Name: ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-14T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぶ 網膜色素上皮細胞移植法をヒト以外の霊長類モデルで。OCTガイド下のブレブ形成とペルフルオロカーボン液体を用いて黄斑外傷を最小化し、変性網膜疾患治療の安全性を向上させる革新的な手術技術です。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

この研究は、IAF-PP(HMBSドメイン)(ORBID):OculaRビオマテリアルとデバイス、A*STAR、 シンガポール(H17/01/a0/013)、NUSスタートアップ助成金NUHSRO/2016/100/SU/01、NUHS臨床科学者プログラム(NCSP)補助金および国立研究財団競争研究プログラム、シンガポール(NRF-CRP21-2018-0008)からX.S.、レオン・ホング・エントワッド・ファンド・ファンドからG.B.へトランスレーショナル前臨床モデルプラットフォーム(シンガポール眼科研究所、シンガポール)の獣医チームが、NHP手術準備と動物のフォローアップを支援することを認めたい。C.ツァイス・メディテック・シンガポールのジル・テオ氏らの皆様に対し、OPMI-Lumera 700(統合型術中OCT装置)の技術サポートに感謝申し上げます。

ボリス・スタンツェルは、この研究で使用される機器(RPEスクレーパー)に関する米国特許9980851を保有しています。C・ツァイス・メディテックとグーダーからボリス・スタンゼルまで講演者の名誉。他の著者は、宣言する利益相反はありません。

