Name: 覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学ぶ 覚醒マウスの頭蓋窓移植による反復生体内イメージング法。神経細胞とアストロサイトの構造と活動を長期的に可視化し、神経発達障害や神経変性疾患モデルでの細胞動態の変化を評価する。

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すべての動物実験は、ネブラスカ大学医療センターでIACUCによって承認されたガイドラインに従って実施した。
1. 手術前
<ol><li>ウイルス注射用のピペットを準備する。ピペットプーラーを使用してホウケイ酸ガラス毛細血管を引っ張り、ピペットを20°の角度で面取りします。ピペットを一晩滅菌します。</li>
	<li>滅菌ゲルフォームの新鮮な断片を小さな正方形に切断して準備する。ゲルフォームを0.5mLの生理食塩水を含む滅菌マイクロフュージチューブに沈める。使用前にゲルフォームを生理食塩水に少なくとも30分間浸します。</li>
	<li>スポンジストリップの新鮮な部分を薄いストリップに切断して準備します。</li>
	<li>手術の20分前に、4〜6週齢のGLAST-CreER/GCaMP6fマウスに、脳の腫れを防ぐために0.2mg / kgのデキサメタゾンを腹腔内に注射し、炎症を軽減するために5mg / kgのカルプロフェンを注射する。 注:アストロサイトの約40%においてGCaMP6fの組換えおよび発現を誘導するために、GLAST-CreER/GCaMP6fマウスに100mg/kgタモキシフェンを3週間で5日間連続で注射した。</li>
</ol>2. 手術開始
<ol><li>20分後、マウスを酸素を含む3%イソフルランで約1.5分間の流量で1L/min麻酔する。</li>
	<li>麻酔をかけたら、マウスを水の再循環毛布の上に座らせて、手術を通して体温を37°Cに維持する定位フレームの上に置きます。鼻クランプとイヤーバーを使用してマウスをフレームに固定します。鼻クランプとイヤーバーが、処置中に頭部が動かないほど十分に安定しているが、頭蓋骨が損傷するほどきつくないことを確認してください。</li>
	<li>1-2 L /分の流量で酸素を含む1-1.5%イソフルランで麻酔を維持します。一部の動物は鎮静を維持するために多かれ少なかれイソフルランを必要とするかもしれないことに注意してください。動物の呼吸とつま先と尾のピンチへの反射を監視し、イソフルランを適切に調整します。</li>
	<li>綿の先端アプリケーターを使用して各目に眼軟膏を塗布し、処置中に目が乾燥するのを防ぎます。</li>
	<li>げっ歯類のトリマーを使用して、首から目のすぐ後ろまで髪を剃ります。動物のひげが誤ってトリミングされないように注意してください。</li>
	<li>1つのヨウ素調製パッドで剃った部分をきれいにし、続いて1つのアルコール調製パッドできれいにする。</li>
	<li>滅菌組織鉗子および外科用ハサミを使用して、前頭縫合糸からブレグマまでの前頭縫合糸からラムダまで後方まで皮膚を切断して除去する。</li>
	<li>皮膚が取り除かれたら、頭蓋骨の出血を最小限に抑えるために、約0.1mLの1%キシロカイン(リドカインとエピネフリン1:200,000)を頭蓋骨に加える。</li>
	<li>ハンドルに取り付けられた滅菌サイズ11炭素鋼手術用ブレードを用いて、結合組織を頭蓋骨から穏やかに掻き取る。頭蓋骨の端付近の結合組織を除去するときは、残っている組織が後でガラスやヘッドプレートの強い付着を妨げる可能性があるため、特に注意してください。</li>
	<li>滅菌組織鉗子を使用して、頭蓋骨から緩い結合組織を除去します。</li>
	<li>滅菌綿チップアプリケーターを使用して、頭蓋骨から残りのキシロカインをきれいに除去します。</li>
	<li>完了したら、アセトンに浸した滅菌綿先端アプリケーターを用いて頭蓋骨を徹底的に脱脂する。圧縮空気を使用して、頭蓋骨を直ちにブロードライします。</li>
</ol>3. 開頭術
<ol><li>ファインポイントマーカーと定規を使用して、目的の位置の開口部に適したサイズを測定します。開口部のサイズをカバーガラスのサイズ(直径3mmまたは5mm)と比較して確認します。開口部がカバーガラスのサイズよりわずかに小さいことを確認します。</li>
	<li>歯科用ドリルを使用して、開口部の輪郭を徐々にトレースし、骨を薄くする。骨を貫通しないようにゆっくりとドリルし、同心円でドリルして骨の薄肉化を容易にします。</li>
	<li>各同心円パスの後、ドリルした領域に滅菌生理食塩水を1滴または2滴加えます。生理食塩水を少なくとも10秒間放置して、骨が過熱して下にある硬膜を損傷するのを防ぎます。</li>
	<li>滅菌綿チップアプリケーターを使用して、残りの生理食塩水を吸収します。掘削を再開する前に、残りの生理食塩水がすべて蒸発したことを確認するために、その領域に圧縮空気を吹き付けます。残っている骨の破片を吹き飛ばすためにこれを行います。</li>
	<li>骨が除去のために適切に薄くなるまで、手順3.2-3.4を繰り返します。</li>
	<li>骨の中央部を細かい鉗子で優しく押して、薄くなった頭蓋骨が動くことを確認することで、骨が除去のために適切に薄くなっていることを確認してください。根底にある血管系は、掘削が発生した場所に見えるはずです。骨が薄肉化が発生した場所でひび割れるように見えることがあることを確認します。 注:この段階でのトレーニングは、骨が適切に間伐された時期を特定するために不可欠です。</li>
	<li>骨を取り除こうとする前に、マウスをチェックして完全に鎮静されていることを確認してください。そうでない場合は、骨を除去するときに脳の腫れを防ぐためにイソフルランの維持を徐々に増加させます。</li>
