Name: インビトロでのヒト網膜芽細胞腫の再構築 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 52 s
Description: 学ぶヒト網膜芽細胞腫のインビトロ再構築法。RB1変異導入したhESCから網膜芽細胞腫細胞株を培養し、発生・増殖・治療薬開発の研究に活用できます。

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すべての助けをしてくれた502チームに感謝します。この研究の一部は、北京市自然科学基金会(Z200014)および中国国家重点研究開発プログラム(2017YFA0105300)の支援を受けています。

この研究は、首都医科大学北京同仁病院の施設倫理委員会によって承認されています。H9 hESCはWiCell研究所から入手しています。
1. RB1 変異hESCの生成
<ol><li>RB1のノックアウト(KO)のためのCRISPR/Cas9ターゲティングベクター。
	<ol><li>sgRNAのペアを設計します。 RB1のアブレーションでは、この遺伝子の最初のエクソンを標的とする。フォワードプライマー配列はCACCGCGGTGGCCGGCCGTTTTTCGGであり、リバースプライマー配列はAAACCCGAAAAACGGCCCCACCGCである。 注: 特定の RB1 変異については、修復されたテンプレートも必要です。このプロトコールでは、 RB1-KO細胞株が一例として用いられる。</li>
		<li>製造元の指示に従って、1 μgのpX330-U6-キメラBB-CBh-hSpCas9-2A-PuroをBbsI制限酵素( 材料表を参照)で37°Cで30分間消化します。</li>
		<li>消化されたプラスミドは、製造元の指示に従って精製キットを使用して精製します。 注:酵素反応は、精製キットを使用してアガロースゲルなしで直接クリーンアップできます(材料の表を参照)。</li>
		<li>1 μLのオリゴ1(100 μM)、1 μLのオリゴ2(100 μM)、1 μLの10x T4ライゲーションバッファー、6.5 μLのddH2O、および0.5 μLのT4 PNKを含む反応で、T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)(材料表)を使用して各オリゴペアをリン酸化およびアニールします。 注:手順1.1.1のフォワードプライマーとリバースプライマーはオリゴのペアです。以下のパラメータを使用してサーモサイクラー中でオリゴをリン酸化およびアニールする:37°Cで30分間;95°Cで5分間;毎分5°Cで25°Cまで上昇します。</li>
		<li>室温(RT)で199 μLのヌクレアーゼフリー水に1 μLのオリゴ試薬を加えて、リン酸化およびアニーリングされたオリゴを200倍に希釈します。</li>
		<li>ライゲーション反応を設定し、ステップ1.1.3のBbs1消化プラスミド50 ng、ステップ1.1.5のオリゴ二本鎖1 μL、2xライゲーションバッファー5 μL、リガーゼ1 μL、およびヌクレアーゼフリー水を使用して最大10 μLを混合して、RTで10分間インキュベートします。</li>
		<li>ライゲーション混合物を形質転換し、次のステップのために陽性コロニーを配列決定します。 注:シーケンスにはU6フォワードプライマーまたはリバースプライマーを使用してください。<ol><li>コンピテントセルを氷上で解凍します。</li>
			<li>50 μLのコンピテントセルを1.5 mLのマイクロ遠心チューブに入れます。</li>
			<li>ステップ1.1.6のライゲーション混合物1 μLをコンピテントセルに加えます。</li>
			<li>チューブを上下に3回ピペッティングして穏やかに混ぜます。 注意: ボルテックスはしないでください。</li>
			<li>混合物を氷上に30分間置きます。</li>
			<li>混合物を42°Cで90秒間ヒートショックします。</li>
			<li>抗生物質を含まない室温のルリアベルターニ(LB)ブロス950 μLをチューブに加えます。</li>
			<li>チューブを300rpmのシェーカーに入れ、37°Cで60分間行います。</li>
			<li>LBプレート(ペプトン、カゼイン由来のペプトン、塩化ナトリウム、寒天、アンピシリン)をあらかじめ37°Cに温めてください。</li>
			<li>50〜100 μLの細胞とライゲーション混合物をRTでプレートに広げます。</li>
			<li>プレートを37°Cで一晩インキュベートします。</li>
			<li>プレートから12個のコロニーをピックアップし、アンピシリンを含むLB培地に移します。培地を300rpmのシェーカーに60分間置きます。</li>
			<li>1 μLの細菌溶液(ステップ1.1.7.12から)をPCRのテンプレートとして使用し、陽性コロニーを選択します。</li>
			<li>U6プライマーにより陽性コロニーを配列決定し、設計したsgRNA配列を有するコロニーを次のステップで使用する。</li>
		</ol></li>
		<li>MIDIキットを使用してプラスミドを抽出します(材料の表を参照)。 注:ミニキットを使用したプラスミドの質と量は、次の核効果実験には十分ではありません。ミニキットよりもミディまたはマキシキットの方が適しています。</li>
	</ol></li>
	<li>HESC培養と核代謝。 注意: すべての試薬をRTに予熱します。<ol><li>1 x 10 6 H9細胞を、10 μM Y-27632(ROCK阻害剤)と2 mLの新鮮なncEpic-hiPSC/hESC培地を含むプレコート6 ウェルプレートに解凍します。 注:使用前に、6ウェルプレートを1%成長係数低減基底膜マトリックスで37°Cで少なくとも30分間コーティングします。</li>
		<li>翌日、上清を取り除き、1xダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞をすすぎ、2 mLの新鮮なncEpic-hiPSC/hESC培養液を追加します。</li>
		<li>細胞が約80%のコンフルエンシーになるまで、次の3〜5日間で2 mLの新鮮なncEpic-hiPSC / hESC培養培地で培地を毎日交換します。</li>
		<li>1回または2回通過してhESCの状態を調整する。 注:hESCの状態を特定する最も簡単な方法は形態です。</li>