半角RPE移植、RPE懸濁液の注射、単層RPE移植片移植の2つの主要なアプローチが評価されている。2つの方法の詳細な比較は、この原稿の範囲を超えています。しかし、単層RPE移植片の移植は、RPE細胞が懸濁液よりも単層に組織化されるように有利であり得る。移植片内のRPE細胞は、生理学的RPE細胞層の組織に似たコンフルエント単層に組織され、移植されたRPE細胞が生理機能を実行することを可能にする。これにより、規制作業や産業規模に非常に関連するセルサスペンションと比較して、より正確なドージングパラメータが可能になります。
RPEパッチ移植片を皮下腔に送り込むには、黄斑の慎重な操作と、皮下腔内への移植片の正確な挿入が必要です。miOCTなどのマイクロサージャリーの技術進歩と、術中の眼内の眼圧組織力学の理解が向上し、この手順の学習曲線が低下しました。この議論では、以下の側面の根拠について説明する: i) 術前プラスミノーゲン注射;ii) 術中miOCTの使用;iii)カスタム41Gデュアルボアカニューレ、低IOP設定、および下レチナルブレブ作成のためのPFCLの使用。iv) 移植前のネイティブ RPE 細胞層の掻き取り;v)シロリムス、トリアムシノロン、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンを使用して、免疫原性移植片拒絶反応を低減する。
術前プラスミノーゲン注射は、パラフォベアルの陰性癒着を放出する 最初の実験では、単一の流体波で窩を取り外すのが難しかった。miOCTによる評価では、画像は、陰部外傷の証拠と共にネイティブRPEへのパラフォベアル外陰性癒着の存在を明らかにした。これらの癒着は、眼下の流体波が眼窩の輪郭全体に広がり、その結果、頭頂部の外傷を引き起こし、ブレブの垂直膨張をもたらした可能性がある。プラスミノーゲンは、フィブロネクチンおよびラミニンを標的とするプロテアーゼであるプラスミンの不活性前駆体である。Ocriplasminは、付随する黄斑穴の有無にかかわらず、症候性ビトレオマクラー牽引の治療のために食品医薬品局(FDA)および欧州医薬品庁(EMA)によって承認されたヒトプラスミンのバイオエンジニアリングされた変異体です。しかし、オリプラスミン注射後の膀胱状黄斑浮腫の後の報告は、retina23に対する酵素のより広範な効果を示唆している。
正確なメカニズムは特定されていないが、プラスミンは光受容体-RPE付着を担う光受容体間マトリックス要素の分解を通じて、レチナリシーア接着を弱めることができることが示唆された。このプロトコルでは、NHP眼は、手術の1週間前に、パラフォベの外側の陰部癒着を放出するビ硝細胞内プラスミノーゲンで治療された。感光体-RPEの接着力が弱まっているという仮定の下で、通常は網膜下流体波20に抵抗する遠位パラフォブリングを含む神経感覚網膜を剥離するために低い力が必要である。したがって、網膜ブレブ剥離中に投与される力は、網膜をタンタンジェントに伸ばすのではなく、網膜輪郭を横切ってブレブの膨張をもたらす。これは、頭葉の涙のリスクを軽減します。しかし、このプロトコルでは、長期移植片生存に対するプラスミノーゲンの効果は検討されなかったことに留意すべきである。今後の研究では、この効果を決定しようとする必要があります。
miOCTは、下レチン小出血の作成、移植片の移植、および副レチン流体の排水を導くために解剖学的フィードバックを提供します 手術中、黄斑の外傷性操作は、良好な移植結果を達成するための鍵です。しかし、操作に関連する黄斑の微細構造変化は、常に操作顕微鏡で明らかであるとは限らない。このような手順では、miOCTは、黄斑構造のリアルタイム、3次元、術中フィードバックを提供する重要なツールです。miOCTは、特に、流体空気交換を使用した下流液の下流液の離脱、移植片、および排出のステップ中に有用である。眼窩剥離中、miOCTは、ブリードの垂直および水平寸法を決定することができます。手術用顕微鏡上では明確に可視化されない可能性のある窩胞マイクロティテは、miOCT(図3)によって確認することができる。移植片移植中、miOCT画像は、移植片の位置または窩への近接性を、しばしば透明でない剥離網膜を通して示すことによって導く。miOCTはまた、困難な移植プロセス25の間に、レチナル接着の可能な領域を強調することができます。最後に、下レチン流体の排水プロセスでは、miOCTは完全なレティナルRPE移植片接触が達成されるまで確実に下レチン液の排水を導くことができます。
二重ボアカニューレ、低IOP設定、PFCL硝地タンポナードの相乗的な組み合わせは、皮下出血の発生時に黄斑外傷を相乗的に減少させる 正接網膜ストレッチと流体乱流は、望ましくない窩の涙につながる前頭剥離のための網膜下BSS注入中に起こり得る。これらの現象を打ち消すために、注入が開始される窩の中心からの相対位置と距離、注入量と速度、ビトレウスタンポネード、副レチナル計装の選択、IOPなどの要因はすべて関連することが示されている20,26,27。眼窩剥離のための副網膜のブレブは、網膜ストレッチがブレブ開始部位27で最も高い可能性があるため、窩から十分に離れた場所に位置するべきである。IOPはまた、副レチナルブレブの作成を通じて低く保たれるべきである。眼のIOPが高いと、眼の輪郭に沿って膨張するのではなく、ブレブサイズの垂直増加が高くなるのに対し、低圧20ではブレブが浅い。さらに、50 μLのビトリアルインジェクションは、NHPの目の長さが短いことを考えると、ヒト28ではIOPを効果的に2倍にしますが、受け目の下注射時のIOP上昇は、おそらくヒトよりも高く、より速くなります。ほとんどのvit>tmymyはIOP変動に応じて調整されますが、調整は同時ではなく、副レチナル注入が進むにつれて起こる反応性プロセスです。したがって、IOPが高いほど、眼の伸び過ぎおよび結果として生じる窩の外傷のリスクが高くなります。したがって、低レチナル注射中は安定的に低いIOPを維持することが不可欠である。
市販の20/41 G(DORC)またはカスタムメイドの25/41 Gデュアルボア下トレティナルカニューレは、皮下注射に推奨されます。カニューレは、流体が下レチン空間に注入されたBSSと引き換えに硝硝体空洞を出ることを可能にする。これにより、副レチナル注射中のIOPの「同時」調節が保証されます。二重ボアカニューレの模式図を図2に示します。最後に、PFCLは、20,26,27の下流涙のリスクを低減するために利用される。例えば、八方のようなPFCは比重が高いため、卵胞剥離29中に網膜に下方力を発揮する。これにより、さらに、眼窩剥離ブレブ作成プロセスを安定化させ、網膜輪郭に沿ったブレブの拡張を強化します。この技術は、nAMD30による巨大な眼下出血の設定におけるrtPAの皮下注射にうまく使用されている。