	<li>生理食塩水で飽和したゲルフォームの小片を薄くした頭蓋骨に加える。薄くなった頭蓋骨に生理食塩水を1〜2滴追加します。 注:薄くなった頭蓋骨の上にたっぷりの生理食塩水を置くと、骨のフラップを取り外すときに出血を減らし、硬膜を保護するのに役立ちます。</li>
	<li>ミニチュアの15°尖った刃を使用して、刃を細くした骨に慎重に挿入し、薄くなった骨に沿って切断します。ゲルフォームを生理食塩水に浸し、発生する可能性のある出血を止める準備をしてください。</li>
	<li>鉗子を使用して、慎重に骨を持ち上げて取り除きます。根底にある組織や血管系への損傷を避けるために、できるだけ穏やかにしてください。硬膜を傷つけないように細心の注意を払ってください。</li>
	<li>骨フラップが取り除かれたら、生理食塩水で飽和した新鮮なゲルフォームを皮質に加えます。ゲルフォームが乾燥するのを防ぐために数滴の生理食塩水を加えると、下層の組織に損傷を与えるので。</li>
</ol>4. ウイルス注射
<ol><li>定位装置を用いてウイルス注射を行う。<ol>
<li>AAV1 を準備します。CaMKII.0.4.Cre(3×1013 ゲノムコピー(GC)/ mLの力価)を生理食塩水中の段階希釈により1:5,000で投与する。</li>
		<li>AAV1の混合物を調製する。CaMKII.0.4.Cre (1:5,000) および AAV1.キャグ。FLEX.tdトマト(力価5×1012 GC / mL)をパラフィルムの小片に塗布する。</li>
		<li>チップサイズが 20 μm の滅菌面取りガラスピペットにウイルス混合物を充填するには、ピペットを溶液の上に静かに置きます。</li>
		<li>ピペットが脳の表面に触れるようにピペットを下げ、L2/3注射の場合はさらに200〜300μm下げ続けます。細胞内マイクロインジェクションディスペンスシステム( 材料表を参照)を用いて、2分間にわたって12〜15回圧力注入する(20psi、9msパルス持続時間)。ピペットが詰まっていないことを確認するために、各注射でピペットドロップのメニスカスを観察します。</li>
		<li>注射したら、逆流を防ぐためにピペットを脳内に4〜5分間放置します。ピペットをゆっくりと引っ込めます。</li>
		<li>2〜3部位(約500μm間隔)で注射を繰り返す。</li>
		<li>Creウイルスの段階希釈に使用したガラスピペット、パラフィルム、ピペットチップ、マイクロフュージチューブを10%漂白剤に廃棄します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 頭蓋窓の移植
<ol><li>ゲルフォームを取り除き、スポンジストリップの小さなストリップを使用して、残りの生理食塩水を浸します。</li>
	<li>抗生物質エンロフロキサシン(22.7μg/mL)を数滴開口部に加え、1分間そこに留まらせる。1分後、新鮮なスポンジストリップを使用して、残りのエンロフロキサシンを吸収します。このプロセスをさらに 2 回繰り返します。</li>
	<li>3回目の洗浄後、開口部に数滴の生理食塩水を加え、1分間そこに留まらせます。1分後、新鮮なスポンジストリップを使用して、残りの生理食塩水を吸収します。この洗浄プロセスをさらに2回繰り返し、3回目の洗浄後、開口部に少量の生理食塩水を加える。</li>
	<li>カバーガラスを開口部の上に置きます。鉗子を使用して、ガラスが開口部の上に平らになっていることを確認し、高品質の画像を取得します。</li>
	<li>ガラスを所定の位置に静かに保持しながら、シアノアクリレート粘着ゲル(材料表)をガラスの周囲に塗布し、窓の端を頭蓋骨に密封する。接着剤がカバーガラスの下に染み込まないようにし、できるだけ多くの接着剤をカバーガラスの表面から遠ざけてください。</li>
	<li>接着ゲルの上にスーパー接着剤の層を塗布する。接着剤の上に歯科用セメント液の層を追加して、硬化させます。</li>
	<li>適切なサイズのヘリコプタータイプのヘッドプレートを取り、中央の開口部の周りに接着剤の薄い層を塗布します。ヘッドプレートをカバーガラスの上に置き、接着剤が短時間乾くのを待ちます。</li>
	<li>1.5 mL マイクロフュージチューブで、チューブの 0.1 mL マークに歯科用セメント粉末を追加します。速硬化、瞬間接着剤を7〜8滴加え、混合する。19G針で1mLのシリンジに引き込み、より大きな開口部を作ります。</li>
	<li>ヘリコプターバーの側面の穴から混合物を注入し、両側から浸透させます。露出した頭蓋骨の残りの部分に歯科用セメント/接着剤混合物を塗布してヘッドプレートを頭蓋骨に固定すると、イメージング中の動きのアーチファクトが減少します。</li>
	<li>混合物を少なくとも15分間風乾させる。</li>
	<li>マウスに0.5mLの生理食塩水を皮下に注射して、回復を補助する。</li>
</ol>6. 事後操作
<ol><li>マウスを定位フレームから取り外し、ケージに戻します。</li>
	<li>ケージの一部を水再循環ブランケットの上に置き、回復を支援するためにゲル加熱パッドまたは等温パッドを空ける。</li>
	<li>回復をさらに助けるために、通常の食事に加えて、食物ペレットと湿った食物の小さな助けを動物に提供します。回復期間中、手術後に毎日新しい食物ペレットとウェットフードを加えてください。</li>
	<li>手術の翌日、マウスに5mg / kgカルプロフェンおよび5mg / kgエンロフロキサシンを1回注射する。</li>
	<li>2〜6日目に、マウスに5mg / kgカルプロフェンを1回、5mg / kgエンロフロキサシンを2回注射し、地元のIACUCによる承認を待ってください。エンロフロキサシン注射を少なくとも8時間で分離する。</li>
