レプトスピラの病原性種におけるCRISPR干渉(CRISPRi)の遺伝子サイレンシングへの応用
2021年8月14日
ここで、 レプトスピラ 種における特異的遺伝子サイレンシングに対するCRISPR干渉(CRISPRi)の適用について説明する。 レプトスピラ 細胞は、dCas9(触媒的に「死んだ」Cas9)とシングルガイドRNA(sgRNA)を発現するプラスミドとの共役によって形質転換され、所望のゲノム標的への塩基対合を担う。遺伝子サイレンシングを検証する方法を紹介します。
私の名前はジャラス・ナリーで、アイオワ州エイムズの国立動物病センターの研究チームの一員で、レプトスピラ症に取り組んでいます。レプトスピラ症は放置された病気です。それは世界的な病気です。
そして本当に、私たちはこれらのユニークな細菌グループが感染を引き起こす方法について非常に限られた理解を持っています。そこで本日のプレゼンテーションでは、CRISPR干渉と呼ばれる技術を用いて、レプトスピラによって発現される特定の遺伝子を特異的にサイレンシングすることによってレプトスピラ症の病原性メカニズムの評価を容易にする新しいツールの概要を提供する予定です。しかし、ニュートンコロニーを選択する能力は、これらの潔癖性レプトスピラに最良の成長培地を提供することに非常に依存している。
だから、まず第一に、私たちは非常に簡単にこれらの潔癖性細菌を伝播するために新しいメディアを導入したリック・ホーンズビーを紹介するつもりです。そして、レプトスピラ内の標的遺伝子を沈黙させるCRISPR干渉方法論について話すルイ・フェルナンデスをご紹介します。こんにちは、私はリック・ホーンズビーです。
100年以上前にアナダによって同定されて以来、レプトスピラは通常摂氏29度で単離され、伝播され、環境も哺乳類の宿主体温も反映していない。10年前、USDA ERSはレプトスピラメディアの改善の研究を開始し、この研究のうち、ホーンズビー-Alt-Nallyメディアが開発されました。このメディアを使用して、臨床医や研究者は、より迅速にレプトスピラを現場の症例から、および哺乳類の宿主をより密接にエミュレートする温度および環境での体外研究において、より迅速に分離し、伝播することができました。
私たちはこの培地を最適化し続けていますが、現状では、HANは、体外研究における獣医およびヒトの臨床隔離およびレプトスピラ症の予防のためのより効果的なワクチンの開発を大幅に改善する可能性を実証しています。こんにちは、私はルイ・フェルナンデスです。これまでのところ、レプトスピラ症の病因は、主に効果的かつ容易に遺伝的チューブを行うことがなかったため、未調査のままでした。
ここでは、CRISPR干渉またはCRISPRiと呼ばれる新しい技術について説明します。そして、この技術は、死んだCas9、またはdCas9と呼ばれる1つのDNA結合タンパク質と、シングルガイドRNAと呼ばれるキメラRNA分子の2つの成分を発現させる必要があるため、非常に簡単です。そして、複雑なdCas9とガイドRNAは、私たちのターゲット遺伝子に塩基対を作り、したがって転写を減らすか、あるいはブロックするつもりです。
また、新たに説明したHAN培地を用いることで、変異体回収のためのコロニー形成時間を大幅に短縮することができた。最初のステップは、ガイドRNAに含まれるプロトスペースを定義することです。この配列は、所望の遺伝子標的に対して塩基対を定義する20個のヌクレオチドを含む。
ヌクレオチド配列をウェブサーバーCHOPCHOPに提出し、レンサ球菌のピオゲネス、Cas9、およびプロトスペーサー隣接モチーフNGGに対して定義されたパラメータを使用します。結果に基づいて、マイナストレンド内で最高のスコアを持つプロトススペースを選択します。NGGモチーフは最終シーケンスに含まれません。
我々は、保存されたdCas9足場で5素数で可変20ヌクレオチドを含有する単導RNAを発現するためにlipL32プロモーターを使用してきた。カセットを取得した後、PMaOriに降格されます。Xma1 制限サイトの dCas9 プラスミド。
共役のためにレプトスピラ細胞は、HAN培地で摂氏29度または37度で増殖する。結合の1日前に、ドナー等分化細胞は、ジアミノピメル酸、DAP、およびスペクチノマイシンを補充したLB培地で増殖する。次に、結合の日に、LBプラスDAPで飽和した大腸菌培養物を焼く。
バイオセーフティフードの内部に、膜フィルターをガラスベースの上に置き、続いて15MLガラス漏斗を配置して濾過装置を組み立てた。両方の部分は、この春のクランプによって一緒に保持されています。次に、ガラスを真空ポンプに接続し、5 MLのレプトスピラ培養液を漏斗に加えます。
次に、目的のプラスミドを含む大腸菌ベータ2163株を加える。体積は、培養の光学密度に応じて変化する。1対1の細胞パイパーソンを目指しています。
真空ポンプを回すと、今、液体は膜を通過し、細胞はその上に集中します。フィルターを取り、EMJHプレートプラスDAP、バイキュリエ側に置きます。24時間摂氏29度でプレートをインキュベートします。
その後、プレートからフィルターを回収し、50 ML円錐管に配置します。液体HAN培地の1 MLを使用して、ピペット処理によってフィルターから細胞を回収する。暗視野顕微鏡で回収した細胞を可視化する。
この段階では、大腸菌とレプトスピラの同等の数が見られます。100~200マイクロリットルは、分光マイシンを含むHANプレートに細菌を広げるために使用されます。この段階では、DAP は省略され、大腸菌は成長しません。
プレートは摂氏37度と3%CO2でインキュベートされます。コロニーは8日から10日の間に明らかであるべきです。レプトスピラインターロガンコロニーは、視覚化するのが少し難しいです。
ここでは、それらを見やすくするために生い茂ったコロニーを示しています。100マイクロリットルの液体HANを、変異体を回収するための1.5 MLチューブに加える。各プレートから少なくとも3つのコロニーを取ることをお勧めします。
ピペットチップを使用して、個々のコロニーがプレートから取り出されます。アガーは単独で撮影される予定です。コロニーは、MTP PMaOriを含む制御プレートから採取する必要があります。
dCas9 プラスミド。そして、標的遺伝子用に設計されたdCas9およびガイドRNAの両方を有するプラスミドを含むレプトスピラを有するプレート。回収された細胞を暗視野顕微鏡下で可視化し、生存可能なレプトスピラの存在を確認できるようになりました。
脱液レプトスピラの可視化後、細胞をスペクチノマイシンを含む液体HAN培地に移す。培養後、細胞はサイレンシング確認および表現型評価のために回収できるようになった。標的タンパク質に対する抗体が利用可能な場合、イムノブロットはサイレンシングを評価するための簡単な方法論である。
