GCaMP3レポーターによる心臓特異的カルシウムフラックス測定による心臓リプログラミングのインビトロ評価
2022年2月22日
ここでは、Tg(Myh6-cre)1Jmk/J /Gt(ROSA)26Sortm38(CAG-GCaMP3)Hze/J(以下のαMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3)の確立と適用について述べています。マウス株から分離された新生児心臓線維芽細胞(NCF)は、誘導心筋細胞(iCM)に変換され、カルシウム(Ca2+)フラックスを介したiCMのリプログラミング効率と機能的成熟の便利かつ効率的な評価を可能にします。
このプロトコルに記載されている方法は、心臓リプログラミング研究のためのICMの機能的成熟を評価するための貴重なプラットフォームを提供する。カルシウムフラックスは、Iccmで排他的に観察され、ICM機能成熟を評価する方法を提供します。このマウスのひずみは評価手順を簡素化し、結果の再現性を高めます。
このプロトコルは、心臓リプログラミング分野におけるICMの機能成熟を評価する新しい方法です。また、心筋細胞分化および心機能を評価するために適用することができる。1,000万匹の新生児心臓線維芽細胞(NCF)を単離するために8〜10匹の子犬、P0〜P2子犬を得ることによって始まります。
低体温によって子犬を深く麻酔します。蛍光顕微鏡下で心臓を観察し、所望の遺伝子型を持つ心臓がカルシウムフラックスを示すことを確認し、GCaMP3が心臓を鼓動させる。他の遺伝子型は蛍光を示さない。
心臓を分離した後、彼らは緩く接続されているように4つの部分にそれらをカットします。氷冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)を6センチメートルのプレートで数回徹底的に洗い、単離された細胞の血球汚染を制限します。8ミリリットルの暖かい0.25%トリプシン-EDTAを摂氏37度で10分間消化します。
トリプシン上清を捨て、ハンクのバランスのとれた塩溶液に1ミリリットルの暖かいタイプ2コラゲナーゼあたり0.5ミリグラムの5ミリリットルを加えます。混合物を徹底的に渦し、摂氏37度で5分間インキュベートした。インキュベーションの後、再び、混合物を徹底的に渦し、未消化の組織を重力によって落ち着かせる。
冷たい線維芽細胞培地の5ミリリットルで15ミリリットルの円錐状のチューブに上清を集めます。播種密度が1立方センチメートル当たり4番目の細胞の2〜2.5倍になるように、線維芽細胞培地で細胞を希釈します。その後、皿や皿に細胞を播種します。
付属の線維芽細胞は、播種後2日目に円形に楕円形を持っている必要があります。ゼロ日目に、繊維芽細胞培地でNCFを1〜2倍から立方センチメートル当たり4番目の細胞の密度にシードします。1日目には、必要に応じて各々のウイルス含有培地を培地に置換する。
2日目、ウイルス感染後24時間、ウイルス含有培地を通常のICM培地に置き換える。蛍光反転顕微鏡でカルシウムイオンフラックスを室温で評価します。GCaMP3陽性細胞を10Xの目標下で観察し、明視野チャネルで拍動する自発的な細胞を示すようにする。
正しい遺伝子型を有する心臓は、カルシウムイオンフラックスが拍動と同期し、GCaMP3の蛍光として視覚化された。コントロール心臓では蛍光は認められなかった。2時間以内にウェルに取り付けられた孤立したNCFは、播種の1日後に円形に楕円形を示した。
カルシウムイオン振動は、GCaMP3の蛍光変化を示し、その細胞の最大と最小とカルシウムイオン振動が周期的に変化した。IMAPを導入した後、高出力分野に対するカルシウムイオン束を有するGCaMP3陽性細胞の数がIMAP中処理群で増加したため、打ち負かすクラスターの数は制御群のそれよりも有意に多かった。NCFは、孤立後に新たに準備され、健康でなければなりません。
心臓の分離、切断、および適切な消化時間の迅速な手順は、細胞の生存率と状態の低下を避けるのに役立ちます。この方法は、心臓リプログラミング研究者のための機能的な交配されたIcMを同定する方法を提供する。さらに複数の評価方法を使用すると、機能的な交配ICCMについてより簡潔な理解を得ることができます。
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概要
本記事では、心機能リプログラミングを評価するための新しいマウスレポーターライン、αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3を紹介します。確立された本プロトコルにより、カルシウムフラックス解析を通じて、新生児心臓線維芽細胞（NCFs）由来の誘導心筋細胞（iCMs）の評価が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 心筋リプログラミング
- 誘導心筋細胞
- カルシウムフラックス解析
背景
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウスモデルは、心臓研究を促進します。
- 新生児心線維芽細胞は、効率的にiCMへ転換可能です。
- カルシウムフラックスは、iCMの機能的成熟度の重要な指標となります。
- 本手法により、心臓リプログラミング研究における再現性が向上します。
研究目的
- iCMの機能的な成熟度を評価するための信頼性の高いプラットフォームを構築すること。
- 心臓リプログラミング研究における評価手順を簡略化すること。
- 心筋細胞の分化および心機能に関する知見を提供すること。
使用した手法
- P0からP2の幼若マウスからの新生児心臓線維芽細胞の単離。
- NCFから誘導心筋細胞への変換。
- カルシウムフラックス測定による機能的成熟度の評価。
- リプログラミング効率および心機能の評価。
主な結果
- NCFを機能的なiCMへ正常に変換できたこと。
- iCMにおいてのみカルシウムフラックスが観察され、成熟が示されたこと。
- 心細胞リプログラミング研究における結果の再現性が向上したこと。
- 心筋細胞分化の評価に適用可能なプロトコルであること。
結論
