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覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植
覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植
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JoVE Journal Neuroscience
Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

Full Text
8,650 Views
06:33 min
June 22, 2021

DOI: 10.3791/62633-v

Ragunathan Padmashri1, Kevin Tyner1, Anna Dunaevsky1

1Department of Neurological Sciences,University of Nebraska Medical Center

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Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study presents a protocol for implanting a chronic cranial window for longitudinal imaging of brain cells in awake, head-restrained mice. The method allows for repeated visualization of neuronal and astrocytic structure and activity over multiple sessions, facilitating the investigation of alterations in neurodevelopmental or neurodegenerative disorder models.

Key Study Components

Area of Science

  • Neuroscience
  • Imaging Techniques
  • Neurobiology

Background

  • The study focuses on imaging brain cells to monitor their structure and function longitudinally.
  • It utilizes a chronic cranial window to facilitate repeated sessions of imaging in live mice.
  • This approach aids in understanding neuronal changes in various neurological conditions.

Purpose of Study

  • To enable the chronic imaging of neuronal and astrocytic interactions.
  • To assess structural and functional changes in models of neurological disorders.
  • To understand how learning affects neuronal and astrocytic dynamics.

Methods Used

  • The main platform used is in vivo imaging of the brain in head-restrained mice.
  • The biological model involves head-restrained mice that undergo cranial window implantation.
  • No multiomics workflows are mentioned.
  • Critical steps include careful bone thinning and precise placement of the cover glass during the procedure.
  • Surgical techniques include viral injections and secure closure using adhesives and dental cement.

Main Results

  • The quality of cranial windows was assessed by imaging dendritic structures and astrocytic calcium activity over time.
  • Initial findings demonstrated new dendritic spines appearing during the imaging sessions.
  • Temporal dynamics of calcium activity in astrocytes were captured during behavioral tasks.
  • Two critical procedural steps highlighted the importance of bone thinning and glass placement for successful imaging.

Conclusions

  • This study demonstrates a reliable protocol for chronic imaging in live mice, aiding the understanding of brain plasticity.
  • The method facilitates longitudinal studies of cellular dynamics, crucial for exploring neuronal mechanisms in diseases.
  • The implications extend to understanding how brain activity and structure are affected by learning experiences.

Frequently Asked Questions

What advantages does the cranial window model provide?
The cranial window model allows for repeated imaging of brain cells over time, enabling longitudinal studies of neuronal dynamics and plasticity.
How is the cranial window implantation performed?
The implantation involves securing the mouse, thinning the skull, removing a portion of it, and carefully placing a cover glass over the opening to allow imaging.
What types of data can be obtained with this method?
This method enables imaging of synaptic structures and monitoring of calcium activity in astrocytes, providing insights into neuronal interactions and plasticity.
Can this method be adapted for different types of studies?
Yes, it can be combined with behavioral tasks to study the impact of learning on neuronal and astrocytic structure and function.
What are some limitations of this technique?
Key limitations include the need for precise surgical skills and the potential for complications if the cranial window is not properly secured.

ここに提示されるのは、覚醒した頭部拘束マウスにおける脳細胞の縦方向イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルである。

このプロトコルは、ウイルス注射を行い、覚醒した頭部拘束マウスの脳細胞をイメージングするための頭蓋窓を移植する方法を記述している。この方法の利点は、ニューロンおよびアストロサイトの構造および活性を複数のセッションにわたって繰り返し画像化できることである。このアプローチは、神経発達障害または神経変性障害のモデルにおいて神経細胞がどのように変化するか、または経験依存性の可塑性が損なわれているかどうかを決定するために使用することができる。

まず、鼻クランプとイヤーバーを使用して、麻酔をかけられたマウスを定位フレームに固定します。滅菌手術器具を使用して、前頭縫合糸からブレグマの前部からラムダの後部までの皮膚を切断して除去する。滅菌サイズ11炭素鋼手術用ブレードを使用して、頭蓋骨からすべての結合組織を静かにこすり取る。