pMAOriを含むレプトスピラ。dCas9単独、またはガイドRNA Casを用いてPCR、木材横取りプライマーにより評価される。DMTプラスミドは約300塩基対のバンドをもたらし、ガイドRNAカセットが存在すると約700の種類が達成される。
全細胞抽出物を用いた免疫ブロットは、サイレンシング確認のために行われ、この遺伝子を標的とするdCas9およびガイドRNAで発現したプラスミドを含む細胞においてlipL32タンパク質発現が廃止される。また、リンクaおよびリンクBの両方が、ガイドRNAを含む細胞には存在せず、両遺伝子に特異的である。コントロールlipL41は、すべてのレーンで見ることができます。
そこで、レプトスピラインターロガンにCRISPR干渉を使用しました, 我々はまた、レプトスピラのいくつかの追加の病原性種にそれを使用しています.私たちは、特定の遺伝子を沈黙させるだけでなく、小さな非コードRNAの発現を沈黙させるためにそれを使用してきました。私たちの研究の関心は、感染の病原性メカニズムを理解することにあるので、私たちは通常、分散因子を特定するために見ていますが、明らかにあなた自身の選択した遺伝子を沈黙させることができ、あなた自身の研究分野に応じて。
例えば、それは運動性やレプトスピラが環境中でどのように持続するか、または代謝を理解している可能性があります。いずれにしても、機能性ゲノミクスを実行し、問題の遺伝子の生物学的意義を理解できる特定の変異体を生成できるはずです。だから、国立動物病センターで私たち全員から、私たちはあなたの研究であなたに幸運を祈ります。
概要
この記事では、レプトスピラ種における遺伝子サイレンシングのためのCRISPR干渉（CRISPRi）の応用について論じています。この方法論では、dCas9とシングルガイドRNA（sgRNA）を発現するプラスミドを用いてレプトスピラ細胞を形質転換し、特定の遺伝子をターゲットにします。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 微生物学
- 遺伝学
- 病原体研究
背景
- レプトスピローシスは世界的に無視された疾病です。
- レプトスピラの病原性メカニズムの理解は限られています。
- CRISPRiはこれらの細菌における遺伝子サイレンシングのための新しいツールを提供します。
- レプトスピラの培養のための改良された培地は研究能力を向上させます。
研究の目的
- レプトスピラにおける特定の遺伝子サイレンシングの方法を開発すること。
- レプトスピローシスの病原性メカニズムの評価を促進すること。
- レプトスピラの成長条件を最適化すること。
使用された方法
- 接合を介したレプトスピラ細胞の形質転換。
- 標的遺伝子サイレンシングのためのdCas9とsgRNAの使用。
- 改良された成長のためのHornsby-Alt-Nally培地の適用。
- 顕微鏡と免疫ブロッティングによる遺伝子サイレンシングの検証。
主要な結果
- レプトスピラにおける成功した形質転換と遺伝子サイレンシング。
- 新しい培地を使用したレプトスピラの成長と分離の向上。
- レプトスピローシスに関するさらなる研究の可能性の実証。
- 遺伝子操作のための明確な方法論の提供。
結論
- CRISPRiはレプトスピラの遺伝学を研究するための効果的なツールです。
- 最適化された培地は研究結果を大幅に改善します。
- このアプローチはレプトスピローシスの病因理解を進めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
CRISPR interference (CRISPRi) enables targeted gene silencing in pathogenic Leptospira species, addressing a critical gap in functional genomics for neglected zoonotic pathogens. By combining CRISPRi with optimized Hornsby-Alt-Nally (HAN) media, the method accelerates mutant generation and phenotypic evaluation, supporting mechanistic de-risking in early-stage target validation. This approach enhances predictive confidence in identifying virulence factors and informs portfolio prioritization for antimicrobial or vaccine development against leptospirosis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by silencing specific genes, including virulence factors like lipL32 and non-coding RNAs, to clarify pathogenic mechanisms.
- Operational Value: Uses a simple two-component system (dCas9 and sgRNA) delivered via conjugation, reducing complexity compared to traditional mutagenesis.
- Predictive Value: Supports functional genomics to assess gene essentiality and biological significance, aiding in target de-risking and lead identification.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates isogenic mutant strains for quantitative phenotypic screening, such as motility or persistence assays, under standardized conditions.
- Operational Value: Leverages HAN media for rapid colony formation (8–10 days) and reliable selection on spectinomycin-containing plates, improving assay throughput.
