多パラメータ光流体プラットフォームを用いたカルシウム流入とHIV-1感染の単細胞特性
2021年5月18日
ここでは、単一の細胞が急性事象およびナノ流体装置上の生産的なHIV-1感染を監視するプロトコルを提示する。イメージングデータは、ウイルスと宿主の受容体相互作用とシグナル伝達経路のダイナミクスを定義します。これは、ナノ流体ハイスループット縦単細胞培養およびイメージングにおけるシグナリング動態と分子相互作用を研究する最初の方法です。
このプロトコルは、単一細胞レベルでリアルタイムの運動をキャプチャすることができます。私たちは、HIV感染に応答して個々の細胞パラメータを測定し、ウイルスライフサイクルの遅れたステップと早期のシグナル伝達イベントを関連付けることができます。これは、単一細胞の選別、培養、イメージング、およびソフトウェア自動化のための新しい光流体プラットフォームを使用した従来のイメージング方法に代わる、スケーラブルな統合型の代替手段です。
これは、ナノ流体、ハイスループット、縦単細胞培養およびイメージングのための最初の確立された方法です。この技術は、様々な疾患状態における細胞シグナル伝達動態および動的分子相互作用を研究するために広く採用することができる。この方法の視覚的なデモンストレーションは、実験がどのように設定されているか、細胞がどのようにペンに光学的に分類され、どのようにチップを介して注入を設定するかを伝えるために重要です。
まず、100X濃縮洗剤溶剤25マイクロリットルと1,000X Fluo-4 AMの2.5マイクロリットルを1.5ミリリットルチューブに加え、次に渦を混合して、フレッシュフルー-4 AMローディング液を調製します。ピペット2.5ミリリットルの培養培地をローディング溶液に入れ、混ぜ合わせる。200万M MT-4細胞をGの500倍で3分間遠心し、その後、培地を取り除き、調製したFluo-4 AM負荷溶液の2ミリリットルでペレットを再懸濁します。
ピペットは細胞を35ミリメートルペトリ皿に再懸濁した。摂氏37度で15~30分インキュベートし、室温でさらに15~30分インキュベートします。細胞懸濁液を遠心分離管に移し、500倍Gで細胞を3分間遠心分離し、上清を取り除く。
培養培地の1ミリリットルにピペット化し、遠心分離機を500倍Gで3分間洗浄して細胞ペレットを再懸濁した。少なくとも50マイクロリットルの1ミリリットル当たり200万個の細胞の濃度で培養培地中でピペット処理することにより、細胞ペレットを再懸濁する。細胞ペニングを容易にする湿潤溶液でチップを調製するには、2ミリリットルの湿潤溶液と50ミリリットルの脱イオン水を含む遠心チューブを新しい光流体チップで器具に積み込み、チップに湿潤液をあふれさせるウェットチップ機能を実行します。
チップを摂氏50度でインキュベートし、チップを水で3回洗い流します。水の洗い流しが完了したら、250マイクロリットルの培養培地の3サイクルでチップを洗い流します。前のステップの細胞懸濁液を、負荷の前にF127洗浄剤溶質100個につき1個ずつ補充し、細胞がチップチャネルに付着する可能性を低減します。
器械輸出針を使用して、荷重操作と5マイクロリットルセルパッケージの体積のための少量インポートと1.5ミリリットル遠心管から細胞をインポートします。自動ペン機能を使用して最適化された光電子測位またはOEP電圧を使用したペンセルは、自動自動検出機能を使用してOEPケージで囲み、近くのペンに移動します。目的のセルが自動ペニングに続く場合は、手動ペン機能を使用してターゲットセルとターゲットペンを選択します。
ペニングが完了したら、250マイクロリットルの培養培地の3サイクルでチップを洗い流し、残りの未セプンセルをチップから取り除きます。細胞をペニングした後、FITC、テキサスレッドおよびDAPIチャネルの細胞の蛍光画像を得て、ベースラインFluo-4、mCherry、および自己蛍光を測定します。HIV-1を200万細胞当たり13ナノグラムのHIV-1 NLCIの濃度でマイクロチップに注入し、徐々に輸出針を通して懸濁液をチップに浸透させる。
HIV-1添加直後、FITCおよびDAPIチャネル内の画像を10分間の時間経過で繰り返し取得します。感染後1日、2日、3日、4日間でテキサスレッドチャンネルとDAPIチャンネルで画像を取得します。この方法論は、mCherry測定を介してHIV感染細胞および未感染細胞の同定およびクラスタリングに使用された。
