Name: RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 35 s
Description: 学ぶRNA-seqデータにおける選択的スプライシングとポリアデニル化の同定法。limma、edgeR、rMATSを用いたエクソンベースとイベントベースの解析手法で、転写産物多様性と遺伝子発現制御を理解する。

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この研究は、オーストラリア研究評議会(ARC)のフューチャーフェローシップ(FT16010043)およびANUフューチャースキームの支援を受けました。

<ol><li>Katz, Y., Wang, E. T., Airoldi, E. M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+design+of+RNA+sequencing+experiments+for+identifying+isoform+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis and design of RNA sequencing experiments for identifying isoform regulation.</a> Nature Methods. 7 (12), 1009-1015 (2010).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+alternative+splicing+and+its+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Reports%22%5BJournal%5D)">Mechanism of alternative splicing and its regulation.</a> Biomedical Reports. 3 (2), 152-158 (2015).</li>
<li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in Bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li>
<li>Movassat, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+between+alternative+polyadenylation+and+alternative+splicing+is+limited+to+terminal+introns%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biology%22%5BJournal%5D)">Coupling between alternative polyadenylation and alternative splicing is limited to terminal introns.</a> RNA Biology. 13 (7), 646-655 (2016).</li>
<li>Tian, B., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+mRNA+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of mRNA precursors.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (1), 18-30 (2017).</li>
<li>Herrmann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PolyASite+2.0%3A+a+consolidated+atlas+of+polyadenylation+sites+from+3%27+end+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">PolyASite 2.0: a consolidated atlas of polyadenylation sites from 3' end sequencing.</a> Nucleic Acids Research. 48 (1), 174-179 (2020).</li>
<li>Liu, R., Loraine, A. E., Dickerson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparisons+of+computational+methods+for+differential+alternative+splicing+detection+using+RNA-seq+in+plant+systems%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Comparisons of computational methods for differential alternative splicing detection using RNA-seq in plant systems.</a> BMC Bioinformatics. 15 (1), 364(2014).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biology. 17 (1), 13(2016).</li>
<li>Anders, S., Reyes, A., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+differential+usage+of+exons+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Detecting differential usage of exons from RNA-seq data.</a> Genome Research. 22 (10), 2008-2017 (2012).</li>
<li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47(2014).</li>
<li>Shen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rMATS%3A+Robust+and+flexible+detection+of+differential+alternative+splicing+from+replicate+RNA-Seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (51), 5593-5601 (2014).</li>
<li>Mehmood, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+evaluation+of+differential+splicing+tools+for+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 21 (6), 2052-2065 (2020).</li>
<li>Kanitz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+assessment+of+methods+for+the+computational+inference+of+transcript+isoform+abundance+from+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">Comparative assessment of methods for the computational inference of transcript isoform abundance from RNA-seq data.</a> Genome biology. 16 (1), 1-26 (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biology. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Sznajder, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MBNL1+induces+RNA+misprocessing+in+the+thymus+and+peripheral+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Loss of MBNL1 induces RNA misprocessing in the thymus and peripheral blood.</a> Nature Communications. 11, 1-11 (2020).</li>
<li>Batra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+MBNL+leads+to+disruption+of+developmentally+regulated+alternative+polyadenylation+in+RNA-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of MBNL leads to disruption of developmentally regulated alternative polyadenylation in RNA-mediated disease.</a> Molecular Cell. 56 (2), 311-322 (2014).</li>
<li>Leinonen, R., Sugawara, H., Shumway, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sequence+read+archive%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">The sequence read archive.</a> Nucleic acids research. 39, suppl_1 19-21 (2010).</li>
<li>Tange, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTange%2C+O+%22GNU+parallel-the+command-line+power+tool%22">GNU parallel-the command-line power tool</a>. 36, 42-47 (2011).</li>
<li>Andrews, S. FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. Bioinformatics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/2010">http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/2010</a> (2011).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads%5BTitle%5D)+AND+%22EMBnet+journal%22%5BJournal%5D)">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), Oxford, England. 15-21 (2013).</li>
<li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((edgeR%3A+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li>
<li>Robinson, M. D., Oshlack, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scaling+normalization+method+for+differential+expression+analysis+of+RNA-seq+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">A scaling normalization method for differential expression analysis of RNA-seq data.</a> Genome Biology. 11 (3), 25(2010).</li>
<li>Veiga, D. F. T. maser: Mapping Alternative Splicing Events to pRoteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aVeiga%2C+DFT+%22R+package+version+1.4.0%22">R package version 1.4.0</a>. , (2019).</li>
<li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biology. 10 (13), 25(2009).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).</li>
<li>Ramírez, F., Dündar, F., Diehl, S., Grüning, B. A., Manke, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((deepTools%3A+a+flexible+platform+for+exploring+deep-sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">deepTools: a flexible platform for exploring deep-sequencing data.</a> Nucleic acids research. 42 (1), 187-191 (2014).</li>
<li>Merino, G. A., Conesa, A., Fernández, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+benchmarking+of+workflows+for+detecting+differential+splicing+and+differential+expression+at+isoform+level+in+human+RNA-seq+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A benchmarking of workflows for detecting differential splicing and differential expression at isoform level in human RNA-seq studies.</a> Briefings in bioinformatics. 20 (2), 471-481 (2019).</li>
<li>Chhangawala, S., Rudy, G., Mason, C. E., Rosenfeld, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+read+length+on+quantification+of+differentially+expressed+genes+and+splice+junction+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+biology%22%5BJournal%5D)">The impact of read length on quantification of differentially expressed genes and splice junction detection.</a> Genome biology. 16 (1), 1-10 (2015).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17, 13(2016).</li>
<li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. 7 (3), 562-578 (2012).</li>
<li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RSEM%3A+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323(2011).</li>
<li>Bray, N. L., Pimentel, H., Melsted, P., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-optimal+probabilistic+RNA-seq+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Near-optimal probabilistic RNA-seq quantification.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 525-527 (2016).</li>
</ol>