		<li>未分化H9細胞を6ウェルプレートで80%コンフルエントになるまで培養します。</li>
		<li>核放出の2時間前に、10 μMのY-27632と混合した2 mLの新鮮なncEpic-hiPSC/hESC培地で培地を交換し、1%成長因子低減基底膜マトリックスを使用して12ウェルプレートの1ウェルをプレコートします。</li>
		<li>培地を吸引し、1 mLの予熱したDPBSですすいでください。</li>
		<li>DPBSを除去し、1 mLの細胞解離酵素( 材料の表を参照)とともに37°Cで3.5分間インキュベートします。</li>
		<li>1 mLの新鮮なncEpic-hiPSC/hESC培養液を細胞に加え、ピペットで2回ピペットして、H9細胞を単一細胞懸濁液にします。</li>
		<li>細胞計数用に100 μLの混合物を取り出し、残りを別の2 mLのncEpic-hiPSC/hESC培養培地が入った15 mLの遠沈管に移します。</li>
		<li>200 x g で5分間遠心分離します。上清を除去し、約2 x 106 細胞を100 μLの反応容量に再懸濁します。メーカーのプロトコルに従って、細胞、プラスミド、ヌクレオフェクター、および反応条件に合わせて容量を最適化します。このプロトコルで使用される核放出システムについては 、材料表 を参照してください。 注:一般に、核形成中は気泡は許可されません。</li>
		<li>トランスフェクション後、細胞をプレコートされた12ウェルプレートに移し、1.5 mLのncEpic-hiPSC/hESC培養培地と10 μMのY-27632を添加し、37°C、5%CO2 インキュベーターで細胞を培養します。</li>
		<li>培地を毎日交換してください。48時間後、細胞選択のために2 μg/mLのピューロマイシンを約1週間加えます。 注:最初の3日間で多数の細胞が死にます。残りの細胞は増殖し、ピューロマイシン選択後の翌週にコロニーに生成する可能性があります。選択週には、培地に常に2 μg/mLのピューロマイシンが含まれていることを確認してください。</li>
		<li>顕微鏡下で手動でコロニーを選びます。 注:コロニーの形態はhESコロニーと同じです。培地中の10 μLの白色/通常のピペットチップを使用してコロニーを小片(コロニーあたり2〜6個)に切断し、1つのコロニーを12ウェルプレートの1つのプレコートウェルに移します。</li>
		<li>まず、RB1変異およびオフターゲット状況を特定し(表1)、次いで多能性を同定してRB1ノックアウトH9細胞株を特徴付ける。 注:PCRとサンガーシーケンシングを使用して 、RB1 変異とオフターゲット状況を検出します。RT-PCRおよび免疫蛍光法により多能性マーカーを同定します。</li>
	</ol></li>
</ol>2.ヒト網膜芽細胞腫の発生
<ol><li>RB1-KO hESCのメンテナンス<ol><li>遺伝子編集したH9細胞を、2 mLのncEpic-hiPSC/hESC培地で培養し、成長因子還元基底膜マトリックスコーティングされた6ウェルプレートで培養し、毎日培地を交換します。</li>
		<li>EDTAバッファーを使用して、37°Cで3.5分間、またはRTで5分間継代します。 注:EDTAバッファーは、1x DPBS、5 mM EDTA、および0.9 mg/mLのNaClの混合物です。</li>
	</ol></li>
	<li>網膜細胞分化。 注:分化前に培地Iを準備します。培地Iを調製するには、24.5 mLのダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/栄養混合物F-12(F12)-グルタミン(1x)、24.5 mLのニューロン基礎培地、250 μLの100xサプリメントA、500 μLの50xサプリメントB、0.1 mM ß-メルカプトエタノール、および250 μLの100xL-グルタミンを混合します。使用前にすべての混合物をRTに予熱します。<ol><li>RB1-KO hESCを6ウェルプレートの1ウェルで80%コンフルエントまで成長させます。</li>
		<li>培地を取り出し、1 mLの1x DPBSで細胞を洗い流します。</li>
		<li>1 mLのディスパーゼバッファー( 材料の表を参照)を使用して、37°Cで5分間細胞コロニーを上昇させます。 注:顕微鏡で細胞コロニーを確認します。通常、コロニーの端がロールアウトするのに5分かかります。</li>
		<li>ディスパーゼバッファーを吸引し、1 mLの1x DPBSで細胞を1回穏やかにすすぎます。</li>
		<li>1 mLの培地Iをウェルに加えます。</li>
		<li>培地中の10 μLの白色/通常のピペットチップを使用して、コロニーを小片(コロニーあたり6〜9個)に切断します。 注:一般的に、細胞の約60%〜70%がウェルから剥離します。セルスクレーパーを使用して、培地中の残りの細胞をこすり落とします。</li>
		<li>15 mLチューブ中で200 x g で5分間遠心分離することにより、すべての細胞を回収します。</li>
		<li>約50 μLの上清を残して細胞を培地に分散させた後、細胞を250 μLの成長因子低減基底膜マトリックスと穏やかに攪拌して混合します。 注意: 成長因子低減基底膜マトリックスは、使用前に4°Cまたは氷上に保管してください。分注して-20°Cで保存する場合は、使用前に一晩または少なくとも1時間前に4°Cに置いてください。</li>
		<li>懸濁した細胞を入れた15 mLチューブを37°Cのインキュベーターに20分間保持します。 注:細胞と成長因子の減少した基底膜マトリックスが固化したゲルを形成することを確認してください。</li>
		<li>1 mLの培地Iを15 mLチューブに加え、固化したゲルを2〜3回軽くピペットで固め、1 mLピペットで塊を分散させます。</li>
		<li>9 mLの培地Iを加え、細胞懸濁液を10 cmの細胞培養皿に移します。</li>
		<li>ディッシュを5%CO2 を含む37°Cのインキュベーターに移し、その日を0日目として設定する。</li>
		<li>1日目に顕微鏡を使用して細胞を調べます。 注:皿には何千もの中空嚢胞が観察されました。平均して、1枚のゲル中に3〜4個の嚢胞が観察される。</li>
