Name: 蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-09T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶFISH法による組織内細菌の可視化手法。マウス腸管サンプルを用いて、宿主と腸内微生物叢の相互作用を蛍光イメージングで解析する方法を解説。細菌の局在や粘膜層の評価に応用可能です。

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著者らは、クリステン・アール博士の貴重な技術開発、トラブルシューティングの助けを求めるアンバー・ハン、原稿の批判的なレビューに対するジェン・グエン博士とディアナ・ペパン博士、顕微鏡アクセスを提供してくれたブリティッシュコロンビア大学のヘシャム・ソリマン博士とロッシ研究所に感謝したいと考えています。著者らは、CIHRチームグラント:カナダマイクロバイオームイニシアチブ2(C.T.)、クローン病と大腸炎カナダ(C.T.とK.M.N.)、CIFAR(C.T.とK.M.N.)、マイケル・スミス健康研究学者賞(C.T.へ)、ウェストン財団:ウェストン・ファミリー・マイクロバイオーム・イニシアチブ(C.T.T.)、ポール・アレン・アクト・アワードからの支援を認めています。

<ol><li>Tropini, C., Earle, K. A., Huang, K. C., Sonnenburg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gut+microbiome%3A+connecting+spatial+organization+to+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">The gut microbiome: connecting spatial organization to function.</a> Cell Host and Microbe. 21 (4), 433-442 (2017).</li>
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<li>Ng, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+the+gut+microbiota+after+antibiotics+depends+on+host+diet%2C+community+context%2C+and+environmental+reservoirs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+and+Microbe%22%5BJournal%5D)">Recovery of the gut microbiota after antibiotics depends on host diet, community context, and environmental reservoirs.</a> Cell Host and Microbe. 26 (5), 650-665 (2019).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+multiplexed+spatial+mapping+of+microbial+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Highly multiplexed spatial mapping of microbial communities.</a> Nature. 588 (7839), 676-681 (2020).</li>
<li>Johansson, M. E. V., Hansson, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preservation+of+mucus+in+histological+sections%2C+immunostaining+of+mucins+in+fixed+tissue%2C+and+localization+of+bacteria+with+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Preservation of mucus in histological sections, immunostaining of mucins in fixed tissue, and localization of bacteria with FISH.</a> Methods in Molecular Biology. 842, 229-235 (2012).</li>
<li>Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProbeBase-an+online+resource+for+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+primers%3A+New+features+2016%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">ProbeBase-an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: New features 2016.</a> Nucleic Acids Research. 44 (1), 586-589 (2016).</li>