著者は開示するものは何もありません。

この研究では、バルクRNA-Seqおよび3'末端シーケンシングデータからASおよびAPAを検出するためのエクソンベースおよびイベントベースのアプローチを評価しました。エクソンベースのASアプローチは、発現差のあるエクソンのリストと、全体的な遺伝子レベルの差次的スプライシング活性の統計的有意性によって順序付けられた遺伝子レベルのランク付けの両方を生成します(表1-2、4-5)。diffSpliceパッケージの場合、差分使用量は、エクソンレベルで重み付き線形モデルをフィッティングして、同じ遺伝子内の他のエクソンの平均対数フォールド変化(パーエクソンFCと呼ばれる)に対するエクソンの微分対数フォールド変化を推定することによって決定されます。遺伝子レベルの統計的有意性は、個々のエクソンレベルの有意性検定をSimes法10による遺伝子ごとの検定に組み合わせることによって計算されます。遺伝子レベルの差次的スプライシング活性によるこのランキングは、続いて、関与する主要な経路の遺伝子セット濃縮分析(GSEA)を実行するために使用することができる<sup class="xr...

RNA-seqは、通常、差次的遺伝子発現の推定および遺伝子発見1に広く使用されてきました。また、異なるアイソフォームを発現する遺伝子によるエクソンレベルの使用状況の推定にも利用でき、転写後レベルでの遺伝子制御の理解に貢献します。真核生物遺伝子の大部分は、選択的スプライシング(AS)によって異なるアイソフォームを生成し、mRNA発現の多様性を高めます。ASイベントは、異なるパターンに分けることができる:完全エクソン(SE)のスキップ(カセット)エクソンが、その隣接するイントロンと共に転写物から完全に除去される。エクソンの両端に2つ以上のスプライス部位が存在する場合の代替(ドナー)5'スプライス部位選択(A5SS)および代替3'(アクセプター)スプライス部位選択(A3SS);イントロンが成熟mRNA転写物内に保持される場合のイントロンの保持(RI)、および一度に2つの利用可能なエクソンのうちの1つだけを保持できるエクソン使用の相互排除(MXE)2,3。代替ポリアデニル化(APA)はまた、単一の転写産物から複数のmRNAアイソフォームを生成する代替ポリ(A)部位を用いて遺伝子発現を調節する上で重要な役割を果たす4。ほとんどのポリアデニル化部位(pA)は3'非翻訳領域(3' UTR)に位置し、多様な3' UTR長のmRNAアイソフォームを生成します。3' UTRは調節要素を認識するための中心的なハブであるため、異なる3' UTR長はmRNAの局在、安定性および翻訳に影響を与える可能性があります5。プロトコル6の詳細が異なるAPAを検出するために最適化された3'エンドシーケンシングアッセイのクラスがあります。ここで説明するパイプラインはPolyA-seq用に設計されていますが、説明されているように他のプロトコルにも適合させることができます。
本研究では、エクソンベース(DEXSeq9、diffSplice10)とイベントベース(転写産物スプライシングの反復多変量解析(rMATS)11)の2つの大きなカテゴリに分類できる、差動エクソン解析法7,8(図1)のパイプラインを提示します。エクソンベースの方法は、個々のエクソンの条件にわたるフォールド変化を、発現差のあるエクソン使用量を呼び出すための全体的な遺伝子フォールド変化の測定値と比較し、そこからAS活性の遺伝子レベルの測定値を計算します。イベントベースの方法は、エクソン-イントロン-スパニング接合リードを使用して、エクソンスキップやイントロンの保持などの特定のスプライシングイベントを検出および分類し、出力3でこれらのASタイプを区別します。したがって、これらの方法は、AS12,13の完全な分析のための補完的なビューを提供します。DEXSeq(DESeq214 DGEパッケージに基づく)とdiffSplice(Limma10 DGEパッケージに基づく)は、差動スプライシング解析に最も広く使用されているパッケージであるため、研究に選択しました。rMATSは、イベントベースの分析の一般的な方法として選択されました。別の一般的なイベントベースの方法は、MISO(アイソフォームの混合)1です。APAでは、エクソンベースのアプローチを採用しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62636/62636fig01.jpg"> 図 1.分析パイプライン。 分析で使用されるステップのフローチャート。手順には、データの取得、品質チェックとリードアライメントの実行、その後の既知のエクソン、イントロン、pAサイトのアノテーションを使用したリードのカウント、低カウントを削除するためのフィルタリング、正規化が含まれます。PolyA-seqデータはdiffSplice/DEXSeq法を用いて代替pA部位について解析し、バルクRNA-SeqはdiffSplice/DEXseq法を用いてエクソンレベルでの選択的スプライシングについて解析し、ASイベントはrMATSを用いて解析した。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62636/62636fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
本調査で用いたRNA-seqデータは、Gene Expression Omnibus(GEO)(GSE138691)15から取得したものである。この研究のマウスRNA-seqデータを、野生型(WT)とマッスルブラインド様タイプ1ノックアウト(Mbnl1 KO)の2つの条件群で使用し、それぞれ3回の反復を行いました。差的ポリアデニル化部位利用分析を実証するために、マウス胚線維芽細胞(MEF)PolyA-seqデータ(GEOアクセッションGSE60487)16を得た。データには、野生型(WT)、マッスルブラインド様タイプ1/タイプ2ダブルノックアウト(Mbnl1/2 DKO)、Mbnl3ノックダウン(KD)を備えたMbnl 1/2 DKO、およびMbnl3コントロール(Ctrl)を備えたMbnl1/2DKOの4つの条件グループがあります。各条件グループは、2 つの反復で構成されます。
<table border="1" fo:font-size="5px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>ゲオアクセッション</td>
			<td>SRA 実行番号</td>
			<td>サンプル名</td>
			<td>条件</td>
			<td>レプリケート</td>
			<td>組織</td>
			<td>シークエンシング</td>
			<td>読み取り長</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">RNA-シークエンス</td>
			<td>GSM4116218</td>
			<td>SRR10261601</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_1</td>
			<td>Mbnl1ノックアウト</td>
			<td>担当者 1</td>
			<td>胸腺</td>