		<li>5日目に培地を交換してください。上清を15 mLチューブに集め、嚢胞が底に落ち着くのを待ってから、培地を取り除き、新しい培地Iと交換します。 注意: 4日目に培地が黄色になった場合は、4日目に培地を交換し、それ以外の場合は5日目に培地を交換してください。10mLの新鮮な培地Iを元の皿に加えます。何百もの嚢胞がすでに培養表面に付着しています。それらをそこに保管してください。</li>
		<li>チューブ内の嚢胞を2つの10 cm皿に分散させます。 注:少なくとも300個の嚢胞が皿に入っていることを確認してください。嚢胞がコンフルエントでない場合は、嚢胞を他の皿に分離しないでください。それらを元の10 cmの皿に戻します。</li>
		<li>7日目に、ほとんどの嚢胞(95%以上)が皿に付着し、広がり、付着コロニーを形成します。 注:早くも3日目に、付着コロニーが観察されます。</li>
		<li>10日目に、培地を新鮮な培地Iで交換します。 すべての嚢胞が皿に付着していることを確認します。</li>
		<li>次のステップの前に、36 mLのDMEM、12 mLのF12、2%のサプリメントB(v/v)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(NEAA)を混合して、培地IIを準備します。</li>
		<li>細胞が13〜17日目までに広がっていることを確認してください。細胞が広がっているが隣接するコロニーと相互作用していない15日目に次のステップを実行します。</li>
		<li>細胞を1 mLのDPBSで1回すすぎ、1 mLのディスパーゼ溶液を加えて37°Cで5分間浸します。 注意: 5分以内に、セルの端が上昇します。</li>
		<li>ディスパーゼバッファーを除去し、1 mLの1x DPBSで培養物を穏やかにすすぎます。</li>
		<li>培地IIを各10 cmディッシュに10 mL加え、37°C、5%CO2 インキュベーター内で培養する。</li>
		<li>付着培養物は24時間後に自発的に剥離し、網膜オルガノイドに集合する。 注:オルガノイドを形成しない多数の細胞は、次の2日間で死滅します。</li>
		<li>剥離の3日後に、細胞培養皿から細胞を回収し、オルガノイドを15 mLチューブに沈降させます。</li>
		<li>チューブから上清を取り除き、オルガノイドを10 mLの培地IIを含む新しい非付着性ディッシュ(ペトリディッシュ)に次の4日間移します。</li>
		<li>DMEM:F12を3:1の比率(v/v)、2%サプリメントB(v/v)、0.1 mM MEM非必須アミノ酸溶液(NEAA)、8%ウシ胎児血清(FBS)(v/v)、100 μMのタウリン、および2 mMグルタミンを混合して、培地IIIを調製します。</li>
		<li>分離の1週間後に、培地をミディアムIIIに変更します。</li>
		<li>この日から、培地IIIでオルガノイドを培養し、週に2回培地をリフレッシュします。</li>
	</ol></li>
	<li>RB細胞株の樹立 注:すべての試薬はRTで予熱されています。<ol><li>90日目に、RB(80%-90%)は網膜オルガノイドを包含する。したがって、RB細胞株の作製には90日間のRBオルガノイドを選択する。</li>
		<li>ロズウェルパーク記念研究所(RPMI)-1640培地と10%FBSを混合して、1640培地を調製します。</li>
		<li>RPMI-1640培地の顕微鏡下で顕微手術用ナイフを使用して、RBを小片(RBあたり20〜25個)に切断します。</li>
		<li>RPMI-1640培地を取り出し、0.25%トリプシン/EDTAで37°Cで10分間処理します。</li>
		<li>RPMI-1640培地を加えて反応を終了し、200 x g で5分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を除去し、細胞を非接着性ディッシュの1640培地に再懸濁します。</li>
		<li>RB細胞株は浮遊培養物です。週に2回培地を交換し、2週間以内にRB細胞を継代します。 注:初代RB細胞の増殖速度は非常に遅いです。</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cell-derived+organoid+retinoblastoma+reveals+a+cancerous+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cell-derived organoid retinoblastoma reveals a cancerous origin.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (52), 33628-33638 (2020).</li>
<li>Singh, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+stage-specific+proliferation+and+retinoblastoma+genesis+in+RB-deficient+human+but+not+mouse+cone+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Developmental stage-specific proliferation and retinoblastoma genesis in RB-deficient human but not mouse cone precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (40), 9391-9400 (2018).</li>
<li>Xu, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rb+suppresses+human+cone-precursor-derived+retinoblastoma+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rb suppresses human cone-precursor-derived retinoblastoma tumours.</a> Nature. 514 (7522), 385-388 (2014).</li>