ネイティブRPEの移植前除去により、RPE-感光体複合体の修復が可能 移植移植前に宿主RPEを除去する必要があります。これはRPE-光受容体複合体の修復がRPE移植を可能にして、感光体21を支持するその生理機能を果たす必要があるためである。ホスト RPE は、除去されない場合、機械的バリアとしてポーズをとることがあり、この複合体の復元を防ぐことができます。RPE毒性化学物質の投与または物理的な除去手段を使用して除去することができます。化学的除去方法としては、ヨウ素date31,32ナトリウムの全身投与または副レチナル投与が挙げられる。ヨウ素酸ナトリウムは、投与時に光受容体、RPE細胞、および絨毛キャピラリの広範な変性を引き起こすので、その無菌および全身毒性は、ヒト試験への使用を妨げる32,33。したがって、物理的な術中の技術が好ましい。様々な物理メソッドが概念化されています。物理的な方法を利用する場合、ブルッフの膜が損傷を受けていないことが重要です。多くのインビトロ研究は、無傷のブルッフの膜34,35,36にRPE移植片生存の依存性を実証している。
水圧デブリドメントでの試みは、ブルッフの膜の破断、エピレチナル膜の発達率の増加、および増殖性硝子体網膜症に関連し、牽引性網膜剥離37をもたらした。RPEデブリドメントのために提案されたダイヤモンドをまぶしたへらも、ブルッフの膜の破断をもたらし、その結果、脈絡膜から下レチナル空間38への細胞増殖が生じた。興味深いことに、カスタムメイドの拡張可能なループ楽器は、ウサギと豚の目にブルッフの膜を保存して上にあるRPEを取り除くことができました11,39。基礎 RPE の除去は、AMD の高度な萎縮形態と同様に、RPE および外側網膜萎縮を有する動物モデルを確立するのにも有用である。RPEの焦点領域が黄斑から取り除かれると、残りのRPE細胞の肥大を介してRPE創傷が閉じる。しかし、この創傷治癒応答は、核層40の外核の萎縮と関連している。動物モデルの作成はこの原稿の範囲を超えていますが、同様の手順は、RPE由来細胞治療薬のテストのための高度な萎縮性AMD表現型の動物モデルを作成することができます。
シロリムス、トリアムシノロン、ドキシサイクリン、ミノサイクリンを使用して免疫原性移植片拒絶反応を軽減 皮下腔は免疫特権部位であると考えられ、無傷の血液副腎バリアおよび他の要因41によって維持される。無傷の血液-レチナルバリアを有する幹細胞誘導体の皮下移植を含む多くの研究において、免疫抑制薬は、移植片survival42において無視できる役割を果たす。外側の血液-retinalバリアは、ネイティブRPE層とRPE細胞間の緊密な接合によって形成されると考えられている。ネイティブRPE除去は、移植されたRPEと宿主感光受容体のより良い統合を可能にするが、血液-腎障害は、免疫拒絶反応の可能性を増加させる、プロセス中に破壊される。古典的には、T細胞は腎臓およびliver43のような他の器官の移植拒絶反応のプロセスの中心である。したがって、レチン組織移植のための初期免疫抑制レジメンは、これらの適応免疫応答を低減することを目的としていた。
シロリムスは、ラパマイシン阻害剤の機械化標的であり、カルシニューリン阻害剤であるタクロリムスは、適応免疫応答を標的とする免疫抑制薬の例である。しかし、十分なT細胞抑制にもかかわらず、移植片生存率は低いままである。また、RPE細胞は、阻害因子の放出を通じてT細胞活性化を抑制し、制御性T細胞44の生成を促進することが知られている。したがって、適応免疫が移植片拒絶反応42の唯一の寄与者ではない可能性があることがますます明らかになっている。細胞製品の副レチナル移植は、microglia45の蓄積および活性化をもたらす可能性がある。
ミクログリアは、レチナのマクロファージです。それらは2つの主な集団から成っている:1)内口脈管系の血管内微小グリアと2)、内の組織のパレンチマ内のミクログリア。ミクログリアは、自然免疫応答の一部であるように、トリアムシノロンなどのビトリアルグルココルチコイドは、サイトカイン媒介増殖を抑制することができる46。ドキシサイクリンおよびミノサイクリンはまた、微小グリア活性化を抑制することができ、考慮されるべきである47,48。最後に、RPE同種移植片と異種移植片の免疫拒絶反応の違いは不完全に理解される49。例えば、誘導多能性幹細胞由来RPE細胞に対する同種抗体は、生体内免疫拒絶モデルの血清中に報告されている。しかしながら、これらの抗体の役割と移植片生存における抗体媒介性拒絶反応の重要性は不明である50。そこで、自然免疫抑制のための適応免疫の抑制とトリアムシノロン、ドキシサイクリン、およびミノサイクリンの組み合わせに対してシロリムスを利用した多剤レジメンが提案されている。このレジメンは、良好な移植片生存結果と最小限の全身効果を有するウサギで正常に使用されています11.
この外科技術の限界 本論文は、NHPの下皮腔内にRPE移植シートを送達する可能な外科的方法を説明する。ただし、これは最適化された唯一の方法であるとは限りません。異なるビトレオ-レチン外科医は、計器と技術のための他の好みを持つことができます。例えば、この移植装置の設計は堅い細胞キャリアで支えられる平らなインプラントしか提供できないので、比較的柔軟な(または圧延された)インプラントには適さないかもしれない。RPE懸濁液移植は、この技術の多くを省略することができます。したがって、外科的詳細は、各配信戦略に基づいて修正する必要があります。
変性性レチンタル疾患の治療に対する細胞治療への関心が高まり続ける中、NHP動物モデルはRPE移植片の生存に影響を与える因子を研究するための前臨床試験に不可欠です。本稿では、NHP眼での単層下層RPE移植片の円滑な送達を可能にする戦略が提案されている。術中合併症のより良い視覚化のための方法も推奨されます。細胞治療薬の使用が拡大するにつれて、これらの方法は改善し続けると予想されます。今後の方法論文は、移植片の様々な構造的および機能的側面を評価するための包括的な調査リストを提案することも検討すべきである。