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<li>Beliveau, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OligoMiner+provides+a+rapid%2C+flexible+environment+for+the+design+of+genome-scale+oligonucleotide+in+situ+hybridization+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">OligoMiner provides a rapid, flexible environment for the design of genome-scale oligonucleotide in situ hybridization probes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), 2183-2192 (2018).</li>
<li>Madeira, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+EMBL-EBI+search+and+sequence+analysis+tools+APIs+in+2019%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 636-641 (2019).</li>
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<li>Lagkouvardos, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+and+cultivation+study+of+Muribaculaceae+reveals+novel+species%2C+host+preference%2C+and+functional+potential+of+this+yet+undescribed+family%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Sequence and cultivation study of Muribaculaceae reveals novel species, host preference, and functional potential of this yet undescribed family.</a> Microbiome. 7 (1), 28(2019).</li>
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<li>Yilmaz, L. S., Parnerkar, S., Noguera, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MathFISH%2C+a+web+tool+that+uses+thermodynamics-based+mathematical+models+for+in+silico+evaluation+of+oligonucleotide+probes+for+fluorescence+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MathFISH, a web tool that uses thermodynamics-based mathematical models for in silico evaluation of oligonucleotide probes for fluorescence in situ hybridization.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (3), 1118-1122 (2011).</li>
<li>Huber, D., Voith von Voithenberg, L., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+History%2C+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nano+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+capture+microdissection+and+metagenomic+analysis+of+intact+mucosa-associated+microbial+communities+of+human+colon%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Laser capture microdissection and metagenomic analysis of intact mucosa-associated microbial communities of human colon.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 88 (6), 1333-1342 (2010).</li>
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著者には利益相反はありません。

上述のプロトコルは、宿主微生物叢界を可視化する再現可能な方法を提供する。これらのアッセイは、FISH標識18 の最適化から粘液保存およびimaging9に始まるプロトコル開発からかなり恩恵を受けています。固定と埋め込みもサンプルの有用なストレージを提供します。さらに、パラフィン浸潤カセットは、サンプルが完全に固定され、不活性であるとして、制限なしに郵送することができます。