- Reproducibility: PCR and immunoblot validation (e.g., loss of lipL32 signal) provide orthogonal readouts for consistent mutant characterization across labs.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Facilitates study of host-adapted growth conditions using HAN media, which mimics mammalian host environments, improving relevance of preclinical models.
- Mechanistic De-risking: Allows evaluation of gene-specific contributions to survival, metabolism, or environmental persistence, informing go/no-go decisions for target advancement.
- Preclinical Model Relevance: Generated mutants can be used to assess vaccine efficacy or therapeutic response in disease-relevant systems.
Pipeline & Workflow Integration
The CRISPRi workflow fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, enabling iterative design-make-test cycles for antimicrobial or immunomodulator development.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven gene silencing to clarify pathway involvement in pathogenesis, reducing mechanistic ambiguity.
- Screening: Produces standardized mutant libraries for reproducible compound or environmental stressor screening in HAN-based assays.
- Analytics: Provides quantitative outputs via immunoblotting (protein loss) and PCR (cassette integration) to compare silencing efficiency and guide hit selection.
- Translational Research: Connects gene function to phenotypic outcomes in host-like conditions, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Plasmid backbone (PMaOri) and HAN media conditions are adaptable across Leptospira species, enabling platform reuse for multiple targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Delivers target-specific silencing with minimal off-target effects, increasing confidence in mechanistic interpretations.
- Operational Value: Standardized conjugation protocol and HAN media improve reproducibility and reduce variability in mutant generation.
- Strategic Value: Accelerates target validation timelines, enabling faster portfolio triage and reducing investment in low-confidence targets.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement by linking gene silencing to phenotypic outcomes, supporting data-driven go/no-go decisions.
Implementation Considerations
- Requires molecular cloning expertise to design sgRNAs and assemble plasmids containing dCas9 and guide RNA cassettes.
- Dependent on access to anaerobic workspaces and equipment for conjugation, vacuum filtration, and dark field microscopy.
- Necessitates standardization of HAN media preparation and spectinomycin selection across teams for consistent mutant recovery.
- Adaptation to other Leptospira species may require optimization of conjugation efficiency and antibiotic selection markers.
- Limited by the need for validated antibodies or PCR primers for phenotypic confirmation, which may not be available for all targets.
