を可能にする)。この格言戦略は、AAPC(K562CL6(scFv-CD3-CD137;scFv-CD28-IL15-RA)WCB(図4の「残余K562」と呼ばれます)であるCD3-CD16-CD56-CD71+セルの評価を可能にしました。<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig01.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig01large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig02.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig03.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig03large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62622/62622fig04.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62622/62622fig04large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2" rowspan="2"></td><td colspan="3"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="8"></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td colspan="2" rowspan="2"></td><td colspan="3"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="8"></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td rowspan="11"></td><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="15"></td><td colspan="2" rowspan="2"></td><td colspan="3"></td><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="8"></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"></td><td colspan="3"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="7"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td><td colspan="2"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

提示は、ガンマデルタ(γδ)T細胞薬剤産物の拡張のためのプロトコルである。リンパ球は溶出により単離され、γδ濃縮はゾレドロン酸とインターロイキン-2で濃縮される。α-βT細胞は、臨床グレードの磁気分離装置を使用して枯渇する。γδ細胞をK562由来、人工抗原提示細胞と共培養し、拡大する。

アペレットヒト産物からのガンマデルタ(γδ)T細胞の増殖と濃縮

Although V&#947;9V&#948;2 T cells are a minor subset of T lymphocytes, this population is sought after for its ability to recognize antigens in a major ...