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.
The Authors section was updated from:
Ivan Seah*1, Zengping Liu*2,3,4, Daniel Soo Lin Wong3, Wendy Wong1, Graham E. Holder1,3,5, Veluchamy Amutha Barathi3,4,6, Gopal Lingam1,3,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
2Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR), 
3Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally
to:
Ivan Seah*1,2, Zengping Liu*1,3,4, Daniel Soo Lin Wong1, Wendy Wong2, Graham E. Holder1,2,5, Veluchamy Amutha Barathi1,4,6, Gopal Lingam1,2,4, Xinyi Su1,2,3,4, Boris V. Stanzel1,7,8 
1Department of Ophthalmology, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore 
2Department of Ophthalmology, National University Hospital, Singapore, 
3Institute of Molecular and Cell Biology (IMCB), Agency for Science, Technology and Research (A*STAR) 
4Singapore Eye Research Institute (SERI), 
5UCL Institute of Ophthalmology, 
6Academic Clinical Program in Ophthalmology, Duke-NUS Medical School, 
7Macula Center Saar, Eye Clinic Sulzbach, Knappschaft Hospital Saar, 
8Department of Ophthalmology, University of Bonn 
* These authors contributed equally

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62638">Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

RPE移植は、遺伝性および取得したレチナル変性疾患の治療に大きな約束を果たす。これらの状態は、網膜色素変性症(RP、ロッドコーンジストロフィー)およびGAのようなAMDの高度な形態を含むが、これらの障害は、世界的に現在治療不可能な失明の有意な割合を表す1,2。AMDの高度な段階は、新血管AMD(nAMD)およびGAに分類される。抗血管内皮増殖因子(抗VEGF)注射などのnAMDには有効な治療選択肢があるが、GA患者は治療選択肢が限られている。RPは、進行性のレチン性光受容体変性を特徴とする遺伝性のレチン性疾患の非常に不均一なグループである。一部の患者では、原因となる遺伝的欠陥は、光受容体ではなくRPE内に位置しています。したがって、RPE補充療法は、遺伝子治療が実現不可能な場合の代替戦略である可能性があります。
これらの条件に対する効果的な治療法の開発には大きな関心があります。特に、RPE移植は、治療アプローチの可能性3,4,5,6,7,8として牽引力を得ています。RPE移植に関する最初の報告が1980s9に登場して以来、この分野は様々なRPE細胞源、送達戦略、および疾患および移植の実験モデル10、11、12、13、14を含むように拡大しました。様々な動物モデルの中で、NHPだけが人間と共有するレチナの後極で解剖学的専門である「窩中枢」を持つ「黄斑ルテア」を持っています。この窩は、高解像中心視器15を可能にする非常に高密度の錐体光受容体を含む。NHPはまた、人間と比較して同様のゲノムおよびプロテオミクスメイクアップ16を有する。これらの類似性は、ヒトretina17,18に影響を与える眼疾患の研究のための重要かつ適切な動物モデルにします。
本稿は、免疫抑制されたNHPにおけるPET細胞担体によって支持されるRPE異種移植片の下角移植法を記載する。ウサギにおける腎皮下RPE移植のための経ビトリアルな技術が、前の原稿19に記載されている。しかし、NHPでは、病巣の存在は、術中操作20中に特定のケアを必要とする。特に、retina20に過剰な力を発生させる亜レチン流体注入法の場合、頭葉涙のリスクが高い。したがって、この原稿の焦点は、NHPにおける不注意な頭気の外傷のリスクを減らすための戦略です。
これらには、卵胞解剖学のリアルタイム可視化のためのパラFOVE膜接着および手術用顕微鏡統合光学コヒーレンス断層撮影(miOCT)の放出のための術前体内プラスミノーゲン注射の使用が含まれる。低いIOP設定の下で眼内PFCLタンポネードを用いるカスタムメイドの25/41 Gデュアルボア網膜カニューレは、より制御された眼窩剥離のプロセスを可能にするために提案される。さらに、移植されたRPE細胞と宿主感光体との間のより良い統合を可能にするために、移植前にネイティブRPEの外科的除去が推奨される。最後に、NHPモデルの周回および術後の全身免疫抑制プロトコルが、RPE異種移植後の生存率を向上させると記載されている11,21。

<table><tbody><tr><td>1% ミドリアシル (トロピカミド 1.0%) 滅菌眼科用製剤</td><td>アルコン</td><td>SIN 4715P</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>10% 中性緩衝ホルマリン</td><td>ライカ</td><td>3800598</td><td>組織学的処置</td></tr><tr><td>2.5% ミドフリン (塩酸フェニレフリン) 眼科用溶液</td><td>アルコン</td><td>No. 01785</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>25 G AWH ビビッド シャンデリア</td><td>シナジェティクス</td><td>56.54.25P</td><td>手術</td></tr><tr><td>25 Gaバイブレードガラス質カッター複合広視野ステラリスエリートパック</td><td>バウシュ&Lomb</td><td>SE5525WVB</td><td>Surgical procedure</td></tr><tr><td>AMO ENDOSOL 眼科灌漑用バランス塩溶液</td><td>Abbott Medical Optics</td><td>15020</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>アポミノサイクリン</td><td>Apotex Inc</td><td>2084104</td><td>免疫抑制</td></tr><tr><td>AUROVISC - ヒプロメロース点眼液 USP 2% w/v</td><td>Aurolab</td><td>TN 00002387</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>オートクレーブ MELAG, Vacuklav</td><td>MELAG</td><td>1131-B2300</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>オートステイナーXL (ST5010)</td><td>ライカ</td><td>2433</td><td>組織学の手順</td></tr><tr><td>バランス生理食塩水</td><td>ビーバービジテック</td><td>581732</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>コットンバッド</td><td>WINNER MEDICAL</td><td>1NA6-100</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>診断 エスピオンE3コンソール</td><td>診断</td><td>272</td><td>眼科イメージング</td></tr><tr><td>ドキシサイクリン</td><td>ユン・シン</td><td>MAL 19950403AEZ</td><td>免疫抑制</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>メルク ミリポア</td><td>1.15935.0100</td><td>組織学的処置</td></tr><tr><td>ERG-Jet コンタクトレンズ電極</td><td>Fabrinal</td><td>F-06</td><td>眼科イメージング</td></tr><tr><td>拡張可能なポリチップカニューレ 25 G/38 G</td><td>MedOne</td><td>3247</td><td>外科的処置</td></tr><tr><td>FlexTip ブラシ (25 g) 1.5 mm</td><td>MedOne</td><td>3222</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>フルオレセイン 10% Faure</td><td>Curatis AG</td><td></td><td>5030376 Ophthamic イメージング</td></tr><tr><td>ガーゼ スワブ</td><td>WINNER MEDICAL</td><td>1NP3275</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>ハミルトン ガス タイト シリンジ 250 & マイクロ;L</td><td>、ハミルトン</td><td>、81101</td><td>、外科手術</td></tr><tr><td>、ハイデルベルク、Spectralis HRA + OCTコンピューターシステム</td><td>、ハイデルベルクエンジニアリング</td><td>、NA</td><td>眼科イメージング</td></tr><tr><td>ヘマトキシリン ギル II</td><td>メルク ミリポア</td><td>3801520</td><td>組織学の手順</td></tr><tr><td>倒立顕微鏡の日食 Ti-E 本体 (100-240V)</td><td>ニコン</td><td>33131</td><td>組織学の手順</td></tr><tr><td>ケタミン注射</td><td>Ceva</td><td>37711/58317</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>炭酸リチウム</td><td>メルク ミリポア</td><td>1.05680.0250</td><td>組織学の手順</td></tr><tr><td>モンキー プラスミノーゲン</td><td>モレキュラーイノベーション</td><td>SKU-CYPLG</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>非接触広角128度眼底レンズ</td><td>C.ツァイス Medtech</td><td>Resight 700</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>不織布眼科用ドレープ</td><td>アルコン</td><td>8065103120</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>眼科用角膜/強膜 V-ランスナイフ 20G</td><td>アルコン</td><td>8065912001</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>パラフィン埋め込みステーション</td><td>ライカ</td><td>EG1150 H</td><td>組織学の手順</td></tr><tr><td>パラプラスト 高溶融パラフィン</td><td>ライカ</td><td>39601095</td><td>組織学の手順</td></tr><tr><td>フロキシン B</td><td>メルク ミリポア</td><td>1.15935.0025</td><td>組織学の手順</td></tr><tr><td>プレパウダー サージカル グローブ</td><td>MAXITEX</td><td>85-173-2/85-173-3/85-173-4</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>プロディン ポビドン-ヨウ素溶液 BP</td><td>ICM PHARMA</td><td>PMLBLP20-01</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>Righton スリットランプ Model MW50D (RAA133CB)</td><td>Righton-Oph</td><td>5200162</td><td>眼科イメージング</td></tr><tr><td>ロータリーミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2255</td><td>組織学的処置</td></tr><tr><td>サフィル ポリグリコール酸、編組、コーティング、吸収性外科用縫合糸 7/0</td><td>B.ブラウン</td><td>G1048711</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>シンコート I.M. インジェクト トリアムシノロン アセトニド 40 mg/mL</td><td>Yung Shin</td><td>SHI40 SGP-2610015-001</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>使い捨て皮下注射針 21 G</td><td>B.Braun</td><td>4657527</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>使い捨て皮下注射針 23 G</td><td>B.Braun</td><td>4657667</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>シロリムス</td><td>ファイザー</td><td>SIN12034P</td><td>免疫抑制</td></tr><tr><td>ステンレス鋼皮下針電極</td><td>OcuScience</td><td>F-E2</td><td>オフタミックイメージング</td></tr><tr><td>ステラリスエリート 視力増強システム</td><td>バウシュ &Lomb</td><td>BL15455</td><td>Surgical procedure</td></tr><tr><td>Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 27 G 12 mm</td><td>B.Braun</td><td>4665406</td><td>Surgical procedure</td></tr><tr><td>Sterican Single Use Insulin Needles Long Bevel 30 G 12 mm</td><td>B.Braun</td><td>4656300</td><td>Surgical</td></tr><tr><td>Procedures Surgical Gown + 2 Hand Towels</td><td>STERIL</td><td>APP10 00 01</td><td>Surgical Procedure</td></tr><tr><td>Tegaderm Film</td><td>3M</td><td>1626W</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>テルモ シリンジ 1 cc/mL 針付きルアースリップチップ 26G</td><td>テルマ</td><td>SS-01S</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>テルモ シリンジ 3 cc/mL ルアーロックチップ</td><td>テルマ</td><td>SS-03L</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>テルモ シリンジ 5cc/mL ルアーロックチップ</td><td>テルマ</td><td>SS-05L</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>トブラデックス(トブラマイシン、デキサメタゾン) 滅菌眼科軟膏</td><td>アルコン</td><td>No. 01577</td><td>外科手術</td></tr><tr><td>トプコン 網膜カメラ TRC-50DX</td><td>トプコン</td><td>948605</td><td>オフタミックイメージング</td></tr><tr><td>ビディシックゲル</td><td>バウシュ &Lomb</td><td>GB41789155517</td><td>Surgical procedure</td></tr><tr><td>Xylazil-20</td><td>Ilium</td><td>38653/50276</td><td>Surgical procedure</td></tr><tr><td>Zeiss Opmi Rescan 700</td><td>Carl Zeiss Meditec AG</td><td>7210</td><td>Surgical procedure</td></tr></tbody></table>