			<td>ペアエンド</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116219</td>
			<td>SRR10261602</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_2</td>
			<td>Mbnl1ノックアウト</td>
			<td>担当者 2</td>
			<td>胸腺</td>
			<td>ペアエンド</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116220</td>
			<td>SRR10261603</td>
			<td>Mbnl1KO_Thymus_3</td>
			<td>Mbnl1ノックアウト</td>
			<td>担当者 3</td>
			<td>胸腺</td>
			<td>ペアエンド</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116221</td>
			<td>SRR10261604</td>
			<td>WT_Thymus_1</td>
			<td>野生型</td>
			<td>担当者 1</td>
			<td>胸腺</td>
			<td>ペアエンド</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116222</td>
			<td>SRR10261605</td>
			<td>WT_Thymus_2</td>
			<td>野生型</td>
			<td>担当者 2</td>
			<td>胸腺</td>
			<td>ペアエンド</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM4116223</td>
			<td>SRR10261606</td>
			<td>WT_Thymus_3</td>
			<td>野生型</td>
			<td>担当者 3</td>
			<td>胸腺</td>
			<td>ペアエンド</td>
			<td>100 bp</td>
		</tr><tr><td rowspan="8">3P-シーケンセック</td>
			<td>GSM1480973</td>
			<td>SRR1553129</td>
			<td>WT_1</td>
			<td>野生型(WT)</td>
			<td>担当者 1</td>
			<td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)</td>
			<td>シングルエンド</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480974</td>
			<td>SRR1553130</td>
			<td>WT_2</td>
			<td>野生型(WT)</td>
			<td>担当者 2</td>
			<td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)</td>
			<td>シングルエンド</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480975</td>
			<td>SRR1553131</td>
			<td>DKO_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 ダブルノックアウト (DKO)</td>
			<td>担当者 1</td>
			<td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)</td>
			<td>シングルエンド</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480976</td>
			<td>SRR1553132</td>
			<td>DKO_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 ダブルノックアウト (DKO)</td>
			<td>担当者 2</td>
			<td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)</td>
			<td>シングルエンド</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480977</td>
			<td>SRR1553133</td>
			<td>DKOsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 ダブルノックアウト Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>担当者 1</td>
			<td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)</td>
			<td>シングルエンド</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480978</td>
			<td>SRR1553134</td>
			<td>DKOsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 ダブルノックアウト Mbnl 3 siRNA (KD)</td>
			<td>担当者 2</td>
			<td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)</td>
			<td>シングルエンド</td>
			<td>36 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480979</td>
			<td>SRR1553135</td>
			<td>DKONTsiRNA_1</td>
			<td>Mbnl 1/2 ダブルノックアウトとノンターゲティング siRNA (Ctrl)</td>
			<td>担当者 1</td>
			<td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)</td>
			<td>シングルエンド</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr><tr><td>GSM1480980</td>
			<td>SRR1553136</td>
			<td>DKONTsiRNA_2</td>
			<td>Mbnl 1/2 ダブルノックアウトとノンターゲティング siRNA (Ctrl)</td>
			<td>担当者 2</td>
			<td>マウス胚性線維芽細胞(MEF)</td>
			<td>シングルエンド</td>
			<td>40 bp</td>
		</tr></tbody></table>表 1.解析に使用したRNA-SeqおよびPolyA-Seqデータセットの概要。