	<li>7〜20日目に、マウスに毎日5mg / kgのカルプロフェンを注射する。</li>
</ol>7. イメージングのための動物の馴化
<ol><li>手術後14日目に、頭蓋窓の光学的明瞭さを調べます。窓が不明瞭または損傷している(すなわち、過剰な血管新生)マウスを使用しないでください。</li>
	<li>蛍光顕微鏡下でtdトマトの発現を確認します。標識された細胞が同定できる場合は、動物の馴化を進めてください。</li>
	<li>慣れ初日(ハンドリング)<ol>
<li>マウスを数分間保持し、取り扱い後にケージに戻します。セッション間に 15 分間隔で処理を 3 回繰り返します。</li>
		<li>3回目の試行の後、動物を小さな布で包んでマウスに慣れさせる。</li>
		<li>マウスを布で包んだ状態で約1分間保持します。</li>
		<li>試行後、マウスをケージに戻します。このプロセスをさらに2回繰り返し、各試行間に15分の間隔を空けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>慣れの2日目<ol>
<li>マウスの重量を量り、記録します。</li>
		<li>マウスを布で包み、ヘッドプレートを介して空輸されたホームケージの頭部固定アームに固定します。</li>
		<li>家のケージを光にさらしたままにしておきます。</li>
		<li>マウスをモバイルホームケージに15分間固定します。</li>
		<li>慣れた後、マウスを家のケージから取り出し、空気の流れを止めます。</li>
		<li>マウスの重量を量り、ケージに戻します。体重の10%以上を失わないマウスのみを含めるように注意してください。慣れ親しんだ日に体重の10%以上を失うマウスを画像実験から除外する。</li>
	</ol>
</li>
	<li>慣れの3日目とその先<ol>
<li>マウスの体重を計量して記録してから、空中に持ち上げたホームケージに固定します。</li>
		<li>マウスを空輸されたホームケージに固定します。</li>
		<li>箱などの暗いインテリアを提供するもので家のケージを覆い、マウスを30分間固定したままにします。</li>
		<li>30分後、ホームケージを取り外し、マウスを取り外し、空気の流れをオフにします。</li>
		<li>慣れた後のマウスの体重を計量して記録します。</li>
		<li>このプロセスを毎日繰り返し、マウスがホームケージに固定される時間を15分延長する。マウスをホームケージに1.5時間固定できるまでこのプロセスを続けます(これは2光子イメージングセッションのおおよその期間です)。</li>
		<li>マウスをノイズに慣れさせるには、顕微鏡でいくつかの慣れセッションを実行して、マウスをレーザースキャニングミラーの音に順応させます。十分に慣れていないマウス(すなわち、発声およびストレス誘発排便)を除外する。</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. 多光子イメージング
<ol><li>手術後3週間でイメージングを開始し、窓をきれいにします。</li>
	<li>Ti:サファイアレーザーを搭載したカスタムメイドまたは市販の多光子顕微鏡でイメージングを実行します。高開口数(NA)水浸漬対物レンズを使用して画像を取得します。 メモ: 2 チャンネルイメージングは、565 nm ダイクロイックミラーと 2 本の外部光電子増倍管を使用して実現されます。GCaMP6f 発光の検出には 535/50 バンドパスフィルタを使用し、tdTomatoの検出には 610/75 バンドパスフィルタを使用します。25倍の水浸漬対物レンズ(1.05 NA)と共振スキャナを使用して、 図1 と 図2に示す画像を取得しました。関心のある各領域は、軸方向に1μmずつ分離された画像のスタックで構成されていた。各光学セクションは、512 x 512ピクセル、0.18 μm/ピクセルで収集されました。画像は、定位座標によって決定されるように一次運動皮質の前肢領域から取得された。</li>
	<li>レーザーの波長を 920 nm (赤方偏移 GECI を使用する場合は 990 nm) に設定します。</li>
	<li>マウスをモバイルホームケージの上に置き、ヘッドプレートを頭部固定アームにクランプします。</li>
	<li>窓の中央に数滴の水を加えます。</li>
	<li>顕微鏡の広視野モードを使用して、容易に識別可能な血管系の2〜3つの位置を選択する。これらの血管の画像を保存し、モーターコントローラに表示されるX座標とY座標を記録して、tdTomatoラベルの樹状突起を再配置して、その後のイメージングセッションに使用します。毎回X座標とY座標を調整して、保存した血管の画像と再調整します。</li>
	<li>血管系を画像化し、位置を記録したら、tdTomatoを発現するニューロンを持つ領域を見つけます(図1)。ニューロンのシナプス構造(樹状突起および軸索)およびアストロサイトにおけるGCaMP6f活性を画像化する。 注:樹状突起は、同じ領域に確実に戻り、同じ樹状突起および星状細胞を繰り返し数日間にわたって画像化するためのランドマークとして機能します。安定した頭部固定および馴化後の頭部固定では、撮像面における検出可能なシフトは観察されなかった。X 方向と Y 方向に発生する変位は、モーション補正されます。</li>
	<li>イメージング後、マウスをケージに戻します。 注: マウスは通常、スコープ内に最大 2 時間保持されます。撮影が長時間続くと、対物レンズの下の水が乾くことがあります。実験中に水を加える必要があります。あるいは、水の代わりに超音波ゲルを使用することができる。</li>
</ol>