<li>Mendoza, P. R., Grossniklaus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Molecular+Biology+and+Translational+Science%22%5BJournal%5D)">The biology of retinoblastoma.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 134, 503-516 (2015).</li>
<li>Benavente, C. A., Dyer, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+epigenetics+of+human+retinoblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Genetics and epigenetics of human retinoblastoma.</a> Annual Review of Pathology. 10, 547-562 (2015).</li>
<li>Wu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+of+MYCN-driven+retinoblastoma+reveals+MYCN-independent+tumor+reemergence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">A mouse model of MYCN-driven retinoblastoma reveals MYCN-independent tumor reemergence.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (3), 888-898 (2017).</li>
<li>Boucherie, C., Sowden, J. C., Ali, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+technology+for+generating+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell technology for generating photoreceptors.</a> Regenerative Medicine. 6 (4), 469-479 (2011).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Lowe, A., Harris, R., Bhansali, P., Cvekl, A., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+adhesion-dependent+cell+survival+and+rock-regulated+actomyosin-driven+forces+mediate+self-formation+of+a+retinal+organoid%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Intercellular adhesion-dependent cell survival and rock-regulated actomyosin-driven forces mediate self-formation of a retinal organoid.</a> Stem Cell Reports. 6 (5), 743-756 (2016).</li>
<li>Zheng, C., Schneider, J. W., Hsieh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+RB1+in+human+embryonic+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Role of RB1 in human embryonic stem cell-derived retinal organoids.</a> Developmental Biology. 462 (2), 197-207 (2020).</li>
<li>Dimaras, H., Corson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma%2C+the+visible+CNS+tumor%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma, the visible CNS tumor: A review.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (1), 29-44 (2019).</li>
<li>Xu, X. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoblastoma+has+properties+of+a+cone+precursor+tumor+and+depends+upon+cone-specific+MDM2+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoblastoma has properties of a cone precursor tumor and depends upon cone-specific MDM2 signaling.</a> Cell. 137 (6), 1018-1031 (2009).</li>
<li>Qi, D. L., Cobrinik, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MDM2+but+not+MDM4+promotes+retinoblastoma+cell+proliferation+through+p53-independent+regulation+of+MYCN+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">MDM2 but not MDM4 promotes retinoblastoma cell proliferation through p53-independent regulation of MYCN translation.</a> Oncogene. 36 (13), 1760-1769 (2017).</li>
</ol>

