タンパク質毒性ストストレスマによる 大腸菌 治療後のタンパク質凝集体の抽出と可視化
2021年6月29日
このプロトコルは、タンパク質毒性抗菌剤による処理後の 大腸菌 からの凝集および可溶性タンパク質の抽出と可視化を記述する。この手順に従うと、異なる細菌株および/または治療間 のインビボで のタンパク質凝集形成の定性的比較が可能となる。
ストレスにさらされると、タンパク質の凝集を引き起こし、細菌の現象の挙動に重大な変化をもたらす可能性があります。このビデオで説明した手順は、ストレス処理後のタンパク質凝集体の抽出と可視化を可能にします。他の公表された手順とは対照的に、このプロトコルは、より低い細胞数を必要とし、複雑な物理的破壊プロセス、ならびに時間のかかる洗浄およびインキュベーションステップを控える必要があります。
このプロトコルは、グラム陰性およびグラム陽性菌の多種多様なタンパク質凝集を研究するために使用することができます。また、遺伝子欠失の効果を分析したり、タンパク質毒性化合物の有効性を比較することもできます。大腸菌株MG1655および泌尿器病性大腸菌株CFT073の単一コロニーを、それぞれ5ミリリットルのリソゲニーブロス(LB)培地に接種することから始めます。
2つのスープ培養物を摂氏37度、300rpmで14~16時間インキュベートします。各株を600ナノメートル(OD600)の光学密度に希釈し、0.1の70ミリリットルのMOPS-g培地を含む500ミリリットルのフラスコにします。中対数相に達するまで37度と300rpmでフラスコをインキュベートします。
インキュベーション後、各培養物20ミリリットルを3つの事前に温めた125ミリリットルのフラスコに移し、摂氏37度と300rpmで2分間培養します。MOPS-g培地で2ミリグラム/ミリリットルの抗菌化合物溶液を調製する。各培養液にこの溶液を加え、所望の濃度に達し、未処理の制御に必要な量のMOPS-g培地を加える。
45分間のストレス処理の後、各培養のOD600を決定する。各サンプルについて、15ミリリットルの遠心分離管に1つのOD600を有する4ミリリットルの培養物をアリコートする。細胞ペレットを氷冷ライシスバッファーの 50 マイクロリットルに再懸濁します。
氷の上で30分間サンプルをインキュベートします。360マイクロリットルの氷冷バッファーAをサンプルに加え、ピペットで軽く混ぜます。サンプルを0.5ミリメートルのガラスビーズの約200マイクロリットルで2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に移します。
1400 rpmで振るサーモミキサーで8°Cで30分間チューブをインキュベートします。ガラスビーズを落ち着かすために振ることなく、氷の上にチューブを5分間インキュベートします。その後、200マイクロリットルの細胞ライセートを1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブに移します。
細胞を16,000倍gと摂氏4度で20分間遠心分離します。後で可溶性タンパク質サンプルとして使用される上清を収集します。ピペットを使用して、16,000グラム、摂氏4度の氷冷バッファーA.遠心分離機の200マイクロリットルのペレットを20分間再懸濁させます。
その後、慎重に上清を完全に削除します。ピペットを使用して、200マイクロリットルの氷冷バッファーB.遠心分離機でペレットを慎重に再懸濁し、上清を慎重に取り除きます。その後、バッファーA.1x低減SDSサンプルバッファーの100マイクロリットルでペレットを再懸濁し、95°CでThermoMixerで5分間沸騰させます。
100%TCAの1つのボリュームを、先に採取した可溶性タンパク質サンプルの4つのボリュームと混合し、タンパク質沈殿のために摂氏4度で10分間インキュベートします。試料を21,000倍gと摂氏4度で5分間遠心し、沈殿物を得て、上清を除去する。200マイクロリットルの氷冷アセトンを使用してペレットを洗浄し、細胞の破片を除去します。
試料を再び遠心分離し、沈殿物を得て、上清を除去した。残りのアセトンをペレットから取り除くには、サーモミキサーのマイクロ遠心チューブを蓋を開けたまま摂氏37度に保ちます。その後、1x減らすSDSバッファーの100マイクロリットルを加え、ペレットを完全に溶解し、サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。
分離のためにSDSポリアクリルアミドゲルにサンプルをすぐにロードするか、後で進むためにマイナス20°Cでサンプルを保存します。テキスト原稿に記載されているように、2つの分離ゲルを準備します。ガラス板の間に1ミリリットルのピペットを使用してゲルを注ぎ、上の2センチメートルに混合物が含まれないようにします。
分離ゲルの上に70%エタノールを加え、2つの層の間に均一な界面を作り出す。分離ゲルが重合したら、テキスト原稿の指示を使用して積層ゲルを調製します。次いで、分離ゲルからエタノールを取り出し、スタッキングゲル溶液を添加する。
気泡を入れずに必要な数のポケットを持つ櫛を慎重に挿入し、ゲルを20〜30分間重合させます。各サンプルの4マイクロリットルとタンパク質ラダーを別々の井戸に積み込みます。その後、室温で45分間144ボルトでトリスグリシンランニングバッファでゲルを実行します。
事前に温められたフェアバンクス溶液Aを使用してロッカーのゲルを30分間染色し、事前に温めたフェアバンクス溶液Dを使用して、所望の背景が達成されるまでロッカーのゲルを脱色させます。細胞を1ミリリットル当たり175マイクログラム、抗菌菌1ミリリットル当たり200マイクログラムで処理した場合に形成されたタンパク質凝集体の量の増加が、未処理細胞と比較して観察された。不溶性タンパク質画分の増加は、より敏感なMG1655株でより顕著であった。
未治療細胞と比較して、細胞を1ミリリットル当たり175マイクログラム、抗菌菌1ミリリットル当たり200マイクログラムで処理した場合、可溶性タンパク質の量が減少することが観察された。このプロトコルを試みる際には、サンプル中のタンパク質凝集の程度を比較するためには、600ナノメートルでの光学密度への正規化が重要であることを覚えておいてください。
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概要
このプロトコルは、タンパク質毒性抗菌物質に曝露した大腸菌からタンパク質凝集体を抽出し可視化する手法を説明しています。異なる細菌株と処理間でタンパク質凝集を定性的に比較することができます。
主要な研究要素
科学分野
- 微生物学
- タンパク質凝集
- 抗菌薬耐性
背景
- ストレスは細菌のタンパク質凝集を誘発する可能性があります。
- タンパク質凝集は細菌の表現型を大きく変えることができます。
- このプロトコルは既存の方法よりも単純で、必要な細胞数が少なくなります。
- 複雑な物理的破壊や長時間の洗浄ステップを避けます。
研究目的
- 細菌のタンパク質凝集体を抽出し可視化する。
- 異なる細菌株間でのタンパク質凝集を比較する。
- 遺伝子欠損とタンパク質毒性化合物の効果を分析する。
使用方法
- LB培地への大腸菌MG1655およびCFT073株の接種。
- 処理後の可溶性および凝集タンパク質の抽出。
- タンパク質凝集体の可視化。
- 株と処理間での結果の定性的比較。
主な結果
- 処理した大腸菌からのタンパク質凝集体の成功的な抽出。
- 株間での凝集の違いを示しました。
- タンパク質毒性ストレスの効果に関する洞察を提供しました。
- タンパク質凝集に対する遺伝子欠損の分析を可能にしました。
結論
- このプロトコルはタンパク質凝集の研究に効率的です。
- グラム陰性菌とグラム陽性菌の様々な細菌に適用できます。