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</ol>

ここでは、空中持ち上げられたホームケージ上の覚醒した頭部拘束マウスにおける皮質アストロサイトおよびニューロンの in vivo イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルを提示した。GECIsおよびニューロンシナプス構造を発現するアストロサイトを画像化するための頭蓋窓アプリケーションの具体例が提供されている。多光子顕微鏡法を用いることで、アストロサイトカルシウムシグナル伝達ダイナミクスと構造シナプスダイナミクスを数日間にわたって繰り返し記録することができます。
慢性頭蓋窓は、良好な光学画像品質を提供し、同じニューロンおよびグリア構造に対して複数の画像化セッションを実行することを可能にする。このアプローチはまた、開頭術をカバーガラスで覆う前に頭蓋内ウイルス注射を行うことを可能にする。 ユーザーは、慢性頭蓋窓の移植によって生じる多くの制限に注意する必要があります。高品質の窓を達成し、動物の生存を確保するためには、経験と多くの練習が必要です。さらに、手術は侵襲的であり、炎症反応をもたらし得る。手術中および手術後の回復中の薬理学的処置には、抗炎症薬および...

マウスの皮質においてin vivo多光子蛍光顕微鏡検査を行う能力は、細胞シグナル伝達および構造1、2、3、4、5、6、7、8、9、疾患病理学10、11、および細胞発生12,13の研究にとって最も重要である。.慢性頭蓋窓の移植により、縦方向の画像化が可能であり、生きた動物において皮質領域の数日、数週間、または数ヶ月13,14の反復画像化を可能にする。多光子顕微鏡は、深度プロービングの改善と使用される赤外線レーザーに関連する光損傷の低減により、in vivo、反復イメージングに最適です。これにより、様々な皮質領域における特定の細胞の分子動態および細胞動態の研究が可能になる。
多光子顕微鏡は、マウス15、16、17、18、19、20におけるニューロンおよびグリア細胞のインビボイメージングに使用されている。特定の細胞型および関心のある領域を標識するために、様々な戦略を実施することができる。1つの一般的なアプローチは、Cre-Lox組換え系を用いて、遺伝的にコードされた蛍光タンパク質の発現を細胞特異的な方法で駆動することである。これは、遺伝子改変マウスを用いて、例えば、tdTomato「フロックス」マウス(Ai14)を、目的のプロモーター21の下でCreリコンビナーゼを発現するマウスと交配させることで行うことができる。あるいは、細胞特異的および部位特異的標識は、ウイルス注射によって達成され得る。ここでは、細胞特異的プロモーター下のCreリコンビナーゼをコードするウイルスと、目的のフロックス化遺伝子をコードするウイルスとを、規定領域に注入する。両方のウイルスベクターを受け取る適切な細胞型は、所望の遺伝子を発現する。これらの遺伝子は、tdTomatoなどの構造マーカーとして、細胞形態の変化22、またはGCaMPおよび/またはRCaMPなどの遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)を表示してカルシウム動態を調べることができます23。遺伝子組換えの方法は、1つ以上の細胞型を標識するために個々にまたは組み合わせて適用することができる。第3のアプローチは、トランスジェニックマウスまたはウイルス構築物(パッケージング能力が限られている)を必要としない、DNA構築物24の子宮エレクトロポレーションである。エレクトロポレーションのタイミングに応じて、異なる細胞型を標的とすることができる25、26、27。
多光子イメージングを行う場合、マウスは、覚醒中または麻酔をかけながら画像化することができる。覚醒マウスの撮像は、取り付けられたヘッドプレート28を介してマウスを固定することにより行うことができる。このアプローチは、マウスが取り付けられたヘッドプレートによって固定され、開放チャンバ30内を移動させられる、自由浮遊、空気支持発泡スチロールボール29、自由浮遊トレッドミル1、または空中吊り下げ式ホームケージシステムなどの方法を用いて、動物の比較的自由な移動を可能にすることによって、ストレスを少なくする。これらの画像化条件のそれぞれについて、まずマウスを画像化セットアップに慣れさせる必要があるであろう。本稿では、空輸式ホームケージシステムを用いた馴化とイメージングの手順について述べる。
このプロトコールは、皮質における縦方向の in vivo イメージングのための慢性頭蓋窓の移植を記載する。ここでは、アストロサイトにおいてGCaMP6fを条件付きに発現するマウスを用いて、カルシウムシグナル伝達ダイナミクスをモニターする。さらに、本稿では、tdTomatoをニューロンの標識として用いたウイルス注射の手順について述べる。これにより、ニューロンシナプス構造の変化の決定および/または同じアストロサイトの反復イメージングを可能にする構造マーカーとしての利用可能性が可能になる。プロトコル全体を通して、多光子顕微鏡から得られた画像の可能な限り最高の品質を確保するために、重要なステップが強調されます。