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

Retinal Pigment Epithelium Transplantation in a Non-human Primate Model for Degenerative Retinal Diseases

網膜色素上皮(RPE)移植は、遺伝性および取得した網膜変性疾患の治療に大きな約束を果たす。これらの条件には、網膜色素変性症(RP)および地理的萎縮(GA)などの加齢黄斑変性症(AMD)の高度な形態が含まれる。一緒に、これらの障害は、世界的に現在治療不可能な失明のかなりの割合を表しています。これらの満たされていない医療ニーズは、RPE交換の方法を開発する上で学術的関心を高めています。治療の前臨床試験のために一般的に利用される動物モデルの中で、非ヒト霊長類(NHP)は黄斑を有する唯一の動物モデルである。この解剖学的類似性を人間の目と共有するので、NHPアイはRPE細胞療法などの高度な治療薬用製品(ATMPs)の開発のための重要かつ適切な前臨床動物モデルです。
本稿は、ポリエチレンテレフタレート(PET)細胞担体上で培養された、免疫抑制されたNHPで外科的に作成されたRPE創傷に対する、単層RPEの過角移植法を説明する。黄斑の中央血管部分の窩は、移植中の機械的弱さの部位である。最初の皮下液注入が、レティナに過剰な力を発生させると、前頭外傷が起こる。したがって、過フルオロカーボン液体(PFCL)の下での遅い注入は、低眼圧(IOP)設定で二重ボアの亜レチナル注入カニューレで、レチナルブレブを作成することが推奨される。 
パラフォベアルRPE-光受容体癒着を放出するビトリアルプラスミノーゲン注射による前処理も推奨される。これらの組み合わせ戦略は、従来の技術と比較して、頭葉涙の可能性を減らすことができます。NHPはRPE細胞療法の前臨床段階の主要な動物モデルである。このプロトコルは、NHPの眼でのRPE細胞療法の提供に関連する技術的な課題に対処します。