著者らは、この研究の客観性に影響を与える可能性のある所属、メンバーシップ、資金、または保有金を認識していません。

ヒト網膜芽細胞腫(RB)は、RB1の不活性化とRbタンパク質の機能不全によって引き起こされます。このプロトコルでは、RB1-KO hESCは、ディッシュ中のRBを生成するための極めて重要なステップです。RB1-/-hESCを用いても、網膜オルガノイド分化の方法に起因してRB形成がない可能性がある10。このプロトコルでは、付着培養から浮遊培養への移行が分化の過程で不可欠です。嚢胞の密度、多能性幹細胞の種類、増殖速度はすべて、剥離のタイミングに影響を与える変数です。細胞が増殖しているが隣接するコロニー9と相互作用していないときに細胞を剥離することが望ましい。コロニーが隣接している場合、それは連続した網膜オルガノイドにつながり、分化効率を低下させます。
手順を批判的に実行することで、RBを収穫するのに問題はありません。しかし、この方法では、RB1の両対立遺伝子不活性化を伴うRBのみをモデル化することが...

ヒト網膜芽細胞腫(RB)は、網膜錐体前駆体1,2,3に由来するまれで致命的な腫瘍であり、小児期の眼内悪性腫瘍の最も一般的なタイプです4。RB1遺伝子のホモ接合型不活性化は、RB5における開始遺伝子病変である。しかし、RB1変異を有するマウスは網膜腫瘍2を形成することができない。マウス腫瘍は、Rb1変異と他の遺伝子改変の組み合わせで生成される可能性がありますが、それでもヒトRB6の特徴が欠けています。網膜オルガノイド分化の発達により、ヒトRB1の特徴を示すhESC由来のRBを得ることができました。
網膜オルガノイド分化のための多数のプロトコルが過去10年間で確立されており、2D7、3D8、および2Dと3D9の組み合わせが含まれています。ヒトRBを生成するためにここで用いられる方法は、付着培養と浮遊培養9の連結である。RB1変異hESCを網膜オルガノイドに分化させることで、45日目頃に RB の形成が検出され、60日目頃に急速に増殖します。90日目に、RBの単離、およびRB細胞株の生成が可能です。さらに、RBは120日目にほぼすべての網膜オルガノイドを取り囲んでいます。
hESC由来のRBは、RBの起源、腫瘍形成、および治療法を探索するための革新的なモデルです。このプロトコルでは、遺伝子編集hESCの生成、RBの分化、およびRBの特性評価について詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>2-メルカプトエタノール</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>抗ARR3</td><td>Sigma</td><td>HPA063129</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗CRX (M02)</td><td>Abnove</td><td>ABN-H00001406-M02</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗Ki67</td><td>Abcam</td><td>&nbsp;ab15580</td><td>抗体</td></tr><tr><td>抗 Syk (D3Z1E)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>13198</td><td>抗体</td></tr><tr><td>BbsI</td><td>NEB</td><td>R3539S</td><td>制限酵素</td></tr><tr><td>ディスパーゼ (1U/mL)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 基本</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12-GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), Qualified for Human Embryonic Stem Cells</td><td>生物産業</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>グルタミン</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nutrient Mix (Hams F12)</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>MEM 非必須アミノ酸溶液 (100X)</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>P3 初代細胞 4D-ヌクレオフェクター X キット</td><td>S ロンザ</td><td>V4XP-3032</td><td>ヌクレオフェクションキット</td></tr><tr><td>ペン連鎖球菌</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>遺伝子操作</td><td>ISY1130- 0025MG</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>ncEpic-hiPSC/hESC培地</td><td>Nuwacell</td><td>RP01001</td><td>ncEpic-hiPSC/hESC培地 in 1.2.1</td></tr><tr><td>成長因子減少基底膜マトリックス</td><td>BD</td><td>356231</td><td>マトリゲル in 1.2.1</td></tr><tr><td>細胞解離酵素</td><td>Gibco</td><td>12563-011</td><td>TrypLE Express in 1.2.8</td></tr><tr><td>RNeasy Midi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>75144</td><td></td></tr><tr><td>RNeasyの小型キット</td><td>QIAGEN</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>補足A</td><td>生命技術</td><td>17502-048</td><td>N-2補足(100X)、液体、medumの供給可能なI</td></tr><tr><td>の補足B</td><td>生命技術</td><td>17105-041</td><td>B-27補足(50X)、medum I、II、IIIの液体、供給</td></tr>可能な液体 生命<tr><td></td><td>技術</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>タウリン</td><td>シグマ</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 2HCl</td><td>セレック</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>pX330-U6-キメラBBh-hSpCas9-2A-ピュロ</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>ヌクレオフェクター4D</td><td>ロンザ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>シグマ</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr></tbody></table>