有意性と代替方法 FISHと粘液染色の組み合わせは、特定の組織の場所での微生物叢組成の分析と、個々の細菌と宿主との相互作用を可能にする。マイクロビオタ内の特定の部位の分析を含む代替技術は、通常、シーケンシング19と結合されたレーザー捕捉マイクロ解剖の場合のような、これらの相互作用の単細胞性を探索することができない。しかし、シーケンシングベースの技術は、16S rRNAプローブよりも細かいレベルで、より広く微生物叢の遺伝的構成を捕捉することができるという利点を有する。
提示されるプロトコルの落とし穴は、宿主に関連してマイクロビオタの単回スナップショットを提供することです。生きた動物におけるリアルタイムイメージングでは、深部組織における蛍光シグナルの取得を容易にする特別なイメージング技術が必要です(例えば、生体内2光子顕微鏡および光シート蛍光顕微鏡20,21)。これらの方法では、モデル生物は、そのエンベロープ20に結合する分子で染色された細菌または蛍光タンパク質21を収容する遺伝子組み換え細菌でコロニー形成される。後者の場合、蛍光タンパク質の成熟は、ほとんどの標準的な蛍光タンパク質が光を放出するために酸素を必要とするので、重要な問題です。したがって、少なくともnan好気環境(酸素のナノモル濃度)を有するモデル生物が必要とされ、好気性ゼブラフィッシュgut21などが必要である。
このプロトコルでは、メタノールカルノイは、パラホルムアルデヒドまたはホルマリンの代わりに固定剤として使用されます。これにより、処理中の粘液層の水分補給、脱水、崩壊を防止し、粘液の厚さの正確な測定を容易にします。メタカーンの固定化とパラフィン埋め込みは分野の標準となっているが、粘液保存を最適化するための異なる固定剤および埋め込み技術が検討されており、樹脂がパラフィン埋め込みよりも優れている可能性が示されている。パラフィン埋め込みおよびメタカーン固定に対するもう一つの重要な制限は、蛍光タンパク質の消失であり、これは、代替固定剤(例えば、ホルマリンまたはパラホルムアルデヒド(PFA))または改変埋め込み技術23を用いて回避できる。各固定剤には利点と欠点があり、固定性の選択はイメージングの優先順位に依存します。PFAとメタカーンのどちらでも生物学的複製が固定され、両方のサンプルから画像が得られた場合、イメージングモダリティを組み合わせることができます。
FISHは、特異的抗Muc2C3ウサギポリクローナル抗体を有する単離された例において免疫蛍光と組み合わされている。これらの結果は、他のMuc2抗体と共に広く再現されておらず、FISH免疫蛍光の組み合わせの成功において抗体の選択が重要であり得る可能性があることを示している。特定の抗体に対する抗体染色が成功する条件は、FISH染色の保持を許可しない場合があります。
トラブルシューティング このプロトコルでは、サンプルの収集、断面化、および染色は、イメージングアーティファクトの作成を防ぐための重要な手順を表します。例えば、採取時および埋め込み前に組織を押すと、微生物叢の誤局在化を招き、粘液の品質に影響を与える可能性があります。もう一つの重要な考慮事項は、小腸の比較的空の部分と遠位結腸内のペレットなど、単一のカセットで非常に異なる厚さのセグメントを組み合わせることを避けることです。異なる厚さはイメージングの困難につながる:埋め込んだ後、1つのセグメントの特定の深さでの横断断面は、他のセグメントのイメージングのために間違った深さにある可能性があります(例えば、ルーメンは組織ごとに異なる深さになります)(図1B、C および 図3A)。さらに、画像化動物モデル便ペレットについては、腹膜24に包んでもよい。この技術では、新たに分離された腹陰の小さな部分が便の周りに穏やかに折り畳まれ、プロトコルで概説されている洗浄段階の間にペレットの構造を保存します。
内容物を含む動物組織の処理とは異なり、ヒト腸管サンプルをイメージングすることはいくつかの課題を提示する。具体的には、腸内腔内の内容物および粘膜内層は、腸内生検または切除処置の前に通常行われる大腸内視鏡検査腸製剤によって破壊される可能性が高い。さらに、生検が収集されるとき、腸内含量がない場合に特定の特徴(例えば、内腔と粘膜の)の同定に役立つ組織の向きに注意することが有用である。3%寒天および/または寒天で事前埋め込み:ゼラチン混合物は、組織の極性を維持するのに有用であり得る25;しかし、文献に記載されているように寒天の脱水と断方に問題があり、処理時間を変更する必要があります。
良いFISH染色を達成するための重要な側面は、特定のFISHプローブのホルムアミド濃度を調整することから来る。Formamideは、FISHプローブのターゲットへのハイブリダイゼーションストリンジェンシーを制御します。a)適切なホルムアミド濃度が所定のコミュニティを染色するために選択されていること、およびb)適切なホルムアミド濃度が利用されているプローブの組み合わせに対しても可能であることを確認することが重要です。mathFISH(http://mathfish.cee.wisc.edu/)などのウェブサイトは、所定のプローブの適切なホルムアミド濃度を計算するのに役立ちます。適切なホルムアミド濃度に関する情報がない場合、このプロトコルは0%および10%ホルムアミドで試験することができる。
埋め込まれたサンプルを切り離すには、ブロックに浅く切り込みすぎると、明るい内容のない絨毛/納骨堂の断面図が得られるため、ブロックを十分な深さまで切る必要があります(図3A)。最適なFISH信号のために切り離した直後にサンプルを染色し、新鮮なDAPI(または-20°Cに保存されたDAPI)を使用してバックグラウンドの問題を解決します(図3C)。1ヶ月以上前の部分のFISH染色は、汚れが悪い/矛盾する可能性があります。