マルチモーダルイメージングモダリティ(眼管写真、眼管自己蛍光イメージング(FAF)、眼管蛍光血管造影(FFA)初期および後期、および光コヘレンス断層撮影(OCT))は、正常な眼下RPE移植移植の特徴を強調しています(図1)。眼深膜写真は、時間の経過とともに移動することなく、窩におけるRPE移植移植の位置を示す。FAFイメージングは、RPE移植片と重なり合う超自己蛍光(白、高輝度領域によって示される)の最小限の変化を示す。初期および後期のFFAはRPEの接木を取り囲む明白な漏出(時間とともに拡大する白い、高輝度の領域によって示される)を示さない。3日目の初期画像は、移植移植前のネイティブRPEの除去による窓の欠陥を示す。黄斑OCT画像は、時間が経過するにつれてRPE移植片上の外側のレチナル層(特に、感光体層)の保存を示す。ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、マイクロステアの証拠のない無傷の残膜層を示す。移植片の周囲の上の核層の保存は、RPE細胞が感光体の健康を維持する生理機能を果たしていることを示唆している。
25/41 Gデュアルボアカニューレの眼内および外部図は、眼下注射中にIOPが制御されるメカニズムを強調しています(図2)。BSSは、中央長いカニューレを介して副レチンス液注入中に、皮下空間に入る。眼圧の有意な増加は、硝子体腔内のBSSがカニューレのより大きな金属ボアを介して眼を出る原因となる。その後、BSSはカニューレに沿って移動し、最終的にカニューレハブ近くの出口ポートから排出されます。カニューレが期待どおりに動作しているかどうかを評価するには、カニューレ ハブの近くの出力ポートから流体が流れるようにします。
miOCTは、卵胞剥離中に出血寸法と潜在的な卵胞涙を作動不能に可視化することを可能にする(図3)。図3A1-A3は、眼窩裂を有するブレブの場合を強調する。図3A1では、下のブレブが手術用顕微鏡下で見える一方で、涙の視覚化が困難である。図3A2は、涙のないブレブの縦断面を示す。図3A3は、ブレブの垂直断面を評価する場合の下頭涙を示す。図3B1-B3は、涙が出ることなく正常に作成されたブレを示しています。
ERG波形の著しい劣化の欠如は、ロッドと錐錐体の両方の光受容体のグローバル機能が、レチナル下RPE異種移植片で維持されることを示唆している(図4)。ERG波形は、retinaの全体的な機能を示しています。特に、光受容体機能の損失を判断するためにA波に注意を払う必要があります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig01.jpg"> 図1:マルチモーダルイメージングによる術後 インビボ 解析 (A) 左眼下RPE移植移植(眼底写真の黄色)の 生体内 画像化(左から右の列:眼底写真、自己蛍光、眼管蛍光血管造影初期段階、眼管フルオレセイン血管造影後期、眼球透視後期、光コメレンストモグラフィー)月1、3)。眼科写真のアスタリスクは、眼科の部位を示す;白い破線の矢印は、ラインスキャンの方向を示します。眼深部の自己蛍光イメージング上の黄色の描かれた形状は、移植の位置を強調する。OCT 画像上の白い三角形は、グラフトのそれぞれの横端を示します(色の眼科画像のラインスキャンに従って)。(B)ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、アトロピエント・フォベア下での移植の染色(術中涙による)を標識した層を有する。スケールバー= A (自己蛍光およびFA画像)で1mm、 A (OCT画像)で200μm、 Bで100μm。略語: FA = 眼深血管造影;OCT = 光コヘレンス断層撮影;RGC = 神経節細胞層のレチン状;INL = 内部核層;ONL = 外側核層;RPE = 網膜色素上皮. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig02.jpg"> 図2:25/41Gデュアルボアカニューレの眼内および外部図(A)、25/41Gデュアルボアカニューレの眼内図白い矢印は、副レチンの注射のために長い中央カニューレを指しています。破線の矢印は、BSSが通過して目を出る出口カニューレの開口部を指します。(B) 25/41 Gデュアルボアカニューレの外部図。アスタリスクは、眼内 BSS が排出されるカニューラ ハブ付近の出力ポートを示します。略語: BSS = バランスの取れた塩溶液。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig03.jpg"> 図3:眼窩裂によって複雑化した眼窩下出血の眼窩下像像とmiOCT画像(A1)頭蓋涙を伴うブレブ内の縦方向(青)および横方向(赤)の位置を示す術中顕微鏡画像。(A2)長手方向miOCTスキャンは、窩領域(黄色の矢印)における眼下出血を示す。(A3)横miOCTスキャンは、眼窩裂(白い矢印頭)とレティノトミー(アスタリスクと副レチンジナルブレブ(黄色の矢印)をキャプチャします。(B1)正常に形成されたブレブにおける縦方向(青)および横方向(赤)スキャンの位置を示す術中顕微鏡画像。(B2)長手方向miOCTスキャンは、窩領域(黄色の矢印)における眼下出血を示す。(B3)横断miOCTスキャンは、優れたインタクトフォベア(ホワイトダイヤモンド)を有する正常に作成された副レチン小出血を示すスキャン。略語: miOCT = 顕微鏡統合光学コヘレンス断層撮影<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62638/62638fig04.jpg"> 図4:RPE異種移植眼のERG。 レティナの機能評価では、ベースライン(上段)および移植後3ヶ月(下段)で行われたRPE異種移植眼の全視野ERG評価は、暗く適応または明ずに適応した条件下での応答振幅、タイミング、または波形に対するRPE異種移植の有意な効果を示さない。略称: RPE = 網膜色素上皮;ERG = 電気レジノグラム;DA = 暗く適応;LA = 光適合。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62638/62638fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

非ヒト霊長類(NHP)は、解剖学的および遺伝的類似性によるヒトの細胞疾患治療を研究するための理想的なモデルである。本稿では、NHP眼における網膜色素上皮細胞の脳下移植法と、黄斑操作に伴う術中合併症を予防するための戦略を記載する。

Retinal pigment epithelial (RPE) transplantation holds great promise for the treatment of inherited and acquired retinal degenerative diseases. These ...