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウスモデルは有用なツールである。
- カルシウムフラックス解析は、iCMの成熟度を評価するのに有効である。
- 本手法は、心筋リプログラミングおよび機能に関する研究を推進させることができる。
よくある質問
産業界における重要性
誘導心筋細胞の機能的な成熟度の評価は、再生医療に向けた心臓リプログラミングにおける極めて重要なボトルネックとなっています。本プロトコルでは、カルシウムフラックスをレポーターベースで直接読み取ることで、iCMの機能的成熟度の客観的な評価を可能にし、初期探索段階におけるターゲットの検証およびメカニズム的なリスク低減を支援します。転写リプログラミングと機能的な電気生理学的出力を結びつけることにより、前臨床モデルにおける予測の信頼性を向上させ、心臓修復戦略に関するポートフォリオの意思決定に寄与します。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：転写因子の導入（MGT）を、リプログラミングされた細胞における機能的なカルシウム・トランジェントの読み取りに結びつけることで、治療仮説の検証を可能にします。
- 運用の価値：GCaMP3の蛍光を用いて、リプログラミングに成功したiCMを単離し、遺伝子発現などの間接的なマーカーへの依存を低減します。
- 予測的価値：カルシウムフラックスは機能的バイオマーカーとして機能し、心筋リプログラミング手法における生物学的リスクの低減とターゲットへの信頼性を裏付けます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイの準備：iCM成熟アッセイにおける定量的な従属変数としてカルシウムフラックスを定量化するための、標準化された蛍光ベースのプラットフォームを確立します。
- 再現性：レポーターマウスラインにより、実験全体で機能的なiCMの一貫した検出が保証され、アッセイの標準化がサポートされます。
- 拡張性：蛍光顕微鏡と互換性があり、リプログラミング効率をスクリーニングするための高スループットイメージングシステムに適応可能です。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 疾患への関連性：in vitroでiCMの機能的成熟度を評価するための疾患関連システムを提供し、創薬から前臨床検証への橋渡しを可能にします。
- トランスレーショナルな連続性：初期のリプログラミング段階から機能的な電気生理学的能能に達するまで、iCM成熟の縦断的な評価を可能にします。
- メカニズムによるリスク低減：カルシウムフラックスの測定により、構造的にリプログラミングされた細胞と機能的に成熟したiCMを区別でき、偽陽性の結果を減らすことができます。
パイプラインおよびワークフローの統合
本手法は、ターゲットバリデーションからリード化合物の同定、さらには前臨床評価に至る創薬の連続的なプロセスに適合し、特に転写リプログラミング後かつin vivoでの検証前における機能評価を可能にします。
- 探索生物学： リプログラミング因子がマーカーの発現だけでなく、機能的なカルシウムハンドリングを誘導するかを決定することで、仮説検証をサポートします。
- スクリーニング： 化合物や条件の比較に向けた、定量的なカルシウムフラックス読み取りが可能な、アッセイ準備済みで再現性のある生物学的システムを提供します。
- 分析： カルシウム振動の頻度と振幅に関する蛍光ベースの時系列データを生成し、リプログラミング条件の統計的比較を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ： in vitroのリプログラミング結果を、前臨床モデルに関連する機能的な心筋細胞表現型へと結びつけます。
- エンタープライズ再利用： 複数の心臓リプログラミング標的および分化プロトコルに適用可能な、再利用可能なレポータープラットフォームを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 機能的な成熟度を直接測定することで、リプログラミング結果におけるメカニズム的な曖昧さを軽減する。
- 運用上の価値： 遺伝子レポーターの特異性により標準化と再現性を向上させ、抗体ベースの手法による変動を最小限に抑える。
- 戦略的価値： 分子レベルのリプログラミングと機能的な電気生理学的準備状態を関連付けることで、継続・中止（go/no-go）の判断を改善する。
- ポートフォリオへの影響： 機能的なiCMの収量と成熟品質に基づいた、リスク調整後のリプログラミング戦略の優先順位付けを可能にする。
実施上の考慮事項
- マウスの繁殖、心臓組織の単離、および蛍光顕微鏡観察に関する専門知識が必要です。
- αMHC-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3マウス系統およびMGT用のウイルスデリバリーシステムへのアクセスに依存します。
- 一貫したiCM誘導およびカルシウムフラックス評価のためには、標準化された培養条件とタイミングが必要です。
- 代替の線維芽細胞源や他種への適応には、レポーターの特異性およびカルシウムシグナリングの忠実度の検証が必要となる場合があります。
- 実用的な制限として、フラックスの可視化を自発的収縮に依存することや、トランスフェクション効率に変動が生じる可能性があることが挙げられます。
バイオファーマFAQ
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:53
Isolation and Selection of Neonatal Myh6-Cre/Rosa26A-Flox-Stop-Flox-GCaMP3 Mice Hearts
1:23
Isolation of Neonatal Cardiac Fibroblasts (NCFs)
2:43
Reprogramming NCFs to iCMs with MGT Encoding Retrovirus Infection
3:28
Results: In Vitro Assessment of Cardiac Reprogramming
4:20
Conclusion