ガンマ-デルタT細胞は、急性骨髄性白血病を含む多くの癌タイプに対して強力な細胞傷害活性を有する。しかし、血液中のガンマデルタT細胞の循環は、特に悪性腫瘍患者において比較的まれである。ドナー由来の注入は、X-vivoがガンマデルタT細胞を拡大し、白血病の再発を減少させ、急性骨髄性白血病患者の生存率を向上させることを約束している。提案された方法は、ガンマデルタT細胞拡張を200,000倍以上に達成し、3つの簡単なステップで、高度に純粋なガンマデルタT細胞製品の治療関連用量に達する。したがって、IELを拡張に結び付け、磁気選別によるαベータT細胞枯渇、AAAPCによるバウンティ二次膨張。提案された方法は、急速に棚から使用することができる細胞の多数を作成することにより、癌や自己免疫疾患などの疾患のためのガンマデルタT細胞の有用性を拡大します。このプロセスは、異なる濃縮方法を使用してガンマデルタ細胞を拡張し、トランスダクションなどの追加の操作を追加するように調整することができます。この手順のデモンストレーションは、私の研究室の細胞療法技術者であるLAで行われます。発泡性製品サンプルの溶出から始まり、カウンターフロー遠心分離装置上で、ハンクスバランス塩溶液の一次培地を用いて、1%ヒト血清アルブミンおよび生理食塩水またはDPBSの二次培地を用いる。900倍Gの溶出遠心速度で、流量と時間に基づいて分数を収集します。分数2からサンプルを収集し、フローサイトメトリーによる無菌性試験、細胞数および細胞平定化を行います。分数2から、培養中の純粋なリンパ球分画を10倍の10倍の6番目の細胞に拡大し、ゾレドロン酸の1リットル当たり5マイクロモル、インターロイキン2のミリリットル当たり300単位を1リットルの閉鎖系バイオリアクターに展開する。5%の二酸化炭素で、摂氏37度で7日間システムをインキュベートします。インキュベーション後、1リットル閉系バイオリアクターフラスコから細胞を収穫する。これを行うには、滅菌は、バイオリアクターの赤線に1リットルの転写パックを溶接し、適切な製薬ポンプを使用して細胞を移送パックに移す。フローサイトメトリーによる使用済み中型滅菌、細胞数および細胞のフェノタイピングの試験用サンプルを取る。残りのサンプルから、5回10〜1ミリリットル当たり8番目の細胞で細胞を再懸濁し、0.5%HSAおよびビオチン化T細胞受容体を含むPBS-EDTA緩衝液において、αβ特異的抗体。そして、揺れで摂氏2〜8度で細胞をインキュベートします。15分後、0.5 HSAと遠心分離機を含む600ミリリットルのPBS-EDTAバッファーで細胞を15分間、摂氏2~8度で15分間洗浄し、非結合抗体を除去します。次いで、細胞を1ミリリットル当たり約5倍10〜8番目の細胞、0.5%HSAおよび7.5ミリリットルの抗ビオチン特異的マイクロビーズのバイアルあたり7.5ミリリットルを含むPBS-EDTAバッファーで再懸濁した。先に説明したように、細胞を振盪してインキュベートし、細胞懸濁液を遠心する前に、結合していないマイクロビーズを除去する。0.5%HSAのPBS-EDTAバッファー中の1ミリリットル当たり7番目の細胞に6回10回再懸濁する。転送パックバッグにそれらを収集します。楽器の指示に従ってスパイクします。次に、臨床グレードの磁気細胞分離装置にチューブセットを取り付けます。PBS-EDTAバッファーを備えたパックと、セル製品を持つ転送パックを機器に入れます。アルファβT細胞の枯渇については、ソフトウェアで枯渇1.2プロトコルを選択します。次に、細胞産物を遠心分離し、ガンマデルタT細胞を濃縮した標的画分を回収する。回収した細胞を培地中で再中断し、10%ヒトAB血清を補った。細胞数の生存率およびフローサイトメトリーのフェノタイピングポストの枯渇を行う。1ミリリットル当たり6番目の細胞に約10倍の最終濃度に細胞を持って来ます。X線発生装置上で100グレーで、フラスコ当たり7番目の人工抗原提示細胞またはAAAPCに5回10回照射する。共培養を調製し、照射されたAAAAPCおよびガンマデルタT細胞を10の割合で配置することにより、1リットルの閉じた系バイオリアクターフラスコに。1リットルの培養培地を用いて、10%ヒトAB血清を補充し、最大10フラスコをシードする。37°C、5%の二酸化炭素で培養を10日間インキュベートし、3~4日ごとに、ストリップ、グルコース、乳酸メーターを使用してグルコースと乳酸塩のレベルをスクリーニングします。グルコースレベルが1デシリットル当たり215ミリグラムに低下した場合は、フラスコの体積を200ミリリットルに減らします。残りの200ミリリットルの培地中の細胞を混合し、アクリジンオレンジまたはヨウ化プロピジウム染色による細胞計数および生存率測定用の0.5ミリリットルのサンプルを除去する。細胞数が等しい場合、または10以上の9番目に、1つのフラスコの内容物を2つに分割し、各フラスコをAIM-V培地で1リットルまで満たし、10%ヒトAB血清を補う。細胞数が10〜9番目未満の場合は、新鮮な1リットルの培養培地で細胞を供給し、10%ヒトAB血清を添加し、フラスコをインキュベーターに戻す。共培養で10日間の終わりに、バイオリアクターフラスコを一度に1つずつ収穫し、すべての細胞を適切なサイズの移送パックに引き込む。品質管理試料を取り出した後、室温で15分間Gの200〜500倍の細胞を遠心し、上清を捨てる。バランスのとれた結晶溶液の溶液で細胞を洗浄し、室温で15分間Gの200〜500倍で0.5%HSAを補う。0.5%HSAのバランスのとれた結晶溶液の目標体積100〜300ミリリットルでそれらを再中断します。ポストカウンターフロー遠心分離画分から分離された細胞。2つは純粋なリンパ球集団を生み出し、95.80%のガンマデルタT細胞特異的増殖の優れた平均生存率を有し、ゾレドロン酸は溶出後のリンパ球画分に存在するナチュラルキラー細胞の初期割合に依存した。ガンマデルタT細胞薬物物質の濃縮は、T細胞受容体αβ枯渇を有する一貫した。3つの健常ドナーから製造されたガンマデルタT細胞薬剤製品は、T細胞受容体α陽性T細胞の1%未満の放出基準を満たし、平均0.11%CD20陽性B細胞、および0.00%T細胞受容体α陽性T細胞を有する。最終生成物におけるナチュラルキラー細胞の平均割合は、35%未満の放出基準を満たす17.06%前後であり、細胞細胞量分析の流れは、薬物物質および薬物産物のアイデンティティ、純度およびプロセス不純物を特徴付けるために利用された。第2の再拡張は、AAPCとガンマデルタT細胞薬物物質の共培養から達成され、すべての放出基準を満たすガンマデルタT細胞薬剤製品を生成した。T細胞集団を豊かにするパトンは、製品の膨張と特性に影響を与えます。濃縮プロセスを開始する前に、濃縮方法の十分な検討と調査が必要です。

expansion-enrichment-gamma-delta-t-cells-from-apheresed-human

Research

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Cancer Research

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