<table><tbody><tr><td>15o ポインテッドブレード</td><td>Surgistar</td><td>6500</td><td>手術ツール</td></tr><tr><td>19 G 針</td><td>BD</td><td>305186</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>AAV1-CAG-FLEX-tdTomato</td><td>Addgene</td><td>28306-AAV1</td><td>ウイルスベクター</td></tr><tr><td>AAV1-CaMKII-0-4-CRE</td><td>Addgene</td><td>105558-AAV1</td><td>ウイルスベクター</td></tr><tr><td>Acteone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A16P4</td><td>試薬</td></tr><tr><td>アルコール調製パッド</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>Covidien 5750</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>ベベラー</td><td>成重</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>ワールド精密機器</td><td>TW100F-4</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>超硬バー</td><td>SS ホワイトデンタル</td><td>14717</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>カルプロフェン (リマジル)、50 mg/mL</td><td>ゾエティス マイラン インスティテューショナル、LLC.Drug</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>圧縮空気</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>23-022-523</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>コットンチップアプリケーター</td><td>ピューリタン</td><td>836-WC バインダーなし</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>カバー ガラス、厚さ No.1、3 mm/5 mm</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-0720、64-0700</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>デンタルドリル</td><td>アセプチコ</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>デキサメタゾン、4mg / mL</td><td>マイランインスティテューショナル、LLC。</td><td></td><td>薬物</td></tr><tr><td>解剖顕微鏡</td><td>ニコン</td><td></td><td>装置</td></tr><tr><td>デュラレイリキッド&nbsp;(歯科用セメント液)</td><td>パターソンデンタル</td><td>602-8518</td><td>試薬</td></tr><tr><td>デュラレイパウダー&nbsp;(歯科用セメントパウダー)</td><td>パターソン歯科</td><td>602-7932</td><td>試薬</td></tr><tr><td>エンロフロキサシン、2.27%</td><td>バイエル</td><td></td><td>薬</td></tr><tr><td>眼軟膏</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>手術供給</td></tr><tr><td>ファイバーライト高強度イルミネ</td><td>ーターDolan-Jennerインダストリー</td><td></td><td>ズ機器</td></tr><tr><td>鉗子(大)</td><td>ワールド精密機器</td><td>14099</td><td>手術ツール</td></tr><tr><td>鉗子(Small)</td><td>World Precision Instruments</td><td>501764</td><td>Surgery Tools</td></tr><tr><td>GCaMP6f B6; 129S-GT(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No: 024105</td><td>Mouse line</td></tr><tr><td>Germinator</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Equipment</td></tr><tr><td>GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No: 012586</td><td>Mouse Line</td></tr><tr><td>ヘッドプレート</td><td>Neurotar</td><td>Model 1, Model 3</td><td>Surgery Supply</td></tr><tr><td>止血鉗子</td><td>World Precision Instruments</td><td>501705</td><td>Surgery Tools</td></tr><tr><td>Holder for 15o Pointed Blade World</td><td>Precision Instruments</td><td>501247</td><td>Surgery Tools</td></tr><tr><td>Holder for Scalpel Blades World</td><td>Precision Instruments</td><td></td><td>500236 Surgery</td></tr> <tr>Tools<td>ヨウ素準備パッド</td><td>Avantor</td><td>15648-926</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>ピラマル</td><td></td><td>手術用品</td></tr><tr><td>イソフルラン