<table><tbody><tr><td>計算研究</td><td></td><td></td><td></td>には関係ありません</tr></tbody></table>

rna-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

Identification of Alternative Splicing and Polyadenylation in RNA-seq Data

実験的/生物学的条件にわたる差次的遺伝子発現(DGE)を測定するためのRNA-Seqの典型的な分析に加えて、RNA-seqデータを利用して、エクソンレベルで他の複雑な調節メカニズムを探索することもできます。選択的スプライシングとポリアデニル化は、転写後レベルで遺伝子発現を調節するための異なるアイソフォームを生成することにより、遺伝子の機能的多様性に重要な役割を果たし、解析を遺伝子レベル全体に限定すると、この重要な調節層を見逃す可能性があります。ここでは、BioconductorおよびDEXSeq、LimmaパッケージのdiffSplice、rMATSなどの他のパッケージと機能を使用して、条件全体でのエクソンおよびポリアデニル化部位の使用状況を識別および視覚化するための詳細なステップバイステップ分析を示します。

上記のステップバイステップのワークフローを実行した後、ASおよびAPA分析出力と代表的な結果は、次のように生成されたテーブルとデータプロットの形式になります。
として： AS分析の主な出力(diffSpliceの補足表1;DEXSeq)の表2)は、条件間で異なる使用を示すエクソンのリスト、およびその構成エクソンの1つ以上の有意な全体的なスプライシング活性を示す遺伝子のリストであり、統計的有意性によってランク付けされています。補足表1のタブ2は有意なエクソンを示し、列はエクソン対休止の差FC、エクソンごとの未調整p値、および調整済みp値(ベンジャミニ-ホックバーグ補正)を示しています。調整されたp値の閾値化は、定義されたFDRを持つエクソンのセットを与えます。補足表1のタブ3は、全体的なスプライシング活性の有意性を示す遺伝子のランク付けされたリストを示し、列はSimes法を用いて計算された遺伝子レベルの調整され...

選択的スプライシング(AS)および選択的ポリアデニル化(APA)は、転写産物アイソフォームとその産物の多様性を拡大します。ここでは、バルクRNA-seqを分析するためのバイオインフォマティクスプロトコルと、実験条件によって変化するASおよびAPAを検出および視覚化するための3'エンドシーケンシングアッセイについて説明します。

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

As well as the typical analysis of RNA-Seq to measure differential gene expression (DGE) across experimental/biological conditions, RNA-seq data can also ...