組織またはカバースリップがスライドに対して完全に平坦でない場合、サンプルはタイルスキャン内のすべての位置に焦点を合わせることができない可能性があります(図3B)。.は、無駄な労力と潜在的な光の漂白につながります。これは、すべての位置が焦点を合わせられたことを確認した、より小さなタイルスキャンを取ることによって解決できます。鈍い刃で切り離す場合、粘液や光度の内容物の剥離にもつながり、イメージング中に大きな暗い領域として表示されます。最後に、ハイブリダイゼーション工程中の溶液または気泡の蒸発は、組織におけるFISHプローブの不均一な染色につながる可能性があります。
FISHプローブ結合の効率に影響を与えるもう1つの重要なパラメータは、異なるプローブ間の競争です。FISHプローブが細菌に標識していることを確認するのに役立つチェックは、FISHプローブからのシグナルの共局在化をDAPIで調べることです(図2C,D)。複数のrRNAプローブを使用する必要があるサンプルでは、ハイブリダイゼーション温度、プローブ濃度、およびホルムアミドなどのパラメータを調整することが重要になり、プローブが正しい種に効率的に結合していることを確認することが重要になります18。
イメージングに関する注意事項 魚染色細菌は、共焦点顕微鏡と少なくとも40倍の倍率の目的を使用して最もよく視覚化されます。63倍の倍率は単細胞レベルでの画像細菌に好ましいが、40倍倍倍はデジタルズームを最大化するか、または超解像系を採用することによっても使用することができる。超分解能を備えたシステムは、個々の細菌細胞の細胞下解像度を提供する可能性もあります。低倍率目標は、細菌の局在および粘液の厚さの一般的な感覚を得るために利用され得る。
高いダイナミックレンジは、上皮の非常に明るい核と発光細菌の比較的弱い信号からDAPI信号の広い範囲をキャプチャするのに役立ちますので、8ビット画像の代わりに16ビット画像を取得することも強くお勧めします。上記のイメージング設定を使用する以外に、イメージングの重要な考慮事項は、フルオロフォアの選択です。細菌タイプ間の最良の分離のために、使用されるフルオロフォアが励起および発光スペクトルで重ならないようにしてください(線形アンミックスを行う能力を持つシステム上でイメージングしない限り)。さらに、プローブは、追加のコミュニティメンバーを識別するために、組み合わせて使用することができます(例えば、家族固有のプローブと属特異的プローブの組み合わせ)。線形非混合または未検証プローブを使用する場合、純粋な培養物8,14でのFISH染色の精度とレベルをテストすることが不可欠です。
画像が収集されると、BacSpace26、HiPR-FISH8、およびその他のセグメンテーションツール27などのホスト・マイクロビオタ・インターフェースの定量分析に複数のツールが使用できます。BacSpaceは、組織と発光成分のセグメンテーションと、images26からの植物材料の除去を可能にするMATLABソフトウェアです。プログラムはまた、2Dの粘液の厚さの分析と異なるチャネル26のピクセル距離に基づいて空間分布の定量化を提供します。逆に、HiPR-FISH画像解析ソフトウェアは、FISH染色細胞8のセグメンテーションを可能にする。最後に、in vitro実験27用に最適化された他の細菌セグメンテーションツールもこのアプリケーションに適応することができる。
結論 その場で イメージングは、他のコミュニティメンバーと食事、粘液、および宿主上皮陰窩によって作成された様々な微小環境のコンテキストで個々の微生物分類の定量分析を可能にする。生物間の相互作用は、宿主関連微生物系の生物学を決定し、健康に影響を及ぼす摂動中のこれらの構造の変化の本質的な分析を提供する。特に、上記のプロトコルを介して その場所で 微生物叢を画像化する能力は、動物宿主に関連して微生物叢の生物地理学に信じられないほどの窓を提供する。

微生物の視覚化技術は、アントニー・ヴァン・レーウェンフックが顕微鏡を使って17世紀 に歯垢と便から細菌(「動物性」と呼ばれる)を観察した時に、微生物学そのものと同じくらい古い起源を持っています。それ以来、宿主微生物叢1に関連する細菌、真菌、ウイルスのコンソーシアムの空間的組織を可視化する技術が数多く開発されてきました。これらの微生物の局在化を解明することは、動物宿主内でのそれらの機能を決定するために不可欠である。細菌の生物地理学は、特定の場所(例えば上皮)、栄養基質、および特定の微生物が種間および王国間相互作用の基礎となる代謝産物の細菌産生を指示する可能性があるため、コメンサルおよび病原性分類において同様に重要である。
口腔、腸、肺など、いくつかの異なる身体部位で細菌と宿主組織を分離する重要な構造は、宿主上皮細胞への微生物転位を防ぎ、微生物叢の栄養資源として機能する宿主産生層である粘液である2,3,4.この障壁の違反や変化を特徴付けることが重要であり、シーケンシングだけでは得られない宿主微生物叢相互作用に対する機械主義的洞察につながる5,6,7。例えば、イメージングは、抗生物質暴露が粘液層および微生物叢組織7,8を破壊し、下剤が粘液を枯渇させ、免疫パラメータ5の大きな変化と相関する可能性があるという発見を可能にした。
このプロトコルは、ヨハンソンとハンソン9の仕事に基づいて構築された微生物叢と宿主組織(図1)を固定、染色、およびイメージングするための一般的な枠組みを概説する。このプロトコルは腸管のセクションのコンテキストでモデル化されるが、他の組織タイプに容易に適応することができる。このプロトコルは、実験動物またはヒト臨床サンプルの処理を可能にします。両方のタイプのサンプルを処理するためのノートが含まれています。ここで示した例では、宿主上皮と発光細菌は、4′、6-ジミジノ-2-フェニリンドール(DAPI)染色、フルオレセイン(FITC)を用いた粘液、ウレックス・エウロペウス・アググルチンI(UEA-1)、およびFISHを使用する特異的なバクセクソンで同時に標識されています。FISHプローブは通常、高コピーの転写物を結合することから高いシグナルを確実にするために、分類の16S rRNA遺伝子に対して設計されています。