テーブルトップシステム 誘導ボックス付き</td><td>ハーバード 装置</td><td></td><td></td></tr><tr><td>機器 イソフルラン気化器</td><td>SurgiVet</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>Krazy Glue</td><td>オフィスデポ</td><td>KG517</td><td>試薬</td></tr><tr><td>ロックタイト 401</td><td>ヘンケル</td><td>40140</td><td>速硬化型 瞬間接着剤</td></tr><tr><td>ロックタイト 454</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>NC9194415</td><td>シアノアクリレート 接着剤</td></tr><tr><td>ゲル マイクロピペット プーラー</td><td>サッター 機器</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>多光子顕微鏡</td><td></td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>窒素</td><td>マセソン</td><td>NI M200</td><td>ガス</td></tr><tr><td>酸素</td><td>マセソン</td><td>OXM250</td><td>ガス</td></tr><tr><td>ピコスプリッツァー</td><td>パーカー</td><td></td><td>細胞内マイクロインジェクション ディスペンス</td></tr><tr><td>システム ピペットチップ</td><td>レイニン</td><td>17014340</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>げっ歯類 ヘアトリマー</td><td>ウォール</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>生理食塩水 (0.9% 塩化ナトリウム)</td><td>Med Vet International</td><td>RX0.9NACL-30BAC</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>メスブレード、サイズ 11</td><td>インテグラ</td><td>4-111</td><td>手術器具</td></tr><tr>は<td>さみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>503667</td><td>手術器具</td></tr><tr><td>脳定位固定装置</td>スト<td>ールティング</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>スギ スポンジストリップ(スポンジストリップ)</td><td>ケッテンバッハデンタル</td><td>31002</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>SURGIFOAM(ゲルフォーム)</td><td>エチコン</td><td>1972</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>シリンジ 26g針付き</td><td>BD</td><td>309625</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>タモキシフェン</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T5648-1G</td><td>試薬</td></tr><tr><td>Ti:サファイア レーザー</td><td>コヒーレント</td><td></td><td>機器</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-711-9AM</td><td>手術用品</td></tr><tr><td>ウォーターブランケット</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td><td></td>ック<td>機器</td></tr><tr><td>キシロカイン MPF エピネフリン (1:200,000)、10 mg/mL</td><td>フレゼニウスカビUSA</td><td></td><td>ドラッグ</td></tr></tbody></table>

覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice

行動する動物におけるニューロンおよびグリアの細胞生理機能を完全に理解するためには、それらの形態を視覚化し、行動するマウス における生体内で のそれらの活性を記録する必要がある。この論文では、覚醒した頭部拘束マウスの脳細胞の縦方向イメージングを可能にするために、慢性頭蓋窓を移植する方法について説明する。遺伝的戦略およびウイルス注射と組み合わせて、特定の細胞および関心のある領域を構造的または生理学的マーカーで標識することができる。このプロトコルは、頭蓋窓を通して両方の細胞を同時にイメージングするために、皮質内のGCaMP6発現アストロサイトの近傍のニューロンを標識するためにウイルス注射を組み合わせる方法を実証する。同じ細胞の多光子イメージングは、目を覚まし、行動する動物で数日、数週間、または数ヶ月間行うことができる。このアプローチは、研究者に細胞ダイナミクスをリアルタイムで表示するための方法を提供し、神経科学における多くの質問に答えるために適用することができます。

頭蓋窓の質は、ニューロン構造がどれほど鮮明に見えるかによって評価することができる。良い窓には、樹枝状の棘がはっきりと見えます(図1)。構造データと位置データを保存すると、同じ動物を数日、数週間、または数か月にわたって繰り返し画像化して、同じ細胞を調べることができます(図1)。 図1 の画像は、一次運動皮質の前肢領域(5mmの窓内)から得られた。構造シナプス可塑性を研究するために、樹状突起スパインおよび軸索ブートンの密度およびダイナミクスを含む様々なパラメータを測定することができる。アストロサイト活性は、カルシウムシグナル伝達の時空間ダイナミクスを解析することで研究することができる(図2)。顕微鏡の能力(すなわち、共振スキャナ、対物レンズを制御するピエゾモータ)および実験上の問題に応じて、タイムラプスイメージングを単一焦点面または体積または多領域で実行して、所望の取得周波数でカルシウム活性を監視すること...