このプロトコルは、差分スプライシング部位、発現差のあるエクソン、およびポリ(A)部位を特定するための段階的なワークフローを提供することにより、選択的スプライシングおよびポリアデニル化によって生成された遺伝子アイソフォームの包括的な理解を提供します。このプロトコルの主な利点は、選択的スプライシングを研究するためのエクソンベースの方法とイベントベースの方法の両方を評価することです。また、代替ポリアデニル化の研究にエクソンベースの方法を適用します。AS および AP 分析のコードとメモを含む R マークダウン ファイルが提供されています。R Markdownファイルの手順に従い、各手順のメモに慎重に到達することをお勧めします。limma の diffSplice を使用して差分スプライシングを識別するには、R ノートブック ファイルに従ってください。テキスト原稿の説明に従って入力ファイルを準備します。先に進む前に、原稿のステップ1から3が順番に実行され、入力ファイルが準備されていることを確認してください。まず、必要なライブラリをロードします。非特異的フィルタリングを実行するには、まず以前に取得したリードカウントのマトリックスを抽出し、edgeRパッケージからDGEList関数を使用して特徴のリストを作成します(行は遺伝子を表し、列はサンプルを表します)。次に、edgeRパッケージのCPM関数を使用して、データを生のスケールから100万あたりのカウントに変換し、設定可能なしきい値を超えるカウントでエクソンを保持します。このデータセットには6つのサンプルが含まれています。したがって、CPMは1つより大きく、6つのうち少なくとも3つのサンプルに設定されます。M 値のトリム平均を使用して、edgeR パッケージから calcNormFactors 関数を使用してサンプル全体のカウントを正規化します。この関数は、スケーリング係数を計算してライブラリのサイズを調整します。以前に生成したサンプル表を使用して、各サンプルの実験条件を定義する計画マトリックスを作成します。limma パッケージの voom 関数を実行して RNA シーケンシング・データを処理して分散を推定します。この関数は、ポアソンカウントノイズを補正するための精密な重みを生成し、エクソンレベルカウントを変換して、100万個あたり2カウントまたはlogCPMをログに記録します。lmfit 関数を実行して、線形モデルを各エクソンの式データに適合させます。次に、eBayes関数を実行して、適合モデルの経験ベースの統計を計算し、エクソン発現の差を検出します。対象の実験比較のためのコントラスト行列を定義します。コントラストを使用します。比較の各ペアの係数と標準誤差を取得するためのフィット関数。適合モデルでdiffSpliceを実行して、野生型とノックアウト型の間で遺伝子のエクソン使用量の違いをテストします。topSplice関数を使用して、tに等しいテストがASエクソンのランク付けを与え、simesに等しいテストが遺伝子のランク付けを与えるtopSplice関数を使用して、上位にランク付けされた結果を調べます。plotSplice 関数を実行して、結果をプロットします。目的の遺伝子を遺伝子ID引数に入れる際に、赤い点は発現差のあるエクソンを示す。EnhancedVolcanoバイオコンダクターパッケージを使用して火山プロットを生成し、発現差のあるエクソンを示します。rMATS を使用するには、作業ディレクトリの conda または GitHub を使用して、最新バージョンの rMATS バージョン 4.1.1 がインストールされていることを確認します。マッピング後に取得したbamファイルを含むフォルダに移動します。bamファイルの名前とコンマで区切られたパスをコピーする2つの条件について、rMATSで要求されるようにテキストファイルを準備します。rmas を実行します。BAM ファイルのパスと注釈を記述する 2 つの生成された入力テキスト ファイルを使用します。以前に取得した GTF ファイル。