mCherryシグナルの変化を有する細胞は、40,000以上の蛍光強度をそれぞれmCherry高またはmCherry低集団に集積した。これらのクラスターは、9分間の時間経過で蛍光4を使用して細胞内カルシウムを繰り返し測定することにより、カルシウム流入運動学について分析し、HIV感染細胞における初期のカルシウム流入を実証した。カルシウム流入とmCherryの蛍光との間には有意な正の相関が認められた。
この手順を試みる間、増殖した細胞はこのアッセイからのシグナルの劇的な減少をもたらすので、ウイルス産生と感染の両方の指数関数的増殖範囲内の細胞から始めることを覚えておくことが重要です。HIV-1での作業は危険です。したがって、この手順を実行する間、OSHA血液媒介病原体標準に示されているBSL-2の実践は、常に取られるべきです。
この技術は、制御された条件下で単一細胞の表皮または転写変化を研究できるようになるため、刺激的です。これは、多くの細胞型における分子経路に対する刺激の影響を相関させる広い可能性を秘めています。
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概要
このプロトコルでは、ナノ流体デバイスを用いて、急性HIV-1感染中の単一細胞をリアルタイムでモニタリングすることが可能です。これにより、ウイルスとホスト受容体の相互作用およびシグナリング経路のダイナミクスを観察でき、単一細胞培養およびイメージングにおける重要な進歩となります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- ウイルス学
背景
- 従来のイメージング手法では、単一細胞の応答を研究する上で限界がありました。
- HIV-1感染のダイナミクスを理解することは、治療戦略を開発する上で極めて重要です。
- ナノ流体デバイスは、ハイスループット解析のための新しいアプローチを提供します。
- リアルタイムでのデータキャプチャにより、細胞シグナリングキネティクスへの洞察を深めることができます。
研究目的
- HIV-1感染に対する単一細胞応答をモニタリングする方法を確立すること。
- 初期のシグナリングイベントと、ウイルスライフサイクルの後期の段階との相関関係を明らかにすること。
- 従来のイメージング技術に代わる、スケーラブルな手法を提供すること。
使用した手法
- 単一細胞のソーティングおよび培養のためのオプトフルイディクス・プラットフォーム。
- 細胞応答のリアルタイムイメージング。
- データ解析のためのソフトウェア自動化。
- 単一細胞ダイナミクスの縦断的観察。
主要な結果
- 単一細胞レベルでのリアルタイムキネティクスの捕捉に成功。
- HIV感染に関連する初期シグナリングイベントの特定。
- さまざまな疾患状態における本手法の適用可能性を実証。
- 実験の視覚的なセットアップにより、プロトコルの理解を促進。
結論
- この手法は、ウイルス感染時における細胞間相互作用の研究における画期的な進展を示すものである。
- 本手法は、細胞生物学におけるさまざまな研究用途に幅広く適用できる。
- 今後の研究において、本手法を活用することで、他の疾患メカニズムの探索が可能となる。
よくある質問
産業界における重要性
このオプトフルイディクスプラットフォームにより、HIV-1感染の初期イベント、特にカルシウム流入キネティクスを、リアルタイムかつ単一細胞解像度で解析することが可能となり、初期のウイルス・宿主相互作用とそれに続く効率的な感染との関連性を明らかにできます。一過性のシグナル伝達イベントと遅延して起こるウイルスのライフサイクル段階を相関させることで、本手法は抗ウイルス標的のバリデーションおよびアッセイ開発におけるメカニズム的なリスク低減をサポートします。そのスケーラブルで自動化された設計により、ウイルス学および免疫学研究における表現型スクリーニングやトランスレーショナルバイオマーカー同定のための、再利用可能なディスカバリーツールとして活用できます。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期段階の発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：単一細胞解像度で、初期カルシウムシグナリングとHIV-1の効率的な感染を結びつけることにより、治療仮説を検証する。