ここに提示されるのは、覚醒した頭部拘束マウスにおける脳細胞の縦方向イメージングのための慢性頭蓋窓の移植のためのプロトコルである。

To fully understand the cellular physiology of neurons and glia in behaving animals, it is necessary to visualize their morphology and record their ...

このプロトコルは、ウイルス注射を行い、覚醒した頭部拘束マウスの脳細胞をイメージングするための頭蓋窓を移植する方法を記述している。この方法の利点は、ニューロンおよびアストロサイトの構造および活性を複数のセッションにわたって繰り返し画像化できることである。このアプローチは、神経発達障害または神経変性障害のモデルにおいて神経細胞がどのように変化するか、または経験依存性の可塑性が損なわれているかどうかを決定するために使用することができる。まず、鼻クランプとイヤーバーを使用して、麻酔をかけられたマウスを定位フレームに固定します。滅菌手術器具を使用して、前頭縫合糸からブレグマの前部からラムダの後部までの皮膚を切断して除去する。滅菌サイズ11炭素鋼手術用ブレードを使用して、頭蓋骨からすべての結合組織を静かにこすり取る。歯科用ドリルの助けを借りて、頭蓋骨を同心円状に開口部の輪郭に沿って徐々にドリルして、骨の薄肉化を容易にします。同心円状のパスが終わるたびに、ドリルしたエリアに生理食塩水を1滴または2滴加え、生理食塩水を少なくとも10秒間放置してから掘削を再開します。頭蓋骨の中央部を細かい鉗子で優しく押して、頭蓋骨が十分に薄くなって動いていることを確認します。掘削が行われた基礎となる血管系が無傷であり、骨に亀裂が入っていないことを確認してください。細くなった骨に15度の尖ったミニチュアの刃を慎重に挿入し、生理食塩水に浸したゲルフォームを切断して使用し、出血を止める。鉗子を使用して、硬膜を傷つけないように注意しながら、骨を慎重に持ち上げて取り外します。注射のために、滅菌された面取りガラスピペットに20マイクロメートルの先端をウイルス混合物で充填する。次に、ピペットを下げて脳の表面に触れ、層2/3注射のためにさらに200〜300マイクロメートル下げ続けます。細胞内マイクロインジェクションディスペンスシステムを用いて、システムを2分間にわたって12〜15回加圧注入する。頭蓋窓の移植のために、頭蓋骨の開口部の上にカバーガラスを置きます。鉗子を使用して、ガラスが開口部上で平らになっていることを確認します。ガラス窓の端を頭蓋骨に密封するには、ガラス表面の周囲にシアノアクリレート粘着ゲルを塗布する。接着ゲルの上に、接着剤の層を塗布する。次に、歯科用セメント液の層を追加します。歯科用セメントが固まったら、ヘリコプター式ヘッドプレートの中央開口部に接着剤の薄い層を塗り、カバーガラスの上に適当な大きさのヘリコプター式ヘッドプレートを置きます。接着剤を乾かします。歯科用セメント粉末を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに0.1ミリリットルのマークまで加えます。7〜8滴の速硬化性瞬間接着剤を粉末に混合し、得られた混合物を1ミリリットルのシリンジに引き込み、19ゲージの針を切断してより大きな開口部を作ります。混合粉末をヘリコプター バーの側面の穴から、どちらかの側から染み出すまで注入します。歯科用セメント接着剤混合物を露出した頭蓋骨の残りの部分に塗布して、ヘッドプレートを頭蓋骨に固定する。マウスを布で包み、ヘッドプレートを介して空輸されたホームケージの頭部固定アームに固定してから、ホームケージを光にさらしたままにします。15分の慣れ時間の後、マウスをホームケージから取り出します。顕微鏡の広視野モードを用いて、容易に識別可能な血管系の2〜3つの位置を選択する。血管の画像を保存し、モーターコントローラに表示されるx座標とy座標を記録します。ニューロンのシナプス構造、およびアストロサイトにおけるGCaMP6f活性を画像化する。代表的な解析では、頭蓋窓の質を、樹状突起およびGCaMP6f発現アストロサイトのイメージングを数日間にわたって繰り返して評価した。良い窓では、ニューロン構造ははっきりと見える樹状突起の棘で鮮明に見えました。イメージングの2日目に2つの新しい脊椎が現れました。1つの背骨だけが持続し、5日目に見えました。カルシウム活性は、異なる時点でGCaMP6fを発現するアストロサイトにおいて研究された。セル全体を含む世界的な出来事は、移動試合中に目撃されました。このプロトコルの2つの重要なステップは、骨を除去する前に骨を適切に薄くする必要があること、および開口部の上にカバーガラスを適切に配置する必要があることです。イメージングは、イメージング中、または新しい運動スキルの学習などの行動後の行動分析と組み合わせて、ニューロンおよびアストロサイトの構造および機能が学習によってどのように調節されるかを決定することができる。

implantation-cranial-window-for-repeated-vivo-imaging-awake

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ポリッシュと補強薄頭蓋骨（ポート）頭蓋窓と神経膠芽腫（GBM）の細胞注入を組み合わせることによって、我々は、神経膠腫の開始と縦ライブマウスの脳内に注入GBM細胞からの成長を観察することができます。...