これにより、各スプライシングイベントのP値や包含レベルなどの統計を個別に記述するテキストファイルを含む出力フォルダー rmats_outが生成されます。バイオコンダクターパッケージメーザーを使用して、rMATSの結果を調べます。ジャンクションとエクソンカウントのテキストファイルを拡張子JCECでメーザーオブジェクトにロードし、スプライシングイベントごとに少なくとも5つの平均読み取りを含めて、カバレッジに基づいて結果をフィルタリングします。rMATSの結果を視覚化するには、まずメーザーパッケージからtopEvents関数を実行し、10%の誤検出率と最小10%のスプライス率またはPSIの変化で重要なスプライシングイベントを選択します。目的の個々の遺伝子の遺伝子イベントを確認し、その遺伝子の各スプライシングイベントのPSI値をプロットします。イベントタイプを指定して火山プロットを生成します。rMATSで取得したスプライシングイベントの結果をテキストファイルの形式で使用して、rmats2s刺身プロットパッケージを使用して刺身プロットを生成します。刺身プロットは、Wnk1遺伝子のスキップされたエクソンイベントを示しています。各行は、RNA-seqサンプル、野生型の3回の反復およびMbnl1ノックアウトを表す。高さはRPKMでの読み取りカバレッジを示し、接続アークはエクソン間のジャンクション読み取りを示します。下部は、アノテーションされた遺伝子モデル代替アイソフォームを示す。実質的なフォールド変化と真の違いの強力な統計的証拠は、diffSpliceとDEXSeqを使用して得られた火山プロットの左上または右象限に位置する遺伝子で観察できます。カセットエクソンは、遺伝子Wnk1について異なる条件間で変化することが見出された。差動エクソン使用プロットは、Wnk1.6.45近くの5つのエクソン部位で差動スプライシングの証拠を示し、ピンク色で強調表示されたエクソンは、野生型と比較してMbnl1ノックアウトサンプルでスプライスアウトされる可能性が高い。交互にスプライスされた遺伝子の火山プロットは、野生型から除外された遺伝子と野生型に含まれる遺伝子を区別するのに役立ちました。スプライシングイベントSE、A5SS、A3SS、MXE、およびRIのタイプを、これらのイベントの上位有意遺伝子の刺身プロットを使用して視覚化しました。遺伝子の3つの主要な非翻訳領域における差APA活性は、火山プロットを使用して観察されました。異なるパイプラインから得られた有意差PAサイト使用結果は、イベントプロットを使用して視覚化されました。ダブルノックアウトにおけるPA部位使用の有意な遠位から近位へのシフトは、遺伝子FOSL1とPapolaの両方で観察できます。ゲノムワイドレベルで既知のPA切断部位に固定された隣接領域の平均カバレッジは、診断プロットを使用して決定されました。トランスピーシフィック情報などのパラメーターや、複数のオーバーラップを許可するパラメーターが、カウント メトリックを生成するときに正しく使用されていることを確認します。線形モデルのフィッティングとコントラストペアの生成は、適切な比較のために重要です。rMATS の場合は、コマンドを実行する前に、すべてのデータパラメーターがデータに従って正しく設定されていることを確認してください。差次的スプライシング活性から得られた遺伝子は、遺伝子セット濃縮解析を行うために使用することができる。MISOと呼ばれる別のツールは、さらなるイベントベースの分析に使用できます。

identification-alternative-splicing-polyadenylation-rna-seq

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

選択的スプライシング制御は、さまざまな生理学的および病理学的プロセスにおける必須の細胞プログラムである上皮間葉転換(EMT)に寄与することが示されています。ここでは、EMT中の選択的スプライシングの検出に誘導性EMTモデルを利用する方法について説明します。...