- 運用的価値：カルシウムフラックスとmCherryレポーター発現の経時的なキネティック相関を通じて、機能的なターゲットバリデーションを可能にする。
- 予測的価値：初期カルシウム流入を調節し感染率を低下させる化合物を特定することで、ポートフォリオの優先順位付けを支援する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：自動化した単一細胞ソーティング、培養、および経時的イメージングにより、ハイスループットスクリーニング用のバリデート済み生物学的システムを構築します。
- 定量的アウトプット：カルシウムフラックス（Fluo-4）、感染状態（mCherry）、およびベースラインの自家蛍光（DAPI）を含む、再現性のあるマルチパラメトリックな読み取り値を提供します。
- 拡張性：チップあたり数千個の個々の細胞をナノ流体的に閉じ込めることができ、用量反応試験やアンタゴニスト研究において統計的な信頼性を確保します。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患への関連性：ヒトT細胞株（MT-4）におけるHIV-1の初期進入イベントをモデル化し、メカニズム研究のための疾患関連システムを提供します。
- トランスレーショナルな連続性：感染結果を予測するシグナル伝達ダイナミクスを捉えることで、基礎研究と前臨床研究を橋渡しします。
- バイオマーカーとの整合性：後期段階のウイルス複製と相関する初期シグナル伝達シグネチャー（例：カルシウムフラックス閾値）の特定を可能にします。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲット検証からリード化合物同定に至る創薬の連続的なプロセスに組み込まれ、抗ウイルス剤開発プログラムにおける意思決定（go/no-go判断）に寄与する動的な表現型リードアウトを提供します。
- 探索生物学：急性HIV-1曝露後のリアルタイムカルシウムキネティクスを測定することにより、ウイルスと宿主の相互作用に関する仮説検証をサポートします。
- スクリーニング：チップ上での自動光電子ペニングと環境制御を通じて、アッセイの標準化と再現性を提供します。
- 分析：縦断的な蛍光追跡およびmCherry強度の閾値に基づくクラスタリングにより、感染条件の定量的な比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：初期のシグナル伝達イベントを4日間にわたる生産的感染へと結びつけ、リスク調整後の進展判断をサポートします。
- エンタープライズ再利用：HIV-1以外の他のウイルス、アゴニスト、またはアンタゴニストに適応可能なプラットフォーム技術として機能します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：初期シグナリングとウイルス複製との時間的関係を解明することで、メカニズム上の曖昧さを軽減します。
- 運用上の価値：細胞のロード、ペニング、イメージング、および環境制御の自動化により、再現性を確保します。
- 戦略的価値：感染感受性の早期予測バイオマーカーを提供することで、go/no-go判断の精度を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：カルシウムフラックスの変調に基づいた、進入阻害剤または免疫調節剤のリスクベースの優先順位付けを可能にします。
実施上の留意点
- 生細胞イメージング、オプトフルイディクスシステム、および蛍光顕微鏡の専門知識が必要です。
- ナノフルイディクスチップがFluo-4 AM、mCherryリポーターウイルス、および培養培地と適合している必要があります。
- ユーザー間で、細胞トラッピング電圧（4.3V OEP）、ケージ速度（5 µm/s）、および注入プロトコルの標準化が必要です。
- アゴニスト/アンタゴニストの投与スケジュールを、8分間のカルシウムイメージングウィンドウおよび4日後の感染 readout に合わせて調整する必要があります。
- 光電トラッピングが可能な接着性または半接着性細胞に限定されます。トラッピング不可能な細胞種については、プラットフォームの変更が必要な場合があります。