インビトロでのヒト網膜芽細胞腫の再構築

Reconstruct Human Retinoblastoma In Vitro

ヒトRBは小児がんであり、治療を行わないと致命的です。RBは齧歯類モデルでは比較的稀な錐体前駆体に由来するため、ヒトとげっ歯類の種間差については、ヒト由来の疾患モデルの方がヒトRBのメカニズムの解明や治療対象探索に有益です。本明細書では、プロトコルは、それぞれ二対立遺伝子RB1点突然変異(RB1 Mut/Mut)およびRB1ノックアウト変異(RB1-/-)を有する2つの遺伝子編集hESC株の生成を記載する。網膜発達の過程で、RBの形成が観察される。RB細胞株はまた、RBオルガノイドから分離することによっても確立される。全体として、遺伝子編集されたhESC株を2Dおよび3D複合分化プロトコルを使用して網膜オルガノイドに分化させることにより、ディッシュ内でヒトRBを再構築し、その錐体前駆体の起源を特定することに成功しました。網膜芽細胞腫の発生、増殖、増殖を観察し、新規治療薬をさらに開発するための有用な疾患モデルを提供します。

RB生成の手順は、付着培養と浮遊培養を組み合わせた 図1で解明されている。RB1-KO hESCからヒトRBを回収し、RBオルガノイドを単離することにより RB細胞株を得ることができた。
ここで、プロトコルは、異なる段階での分化の詳細を提供する(図2)。中空の球体は最初の3日間で形成され、培養表面に付着してから膨張します(図2A-E)。15日目以降、細胞は上昇し、浮遊状態で培養されます(図2F)。剥離の翌日、網膜オルガノイドが形成され、明るい縁が見えます(図2G、黒い矢印)。さらに、オルガノイドの外側の細胞は、次の週に死ぬ可能性があります(図2G、オレンジ色の矢印)。27日目に...

ヒト胚性幹細胞に二対立遺伝子RB1変異を導入することによるヒト網膜芽細胞腫(RB)(RB)の生成方法について述べる。RB細胞株は、ディッシュ中で単離されたRBを用いて培養することもできた。

Human RB is pediatric cancer, which is lethal if no treatment is administered. As RB originates from cone precursors, which is relatively rare in rodent ...