- 細菌研究におけるタンパク質凝集体の分析プロセスを簡素化します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Protein aggregation under proteotoxic stress is a critical challenge in microbial strain engineering and antimicrobial discovery. This extraction and visualization protocol enables rapid, comparative assessment of aggregation phenotypes across bacterial strains, supporting early-stage target validation and mechanistic de-risking. The method's scalability and simplicity facilitate integration into discovery pipelines evaluating proteostasis modulators and antimicrobial candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of proteostasis pathways and stress response mechanisms in bacteria.
- Supports functional validation of genetic targets influencing aggregation phenotypes.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing compound-specific aggregation effects.
- Provides comparative data for prioritizing strain or target selection in antimicrobial programs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated bacterial systems for downstream screening of proteotoxic compounds.
- Delivers reproducible, qualitative aggregation readouts for assay standardization.
- Enables rapid comparison of compound efficacy and genetic perturbations on aggregation.
- Supports platform reuse across diverse bacterial strains and stressors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking aggregation to phenotypic outcomes.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation of antimicrobial mechanisms.
- Informs risk-adjusted advancement of compounds targeting bacterial proteostasis.
- Offers predictive de-risking for compounds with aggregation-related liabilities.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol fits within the early discovery to lead identification continuum, enabling hypothesis testing and mechanistic evaluation of proteotoxic stress responses in bacteria.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven analysis of aggregation pathways and genetic determinants.
- Screening: Provides reproducible aggregation readouts for compound and genetic screens.
- Analytics: Delivers qualitative and semi-quantitative gel-based outputs for condition comparison.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical models by linking aggregation to phenotypic shifts.
- Enterprise Reuse: Adaptable across bacterial species and stressors for broad R&D applicability.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies.
- Operational Value: Streamlines workflows with reduced cell input and simplified processing.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions for antimicrobial and proteostasis-targeting programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds and genetic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, protein extraction, and gel electrophoresis.
- Needs access to centrifugation, SDS-PAGE, and staining infrastructure.
- Standardization of OD600 normalization is critical for cross-sample comparison.
- Protocol is adaptable to various bacterial strains and proteotoxic agents.
- Qualitative outputs may require complementary quantitative assays for advanced analytics.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:53
Stress Treatment of E. coli Strains MG1655 and CFT073
2:12
Collecting Bacterial Cell Samples
2:43
Extracting the Insoluble Protein Aggregates
4:19
Soluble Protein Sample Preparation
5:30
Separation and Visualization of Extracted Protein Aggregates Using SDS-PAGE
6:49
Results: Visualization of Protein Aggregates After Treatment of Escherichia coli with a Proteotoxic Stressor
7:32
Conclusion