この例では、プローブは、ムリバクシアセ菌の細菌群の16S rRNAを標的とする(図2)。しかし、この染色は、適切な生物学的問題に対応するために、異なるFISHプローブおよび/またはレクチンで容易に置換されます。以前に検証されたFISHプローブは、rRNA標的オリゴヌクレオチドプローブのオンラインリソースであるProbeBase10またはリボソームRNAデータベースであるSILVA11で見つけることができます。新しいプローブの設計では、リーダーは HiPR-FISH8 や Oligominer12 などの新しいパイプラインを参照できます。このプロトコルを使用して、腸管腔内の細菌の密な充填と消化管全体の腸粘液の異なる特徴を観察することが可能です。ここで説明するワークフローは、宿主環境の空間的な文脈における微生物叢の定量的分析を可能にする。

<table><tbody><tr><td>アルミ箔</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー</td><td>C298-500</td><td>有毒</td></tr>な<tr><td>コプリン ジャー</td><td>フィッシャー</td><td>08-813E</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス、22 &times; 22 mm、いいえ #1</td><td>VWR</td><td>CA48366-227-1</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td>5 mg/mL に再懸濁</td></tr> 空の<tr><td>ピペット チップ ボックス</td><td></td><td></td><td>パラフィン</td></tr><tr><td>エタノール、無水、分子グレード</td>を溶かすには<td>--</td><td>--</td><td></td></tr><tr><td>FISHプローブFISH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ハイブリダイゼーション溶液</td><td>--</td><td>-</td><td>-20 mM Tris&ndash;HCl pH 7.4、0.9 M NaCl、0.01% (w/v) SDS ヌクレアーゼフリー水中。5&ndashのオプション追加。50%(v / v)ホルムアミド</td></tr><tr><td>FISH洗浄バッファー</td><td>--</td><td>--</td><td>20 mM Tris&ndash;HCl pH 7.4, 0.9 M NaCl</td></tr><tr><td>蛍光標識 Ulex Europaeus 凝集素 (UEA-1) レクチン</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>FL-1061 (フルオレセイン標識) または RL-1062-2 (ローダミン標識)</td><td>UEA-1 はフコシル化糖鎖を標識するため、無菌マウスやフコシルトランスフェラーゼ 2 (FUT2) 欠損宿主のサンプルには適していません。</td></tr><tr><td>鉗子</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルムアミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037</td><td></td></tr><tr><td>Fumehood</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>氷河酢酸</td><td>フィッシャー</td><td>A38-212</td><td>腐食性および可燃性</td></tr><tr><td>HybriSlip フレキシブル プラスチック カバー スリップ、22 x 22 mm &times; 0.25 mm</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GBL722222</td><td>FISHハイブリダイゼーション ステップでは、ガラス カバースリップを置き換えることができます</td></tr><tr><td>ImmEdge 疎水性バリア PAP ペン</td><td>ベクター ラボラトリーズ</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー</td><td>A412</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> 多目的<tr><td>検体保存容器、473 mL</td><td>フィッシャー</td><td>14-955-117A</td><td>お好みのガラスまたはポリエチレン容器で代用できます。メタカーンはポリスチレンや金属とは互換性がありません。</td></tr><tr><td>マニキュア</td>電子<td>顕微鏡科学</td><td>72180</td><td>任意のマニキュアはオーブン</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>必要な範囲:45-60>動作する必要があります。