ヒト網膜芽細胞腫は、小児期の最も一般的なタイプの眼内癌です。臨床サンプルの入手は困難であり、マウスモデルは網膜芽細胞腫を形成することができません。したがって、網膜芽細胞腫の発生、増殖、増殖を観察し、新規治療薬を開発するためには、in vitro網膜芽細胞腫の発生が不可欠です。このプロトコルの効率は約100%に達する可能性がありますが、網膜芽細胞腫の発生期間は45日目から120日目までさまざまです。網膜芽細胞腫一またはRB一ノックアウトヒト胚性幹細胞の維持のために、遺伝子編集したH9細胞を増殖因子低減基底膜マトリックスでコーティングした6ウェルプレートで培養し、培地を毎日交換する。細胞を継代するには、EDTAバッファー中で摂氏37度で3.5分間、または室温で5分間インキュベートします。80%コンフルエントに達するまで細胞を培養します。次に、網膜細胞の分化を開始するために、培地を取り出し、1ミリリットルのDPBSで細胞をすすぎます。次に、1ミリリットルのディスパーゼバッファーを添加し、摂氏37度で5分間インキュベートすることにより、細胞コロニーを上昇させます。細胞コロニーを顕微鏡で観察する。コロニーの端がロールアウトし始めたら、ディスパーゼバッファーを吸引し、1ミリリットルのDPBSで細胞を1回穏やかにすすぎます。次に、1ミリリットルの培地をウェルに加え、10マイクロリットルの標準ピペットチップを使用して、コロニーを細かく切ります。セルスクレーパーを使用して、培地中の残りの細胞をこすり落とします。15ミリリットルのチューブで遠心分離して細胞を回収します。遠心分離後、約50マイクロリットルの上清を残して、細胞を培地中に分散させます。次に、250マイクロリットルの成長因子低減基底膜マトリックスを加え、穏やかに攪拌して混合します。混合後、懸濁した細胞を入れた15ミリリットルのチューブを摂氏37度のインキュベーターに入れます。20分間のインキュベーションの後、細胞および成長因子還元基底膜マトリックスは固化したゲルを形成するはずである。次に、1ミリリットルの中型1個を15ミリリットルのチューブに加えます。1ミリリットルのピペットを用いて、固化したゲルを2〜3回ピペットで固め、塊を分散させた。次に、さらに9ミリリットルの培地1を加え、細胞懸濁液を10センチメートルの細胞培養皿に移します。摂氏37度と5%二酸化炭素で皿をインキュベートします。これはゼロ日目と見なされます。初日に、顕微鏡を使用して細胞を調べます。平均して、1枚のゲルに3〜4個の嚢胞が観察されます。5日目に、上清を15ミリリットルのチューブに集めて培地を交換し、嚢胞を底に定着させ、上清を新しい培地と交換します。チューブ内の嚢胞を2つの10センチメートル皿に分散させ、各皿に少なくとも300個の嚢胞を確保する。7日目に、皿に付着したほとんどの嚢胞が広がり、付着性コロニーを形成した。10日目に、培地を新鮮な培地で交換し、すべての嚢胞が皿に付着したままであることを確認します。13日目から17日目まで顕微鏡で細胞を観察し、細胞が広がっていることを確認します。15日目に、1ミリリットルのDPBSで細胞を1回すすぎた後、1ミリリットルのディスパーゼ溶液を加え、摂氏37度でインキュベートします。5分後、ディスパーゼバッファーを取り出し、1ミリリットルのDPBSで培養物を静かにすすぎます。次に、各10センチメートルの皿に10ミリリットルの培地2を加え、摂氏37度と5%の二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。24時間後、付着培養物は自発的に剥離し、網膜オルガノイドに集合する。剥離の3日後に、細胞培養皿から細胞を15ミリリットルのチューブに集める。オルガノイドが落ち着いたら、チューブから上清を取り除き、次の4日間、10ミリリットルの培地2を含む新しい非付着性ペトリ皿にオルガノイドを移します。剥離の1週間後、培地を培地3に変更し、この日以降は培地3でオルガノイドを培養します。網膜オルガノイド培養の27日目には、視神経小胞構造が明らかであり、オルガノイドの約90%がこの構造を示しています。網膜芽細胞腫の最初の検出は45日目に起こり、50日目に触知可能になります。それが90日目に成長すると、視神経小胞構造は主に網膜芽細胞腫によって包まれる。網膜芽細胞腫を単離し、細胞株としてさらに培養することができます。105日目には、網膜オルガノイドの80%以上が網膜芽細胞腫に完全に包まれています。これらのオルガノイドは、Hナイン由来の網膜オルガノイドと比較して、増殖マーカーKi67および癌遺伝子マーカーSYKを高発現しており、腫瘍形成を示している。さらに、網膜芽細胞腫オルガノイドにおける錐体前駆体マーカーARR3および視細胞前駆体マーカーCRXの高発現は、それらが錐体前駆細胞に由来することを実証する。網膜芽細胞腫発生の3つの形態学的段階における劣った結果と優れた結果がここに描かれています。分化したヒト胚性幹細胞と未分化なヒト胚性幹細胞は、その形態に基づいて容易に区別することができる。未分化細胞は網膜芽細胞腫形成のために選択される。5日目には、生成される球は中実ではなく中空である必要があります。網膜芽細胞腫は、視神経小胞構造を示す網膜オルガノイドに由来します。下オルガノイドから網膜芽細胞腫は発生しません。手順を実行している間、すべての先端を冷却し、基底膜マトリックスを4度で溶かしてからチューブに追加する必要があります。これは、この分化プロトコルの重要なステップです。