上皮間葉転移の間の選択的スプライシングの検出

RNAシークエンシングおよびバイオインフォマティクス解析は、マウスEMLcellsのリン、CD34 +およびリン-CD34-亜集団において有意にかつ差次的に発現する転写因子を同定した。これらの転写因子は、自己再生リン-CD34 +を、部分的に分化したリン-CD34-細胞との間の切り替えを決定する際に重要な役割を果たしている可能性がある。...

RNAシーケンシング解析によりEML造血前駆細胞における自己再生および分化を調節する重要な要因の同定

ここでは、固形腫瘍および血液悪性腫瘍における薬剤耐性に異常なスプライシングの影響を調査することを目的とプロトコルについて説明します。この目標のために、我々は、RNA-seqのを介してin vitroモデルにおける親及び抵抗性のトランスクリプトームプロフィールを分析し、候補遺伝子を検証するための定量RT-PCRベースの方法を確立しました。...

に薬剤耐性に関連する新規スプライス変異体を検出するために、RNA配列決定を使用して、<em&gt;インビトロ</em&gt;がんモデル

このレポートは、具体的には、哺乳動物細胞において標的遺伝子のスプライシングを調節する新規な人工スプライシング因子（ASFS）を設計および構築する生物工学の方法を記載しています。この方法はさらに、RNA代謝の他の側面を操作するための様々な人工的な要因を設計するために拡張することができます。...

具体的にはヒト細胞における選択的スプライシングを操作するために工学人工要因

このプロトコルでは、マッピング mRNA 3'...

3' 末端配列 A seq2 とライブラリの準備

その場で交配 (っぽい) プロトコル マウス脳セクションの代替の Pre-mrna スプライシング パターンを検出する短いアンチセンス...

代替の Pre-mrna スプライシング RNA In Situハイブリダイゼーション法によるマウス脳のセクションでの定量的解析

このプロトコルは、化学療法治療後の代替スプライシング調節において特徴のない機能を有するタンパク質の役割を評価するための迅速かつ有用なツールを提示する。...

E1Aミニジーンツールを使用したmRNAスプライシング変更の研究

このプロトコルは、スプライシングに対する5'-スプライス部位変異の影響をモニターするためのミニジーンレポーターアッセイを記述し、変異誘発スプライシング阻害のレスキューのためのサプレッサーU1 snRNAを開発する。レポーターおよびサプレッサーU1...

スプライシング効率を監視するためのレポーターベースの細胞アッセイ

ここでは、出芽酵母でのタンパク質複合体を識別するための新しい定量的プロテオミクスの手法を説明します。本研究では、我々は、高い特異性でERタンパク質、Scs2pの結合パートナーを同定するためにタンデム質量分析が続くアフィニティー精製と一緒にSILACメソッドを使用している。...

S. cerevisiaeの定量的プロテオミクスとタンパク質の複合体の同定

ここでは、単純な、非侵襲的なコレクションと膣の塗抹標本の細胞学的評価によるマウス生殖（発情前期、発情期、発情後期、もしくは発情間期）の段階を識別する方法について説明します。我々はさらに膣細胞診は、ネズミ生殖サイクルを通じての移行の基礎となるホルモンの循環レベルを反映する方法を説明します。...

膣洗浄、クリスタルバイオレット染色、およびマウス発情周期ステージング識別のための膣細胞学的評価を行う

学ぶRNA-seqデータにおける選択的スプライシングとポリアデニル化の同定法。limma、edgeR、rMATSを用いたエクソンベースとイベントベースの解析手法で、転写産物多様性と遺伝子発現制御を理解する。

RNA-seqデータにおける選択的スプライシングおよびポリアデニル化の同定(英語)

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