網膜色素上皮移植移植時の卵胞外傷は、視力低下の結果をもたらす可能性がある。この提案された方法は、従来の技術と比較して、葉の涙の可能性を低減することができます。提案された方法は、陰部下の癒着の放出、レチン層のより良い視覚化、およびブレブ形成中の接線剪断力を含む、卵胞外傷に寄与する複数の要因に対処する。この技術は、硝子体内プラスミノーゲン前処理、顕微鏡統合OCT誘導性レティナルブレブ形成、およびデュアルボアカニューレを使用したパーフルオロカーボン液体硝子タンポネードを含む、より穏やかな手順で卵胞外傷の可能性を生成する。この手順のデモンストレーションは、劉善平上級研究員と、研究室の研究助手であるダニエル・ソ・リン・ウォン氏です。シニアコンサルタントのゴパル・リンガム教授も手術手順をデモンストレーションします。まず、360度の結膜周囲の結膜を切開するためのVannasはさみを使用し、腹膜を拡大するために鈍い解剖を行います。25ゲージのマイクロビトレオレチナルブレードを使用して、右目の8時または左目の4時に、スクレラで3ミリメートルの切開を行います。7-0のVicryl縫合線を使用して25ゲージのカスタム側ポート注入カニューレと縫合を挿入します。ビトリアル内の位置を確認した後、バランスの取れた塩溶液の注入を開始し、20ミリリットルの水銀の眼圧を維持するようにシステムを設定します。25ゲージのフラットヘッドトロカールを使用して、右目の2時または左目の10時にスクレラを切開します。25ゲージのシャンデリアライトをフラットヘッドトロカーに挿入し、粘着テープで光を固定します。光源を約60%に調整し、10時に右目で別の硬化性を発揮し、図示したように左目に対して2時に別の硬化性を発揮します。結び目を結ぶことなく、強膜の周りにU字型のVicryl 7-0縫合を配置します。強膜切開術を通して、四面体を挿入します。エントリーポートの周りに座間切開術を行い、続いて短いコアの小腸切開術を行い、1分間に最大5,000カット、水銀400ミリメートルで最大吸引します。より良いウイルスの視覚化のためにトリアムシノロンの20〜50マイクロリットルを注入する。網膜から膜炎の体を分離して、後部の膜膜剥離を誘発する。後部の膜子剥離の穏やかな誘導を可能にするために、光ディスクの上にビトレクターを置きます。ビトレクターは、切断を伴うことなく最大400ミリメートルの水銀で吸引でのみ維持します。必要に応じて、25ゲージの眼内鉗子を使用して、剥離を促進するために腹膜皮質を引き裂く。カッターで後舌膜を開き、取り外した膜状のスカートを、膜底まで取り除きます。残りのトリアムシノロンを残り、残りは、残り、残りは、その表面に吸引する。パーフルオロカーボン液を1~2ミリリットル注入し、後極を前部および中周部のレチナまで覆います。眼下注射カニューレで眼を入る。25 x 41ゲージカスタマイズされたデュアルボア副レティナル注射カニューレまたは25 x 38ゲージの副レティナリ注射カニューレを、250マイクロリットルシリンジに接続して、副レチンゲル注射に使用します。眼圧を水銀の0~4ミリメートルに設定します。BSSの網膜下注射を穏やかに行い、局所的な網膜剥離を誘発する。ブレブが窩を横切ったら、BSSを注入するのをやめなさい。別の方向から 2 番目のブレブを作成します。両方のブレブをマージして、フォビアを完全に取り外します。術中光学コテレンス断層撮影機能を有効にして、ブレブ形成を可視化し、ラインスキャンとキューブスキャンが高精細モードであることを確認して、foveaで画像を取得します。垂直25ゲージのビトレオレチナルはさみで1.5ミリメートルに、移植のための副腎腔へのアクセスを可能にする。.眼圧を水銀50ミリメートルに設定します。パーフルオロカーボン液を除去するためにブラシをかけたシリコーンの先端カニューレを使用してください。1.4ミリメートルの切開ナイフを使用して、硬化切開を延長します。20ゲージ拡張可能ループ器械を入力し、掻き取ることによって、眼下宿主網膜色素上皮を取り除く。シューティングデバイスの先端を硬化切開術に挿入し、20ミリメートルの水銀の眼圧で膜内空洞を通過します。ブルックス膜に面した細胞キャリア側と感光移植体が感光体に面したレティノトミーの表面から作られたレティノトミーエッジを介して、インプラントを受け目下腔に注入します。術中の光コテレン断層撮影機能を有効にすることで、インプラントの位置を可視化します。下レチナル注入カニューレまたは25ゲージ湾曲した眼内はさみでインプラント位置を調整して、インプラントが無傷の上にあるレチナリの空間のブルックス膜に平らに置かれていることを確認し、作成されたレチノトミーから遠く離れた位置にあり、レチノトミー部位に影響を与えないようにします。流体空気交換にはブラシをかけたシリコーンチップカニューレを使用し、網膜がインプラントの上に再び取り付けられるまで、ブレブ網膜剥離と網膜切除エッジアポ位置から網膜下液を穏やかに吸引します。次に手術を終了するには、あらかじめ配置された7-0のVicryl縫合糸を使用して、作業用ポート硬化性を閉じます。8時の側膜切開術で、2ミリグラム当たり0.05ミリリットルのビトリアクチノロンを投与する。シャンデリアと注入カニューレを取り外します。Vicryl縫合糸でこれらの強結膜を閉じます。眼内圧が許容範囲内であることを確認するために眼を触診する。必要に応じて、30ゲージ針を介してフィルタされた空気またはBSSを注入します。様々なイメージングモダリティに対する左眼下網膜色素上皮移植移植のインビボイメージングを、最大3ヶ月間実施した。眼窩の写真は、窩で移植された移植片が時間の経過とともに移動しなかったことを示した。眼管の自己蛍光イメージングは、網膜色素上皮移植片と重なり合うハイパーオート蛍光の最小変化を示した。初期および後期の眼科フルオレセイン血管造影は、移植片を取り巻く漏れを示さなかった。黄斑光コテレンス断層撮影画像は、時間が経つにつれて移植片上の外側網膜層の保存を示し、網膜色素上皮細胞の機能性を示唆した。HE染色は、マイクロ涙の証拠のない無傷のレチン層を示した。術中光学コテレン断層撮影は、眼窩剥離中のブレブ寸法および潜在的な窩涙の視覚化を可能にする。涙の存在は、ブレブ形成を妨げる可能性があります。正しいブレの形成の成功は、涙の欠如によって示された。網膜の機能評価のために、網膜色素上皮異種異種眼の全視野電解電解評価を行った。電解波波形の著しい劣化がないことは、異種移植片と共にロッドと錐錐体の両方の機能が維持されたことを示唆している。局所的なレチナルブレブの作成中に、ジェット速度の急激な変化が頭葉の涙につながる可能性がありますので、非常に穏やかにそれを行います。このステップをゆっくりと実行することは、頭外損傷を軽減するための鍵です。眼道の自己蛍光、蛍光血管造影、および光コヘレンス断層撮影、および電気生理学研究を含むマルチモーダルイメージングは、移植片の生存性およびそれに影響を与える因子に関するより大きな洞察を提供することができる。