イメージンググリオーマ開始<emインビボで&gt;</em&gt;ポリッシュと補強シン頭蓋骨頭蓋窓スルー

このビデオでは、脳のさまざまな領域への安定した光学アクセスのために、マウスモデルに頭蓋窓を埋め込む外科的処置を紹介しています。...

マウスモデルにおける頭蓋イメージングウィンドウの移植:マウス脳領域への安定した光学アクセスのためのガラスベースのカバースリップを埋め込む外科的処置

このビデオは、トランスジェニックマウスの光学窓を通して脳の神経活動を記録する方法を示しています。マウスは、神経活動の検出を可能にする蛍光タンパク質を発現します。頭蓋骨のごく一部を慎重に取り外して光学窓を設置し、その後、頭蓋骨を黒いセメントで覆って光を遮断してからイメージングします。...

トランスジェニックマウスの脳内への光学窓の搭載による神経活動の画像化

出典: Pietruczyk, E. A., et al.マウスにおける椎弓切除術と脊髄窓移植J. Vis. 経験。(2019年)このビデオは、in vivo イメージングのために麻酔をかけたマウスに脊髄ウィンドウを移植する方法を示しています。このプロトコルは、ホウケイ酸カバーガラスと 3D...

in vivoイメージングのためのマウスへの脊髄ウィンドウ移植

このプロトコルは、神経-神経膠血管構造の縦画像化、相互作用、および健康および疾患条件の両方における機能に使用できる慢性頭蓋窓移植技術を記述する。これは、多くの場合、好ましいが、いくつかの重大な制限を有する経頭蓋イメージングアプローチに対する補完的な代替手段として機能する。...

マウスにおける神経免疫ダイナミクスの反復インビボイメージングを行う正確な脳マッピング

このプロトコルは、交換可能な蓋(R.MIW)を備えた新しい乳房イメージングウィンドウを記述しています。R.MIWの移植後の生体内顕微鏡検査は、異なる発達段階の間に細胞分解能を有する健康および罹患した乳腺の縦方向および複数日のイメージングを可能にする。...

交換可能な蓋付き乳房イメージングウィンドウを使用した縦方向のバイタル内顕微鏡

ここでは、覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動を同時にイメージングするためのアデノ随伴ウイルス注入と頭蓋窓移植を組み合わせたプロトコルについて説明します。...

覚醒マウスにおけるミクログリア動態と神経活動の同時イメージング

本プロトコルは、フードラップ、透明シリコーン、およびカバーガラスを使用して、大きな(6 x 3 mm2)頭蓋窓を作成することについて説明しています。この頭蓋窓は、同じマウスでの in vivo...

インビボ 大きな頭蓋窓を用いたマウスからの広視野および2光子カルシウムイメージング

この研究は、マウスへの反復性外傷性脳損傷の送達と、2光子顕微鏡を使用したニューロン発現EGFPのその後の生体内イメージングのための頭蓋窓の同時移植を示しています。...

2光子顕微鏡を用いた閉鎖頭蓋外傷性脳損傷マウスおよび頭蓋窓における蛍光タンパク質発現の生体内イメージング

本プロトコルには、蛍光発泡スチレン微小球を用いた in vivo 二光子顕微鏡イメージングに最適な慢性頭蓋ウィンドウおよび微小血管塞栓症マウスモデルの段階的アプローチを詳細に記述しています。...

蛍光発泡スチレン微小球を用いた 生体内 2光子顕微鏡用微小血管塞栓症マウスモデル

このプロトコルは、マウスに大きくて再封閉可能で硬膜を温存する頭蓋窓を作るための二段階の外科的手法を説明しています。この技術により、デフォルトモードネットワークのような分散型深部脳ネットワークから数週間にわたる慢性的かつ多モーダルな電気生理学的記録が可能になります。...

マウスデフォルトモードネットワークの縦方向多モーダル電気生理学記録を可能にする大型再封閉可能な頭蓋窓の手術プロトコル

学ぶ 覚醒マウスの頭蓋窓移植による反復生体内イメージング法。神経細胞とアストロサイトの構造と活動を長期的に可視化し、神経発達障害や神経変性疾患モデルでの細胞動態の変化を評価する。

覚醒マウスにおける反復生体内イメージングのための頭蓋窓の移植

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覚醒マウスにおける 反復生体内 イメージングのための頭蓋窓の移植

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