C</td></tr><tr><td>パラフィン:ライカパラプラスト</td><td>ライカ</td><td>39601006</td><td></td></tr><tr><td>PBS、リン酸緩衝生理食塩水 (10x 溶液)</td><td>Fisher</td><td>BP3991</td><td>プロトコルの 1x に希釈</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Fisher</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、20% 溶液、RNase-free</td><td>Invitrogen</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Loc HistoScreen Cassettes</td><td>ThermoScientific</td><td>CA83009-999</td><td></td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩溶液、1M Tris-HCl、pH 7.4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2663-1L</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>水、ヌクレアーゼフリー</td><td>フィッシャー</td><td>BP2484100</td><td></td></tr><tr><td>キシレン</td><td>フィッシャー</td><td>X3P-1GAL</td><td>有毒で可燃性</td></tr></tbody></table>

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

生体内のコンテキスト内での微生物の局在を測定することは、微生物叢と脊椎動物の腸との間の機能的関係を明らかにする上で不可欠なステップです。腸内微生物叢の空間的景観は、腸管粘液、納骨堂、折り目などの物理的特徴によって厳しく制御され、pH、酸素の入手可能性、免疫因子などの宿主制御特性の影響を受ける。これらの特性は、腸を安定的に植民地化するコメンサル微生物と病原体の能力を制限する。微生物群では、微生物の異なる微生物間の近距離相互作用と、微生物とその宿主との相互作用を決定します。これらの相互作用は、大規模な臓器機能と宿主の健康に影響を与えます。
このプロトコルは、細胞間の距離から臓器全体のスケールまでの腸内微生物叢空間組織の可視化を可能にする。この方法は、腸の構造と粘液の特性を維持しながら腸組織を固定することに基づいています。その後、固定サンプルを埋め込み、切り離し、染色して、蛍光を通して特定の細菌種 を ハイライトします。粘液および宿主細胞成分などの宿主特徴は、蛍光標識されたレクチンで標識される。最後に、染色された切片は、高倍率でタイルスキャンイメージングを利用した共焦点顕微鏡を使用して、ミクロンをセンチメートルの長さのスケールに橋渡しします。このタイプのイメージングは、動物モデルの腸管の切片やヒト組織の生検に適用して、健康と病気の腸内の微生物叢の生物地理学を決定することができる。

マウス腸内の特定の腸内細菌の局在を調べるには、個々の細菌分離株で植民地化された無菌スイスウェブスターマウスをこの研究で使用した。この実験では、標識された細菌種は、i)ムリバクロセ科5、ムリバキュラム腸管、マウス微生物叢15の豊富で流行の細菌ファミリー、ならびにii)細菌のテタイオタオミクロン、遺伝的に難調で一般的な腸細菌であった。2週間の平衡後、マウスを安楽死させ、そして、大便ペレットを含む結腸の一部を切り離し、調製したメタカーンに固定した。2日間の固定後、メタノール、エタノール、キシレンを介して処理してセクションを脱水し、パラフィンを浸潤し、埋め込み、4μmの薄膜スライスに切り離した。これらのサンプルは、オリゴミナーソフトウェア12を使用して設計されたムリバキュラム分離物に特異的なFISHプローブ(3'Cy3タグ付き)で染色され、NuPACKとmathFISH16,17を使用して二次および三次構造および最小非特異的結合をチェックした。また、ローダミン結合レクチンUEA-1(粘液中のフコシル化グリカンを染色する)およびDAPIで対向したサンプルを示した。染色されたセクションは、40倍の油の目的および超決断モジュールを使用してイメージ化された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig01.jpg"> 図1:腸内の微生物叢-宿主界面の可視化のワークフロー(A)パイプラインの図示されたワークフロー。(B) 2 つの断面平面は、横断断面(このパイプラインで推奨される)または断面「ドーナツ」のどちらかになります。(C)非常に異なる厚さの組織を埋め込むと、1つの組織または別の組織にのみ最適なスライスが生じる可能性があります。略語: FISH = その場合の蛍光のハイブリダイゼーション;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig02.jpg"> 図2:結腸をイメージングすると、ビトビオティックマウスモデルにおける粘液に対するムリバキュラム腸管の局在化を示す。 切片はDAPI(青)、ムリバクラセエFISHプローブ(赤)、UEA-1(緑色)で染色した。(A)ムリバキュラム腸管と(B)ムリバキュラム腸管とバクテロイデステタイオタオミクロンと二コロニー化マウスの遠位コロニーとマウスの単一コロニー形成の遠位結腸。スケールバー=20μm(CおよびD)Cy3-FISH(左)、DAPI(中央)、および(A)と(B)の発光インセット部分に対するCy3-FISH +DAPIチャネルをそれぞれ組み合わせた。スケールバー= 5 μm(A)および(C)では、すべての細菌形および細菌サイズのDAPIシグナルはCy3(単一矢印頭)で標識され、(B)および(D)では、これらのCy3-およびDAPI二重陽性細胞(単一矢印状)に加えて、Cy3陰性(二重矢印)であるDAPI染色細菌細胞が存在する。長い糸状細菌を除いて、より大きな(長さ&gt;4 μm)DAPI陽性構造(鈍い矢印)は、宿主細胞からの植物材料または核である。