retinal-pigment-epithelium-transplantation-non-human-primate-model

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

ここでは、ラットとマウスにRPE細胞のボーラスを網膜下注射するためのマルチメディア形式でコミュニティが受け入れたプロトコルを紹介します。このアプローチは、網膜変性の動物モデルに移植された移植されたRPE細胞のレスキューの可能性、安全性プロファイル、および生存能力を決定するために使用できます。...

懸濁液中の網膜色素上皮細胞を送達するげっ歯類における網膜下注射の実行

網膜色素上皮（RPE）の交換戦略と遺伝子ベースの治療は、いくつかの網膜変性条件のために考慮されています。臨床翻訳のために、大きな目の動物モデルは、患者において適用外科技術を研究するために必要とされます。ここでは、汎用性とコスト効率であるRPE移植、に向けた網膜下手術のためのウサギモデルを提示します。...

ウサギにおける網膜下手術のためのステッププロトコルによってステップ

網膜の注射は、加齢黄斑変性症に対する幹細胞補充療法の臨床研究で広く適用されています。この可視化の記事でラットの目に細胞を提供する強膜によるリスクの少ない、再現性と正確に変更された網膜注入手法について述べる。...

強膜網膜移植ひと網膜色素上皮細胞のラットの目の洗練されたプロトコルの開発

網膜色素上皮細胞は乾燥加齢による黄斑変性症の高度なフォームのセル置換療法として役立つことができます。このプロトコルでは、地理的な萎縮の目の大きいモデルと病気のこのモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植の世代について説明します。...

地図状委縮の目の大きいモデルにヒト胚性幹細胞由来網膜色素上皮細胞の網膜下移植

人間の羊膜と動物モデルにおける組織移植のための準備の上に培養したひと多能性幹細胞由来網膜色素上皮細胞から成る網膜組織を設計する手法を提案します。...

ヒト胚性幹細胞に由来する移植適切な網膜色素上皮組織をエンジニア リング

ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の網膜組織を大型動物モデルの網膜下腔に移植する手術手技について紹介する。...

ネコ大型動物モデルにおけるヒト胚性幹細胞由来網膜組織の網膜下移植

ここでは、種々の哺乳動物(マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ)から一次虹彩および網膜色素上皮細胞を単離およびトランスフェクトするプロトコルが提示される。この方法は、ヒトに移管可能なエクスビボ分析およびインビボ研究のための様々なセットアップにおける眼遺伝子治療アプローチを研究するのに理想的である。...

非ウイルス遺伝子治療のための哺乳動物一次色素上皮細胞の単離、培養、遺伝子工学

網膜色素上皮(RPE)の網膜下移植は、変性網膜疾患の治療のための最も有望なアプローチの1つです。しかし、大眼動物モデルでの前臨床試験の実施は依然として困難です。このレポートは、ミニブタへの細胞キャリア上のRPEの網膜下移植のガイドラインを提示します。...

ミニブタのキャリアへのRPEの網膜下移植:術前準備、手術手技、および術後ケアのガイドライン

野生型マカクから得られた網膜外植体を...

マカクザルの有機型網膜外植片培養

このプロトコルは、網膜変性の有無にかかわらず、マウスレシピエントにおいて、外科的合併症の発生率が低い網膜下細胞移植片を安全かつ正確に送達するための経瞳孔ビジョン誘導経強膜アプローチを提示します。...

網膜変性マウスモデルにおける網膜下移植片の経瞳孔ガイド下経強膜移植

我々は、凍結保存後のヒトES細胞由来の光受容体前駆細胞の調製と、 rd10...

rd10マウスにおけるヒト胚性幹細胞由来光受容体前駆細胞の網膜下送達

学ぶ 網膜色素上皮細胞移植法をヒト以外の霊長類モデルで。OCTガイド下のブレブ形成とペルフルオロカーボン液体を用いて黄斑外傷を最小化し、変性網膜疾患治療の安全性を向上させる革新的な手術技術です。

ヒト以外の霊長類モデルにおける変性網膜疾患の網膜色素上皮移植

さらに動画を探す