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Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

メソッドは、マウスにヒトの網膜芽細胞腫の腫瘍を伝播するために記述されています。腫瘍細胞は、直接免疫欠損マウスの眼に注入されています。二次腫瘍が正常に直接ヒト腫瘍および培養tumorspheresから採取した細胞の両方を使用して確立されている。...

免疫不全マウスにおけるヒト網膜芽細胞腫の腫瘍の確立と伝播

8日齢マウスの神経網膜を4％ゼラチンブロックの上にある。ビブラトームによる光受容体層（200ミクロン）の単離後、感光体は文化のための機械的および酵素的解離後に播種する。感光層は、分子、生化学的分析または移植のために使用することができる。...

ビブラトームセクショニングマウス網膜は、感光体文化を準備する

このプロトコルは、解剖実験的に操作し、ニワトリ胚の培養全体の網膜外植する方法について説明します。高い成功率、有効性と再現性をエレクトロポレーションおよび/ ​​または試薬物質、 すなわち、酵素阻害剤のためのプラスミドの効果をテストするために必要な場合、外植片培養は便利です。...

エレクトロポレーションおよび化学試薬の治療のための鶏胚からの全網膜の外植片

網膜色素上皮細胞は乾燥加齢による黄斑変性症の高度なフォームのセル置換療法として役立つことができます。このプロトコルでは、地理的な萎縮の目の大きいモデルと病気のこのモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植の世代について説明します。...

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

人間の羊膜と動物モデルにおける組織移植のための準備の上に培養したひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞から成る網膜組織を設計する手法を提案します。...

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

神経損傷後の嗅覚神経再生能力(OEG)の神経再生能力を評価するインビトロモデルを発表する。これは、OEG単層上のアキソトマイズ化された直上神経節ニューロン(RGN)の共培養と、RGN軸索およびソマト樹状マーカーを分析することによって、軸索再生のその後の研究に基づいています。...

アキソトマイズ化ラットレチナル神経節ニューロンの嗅覚エンシアシンググリアの共培養、成人軸索再生のインビトロモデルとしての

本研究は、外植物の取り扱い中にレチナル完全性を損なうことを防ぐ新しいヒトの妄想性レチナルカルチャー(HORC)モデルの開発を目的としている。これは、上層の色素および下層の網膜色素上皮-脈絡膜(RPE-脈絡膜)および皮膜で網膜を培養することによって達成される。...

新しいヒトの言語性の高いレティナル文化技術の特徴付け

自己組織化法を用いて、光受容体の生成を大幅に増加させる可能性のあるCOCOを添加したプロトコルを開発します。...

ヒト多能性幹細胞からの網膜オルガノイドの誘導

非ヒト霊長類(NHP)は、解剖学的および遺伝的類似性によるヒトの細胞疾患治療を研究するための理想的なモデルである。本稿では、NHP眼における網膜色素上皮細胞の脳下移植法と、黄斑操作に伴う術中合併症を予防するための戦略を記載する。...

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

房水は、眼球外転移のリスクがあるために in vivo で生検できない網膜芽細胞腫、眼内癌に対する高収量のリキッドバイオプシーです。ここでは、明確な角膜穿刺を介して房水を安全に抽出する方法と、予後バイオマーカーを特定するためのゲノム解析の手順を示します。...

網膜芽細胞腫に対するリキッドバイオプシーとしての房水:明確な角膜穿刺とゲノム解析

学ぶヒト網膜芽細胞腫のインビトロ再構築法。RB1変異導入したhESCから網膜芽細胞腫細胞株を培養し、発生・増殖・治療薬開発の研究に活用できます。

インビトロでのヒト網膜芽細胞腫の再構築

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