歯科用ドリルの助けを借りて、頭蓋骨を同心円状に開口部の輪郭に沿って徐々にドリルして、骨の薄肉化を容易にします。同心円状のパスが終わるたびに、ドリルしたエリアに生理食塩水を1滴または2滴加え、生理食塩水を少なくとも10秒間放置してから掘削を再開します。頭蓋骨の中央部を細かい鉗子で優しく押して、頭蓋骨が十分に薄くなって動いていることを確認します。

掘削が行われた基礎となる血管系が無傷であり、骨に亀裂が入っていないことを確認してください。細くなった骨に15度の尖ったミニチュアの刃を慎重に挿入し、生理食塩水に浸したゲルフォームを切断して使用し、出血を止める。鉗子を使用して、硬膜を傷つけないように注意しながら、骨を慎重に持ち上げて取り外します。

注射のために、滅菌された面取りガラスピペットに20マイクロメートルの先端をウイルス混合物で充填する。次に、ピペットを下げて脳の表面に触れ、層2/3注射のためにさらに200〜300マイクロメートル下げ続けます。細胞内マイクロインジェクションディスペンスシステムを用いて、システムを2分間にわたって12〜15回加圧注入する。

頭蓋窓の移植のために、頭蓋骨の開口部の上にカバーガラスを置きます。鉗子を使用して、ガラスが開口部上で平らになっていることを確認します。ガラス窓の端を頭蓋骨に密封するには、ガラス表面の周囲にシアノアクリレート粘着ゲルを塗布する。

接着ゲルの上に、接着剤の層を塗布する。次に、歯科用セメント液の層を追加します。歯科用セメントが固まったら、ヘリコプター式ヘッドプレートの中央開口部に接着剤の薄い層を塗り、カバーガラスの上に適当な大きさのヘリコプター式ヘッドプレートを置きます。

接着剤を乾かします。歯科用セメント粉末を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに0.1ミリリットルのマークまで加えます。7〜8滴の速硬化性瞬間接着剤を粉末に混合し、得られた混合物を1ミリリットルのシリンジに引き込み、19ゲージの針を切断してより大きな開口部を作ります。

混合粉末をヘリコプター バーの側面の穴から、どちらかの側から染み出すまで注入します。歯科用セメント接着剤混合物を露出した頭蓋骨の残りの部分に塗布して、ヘッドプレートを頭蓋骨に固定する。マウスを布で包み、ヘッドプレートを介して空輸されたホームケージの頭部固定アームに固定してから、ホームケージを光にさらしたままにします。

15分の慣れ時間の後、マウスをホームケージから取り出します。顕微鏡の広視野モードを用いて、容易に識別可能な血管系の2〜3つの位置を選択する。血管の画像を保存し、モーターコントローラに表示されるx座標とy座標を記録します。

ニューロンのシナプス構造、およびアストロサイトにおけるGCaMP6f活性を画像化する。代表的な解析では、頭蓋窓の質を、樹状突起およびGCaMP6f発現アストロサイトのイメージングを数日間にわたって繰り返して評価した。良い窓では、ニューロン構造ははっきりと見える樹状突起の棘で鮮明に見えました。

イメージングの2日目に2つの新しい脊椎が現れました。1つの背骨だけが持続し、5日目に見えました。カルシウム活性は、異なる時点でGCaMP6fを発現するアストロサイトにおいて研究された。

セル全体を含む世界的な出来事は、移動試合中に目撃されました。このプロトコルの2つの重要なステップは、骨を除去する前に骨を適切に薄くする必要があること、および開口部の上にカバーガラスを適切に配置する必要があることです。イメージングは、イメージング中、または新しい運動スキルの学習などの行動後の行動分析と組み合わせて、ニューロンおよびアストロサイトの構造および機能が学習によってどのように調節されるかを決定することができる。

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