略語: FISH = その場合の蛍光のハイブリダイゼーション;DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62646/62646fig03.jpg"> 図3:一般的な問題. (A)浅い切片は腸の発光スライスを提供しない。(左)上皮の縦方向の見解だけでなく、内腔のビューを提供する深さで切除された腸管セグメント。(右)あまりにも浅く切り離された腸管セグメントは、納骨堂の断面のみを明らかにし、一定の粘液層または細菌を明らかにしていない。(B) 不均一な組織/カバースリップの被覆は、ぼやけて不均等に照らされたタイルスキャンを引き起こします。タイルスキャンは、フォーカスが合っていない位置(右上隅)で設定されました。(C)通常の背景(左)と高い背景(右)の例。この例では、DAPIシグナルノートについては、上皮から来るシグナルを、核の外側に示す。すべてのスケールバー= 20 μm。略語: DAPI = 4′,6-ジミディノ-2-フェニリンドール. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62646/62646fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

この合理化されたプロトコルは、組織の固定から、その場で蛍光を伴う微生物の染色まで、複雑な組織サンプル 中の 細菌を検出し、画像化するワークフローを詳述しています。

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

ホスト関連の微生物は、イメージングを本当に理解する必要があるこの非常に複雑なエコシステムを構成しています。そして、この粒子を通して、染色プロセスを経て、宿主微生物叢の可視化を達成する方法を示します。宿主関連細菌の生物学を理解するには、マイクロ環境内でのそれらの局在の理解が必要です。そして、この技術は、ホスト環境内だけでなく、他の細菌の文脈内で個々のタックスを視覚化することを可能にします。この技術を通じて、どの細菌が宿主組織を貫通した可能性があるかを判断し、宿主粘液などの主要な特徴が枯渇するかどうかを判断することが可能になる。60%絶対メタノール、30%クロロホルム、10%氷酢酸と互換性のある容器に新鮮なメタカーンを調製します。鋭くて清潔なツールを使用して、マウスから腸管セグメントを切断してイメージングします。可能な限りサンプルを邪魔最小限に抑え、その尾根でセクションを処理して、イメージング領域に影響を与えないようにします。分解後できるだけ早くサンプルを修正し、劣化を防ぎます。組織の端をピンセットで繊細に保持することにより、組織学的カセットに腸のセクションを配置します。カセットを閉じて、新鮮なメタカーン溶液に完全に沈め、カセットを浸漬したときに溶液が数時間より古くないことを確認します。ヒュームフードにアクセスせずに臨床スイートで収集される臨床サンプルの場合、フラップを蓋に切り取ったポリエチレン貯蔵容器を使用して、占体カセットの通過を可能にします。有毒な煙の脱出を防ぐためにサンプルを渡さないときに、このフラップを閉じたテープ。パラフィンを耐熱容器に入れ、一晩で摂氏60度のオーブンで溶かします。テキスト原稿に記載されているように、液体を適切な廃棄物容器に注ぎ、絶対メタノール、絶対エタノールおよびキシレンで順次インキュベートして組織を洗浄します。カセットを少し開けて、二重手袋やピンセットを使用して組織セグメントを失うことなくパラフィンが入るようにします。溶かしたパラフィンの容器にカセットを沈め、閉じます。容器を摂氏60度のオーブンに戻し、カセットにパラフィンが充填され、大きな気泡が残らないようにします。2時間インキュベーションした後、オーブンから容器を取り出します。鉗子を使用して、慎重にカセットを取り外します。オーブンを摂氏60度に加熱し、コプリン瓶を温めます。ガラス瓶に十分な量のキシレンを加えて、瓶の中のガラススライドを2回覆い、パラフィルムを蓋の周りに置いてキシレンの蒸発を防ぎます。キシレンの温度を摂氏60度に達させます。テキスト原稿に記載されているとおりFISHハイブリダイゼーションソリューションを用意します。コプリン瓶にスライドを置き、セクションが他のスライドや瓶に接触していないことを確認し、スライドを摂氏60度で10分間焼きます。ヒュームフードで、コプリン瓶にオーブンから温められたキシレンを充填し、サンプルの上に直接注ぎ込まないように注意し、潜在的に組織を取り除きます。コプリンの瓶を60度オーブンに戻します。使用済みのキシレンを適切な廃棄物容器に注ぎ、ガラススライドの組織切片を乱さないように注意し、スライドがコプリン瓶から落ちないように鉗子のペアを使用します。コプリンの瓶に残りのキシレンを補充し、フュームフードの室温で10分間インキュベートします。99.5%エタノールで室温で5分間インキュベートします。インキュベーション後、コプリン瓶からスライドを取り外します。実験室のワイプまたはペーパータオルでスライドの背面を拭き、エタノールの液滴がなくなるまで一時的に空気乾燥します。液体ブロッカーまたはPAPペンを使用して各組織セクションの周りに非常に近い円を作成し、ハイブリダイゼーション溶液でカバーする必要がある膨張領域を制限し、セクションとのインク接触を避けます。ハイブリダイゼーション溶液を調製し、使用する溶液の50マイクロリットルごとに0.5マイクログラムのプローブを追加します。スライド上のセクションに溶液をピペット。柔軟なプラスチック製のカバーリップでセクションをオーバーレイし、使用される液体の体積がセクション全体をカバーすることを確認します。余分なハイブリダイゼーション溶液またはPBSで浸したワイプまたはペーパータオルを入れたピペットチップボックスを備えた湿気の多いチャンバーを作成して、湿度を提供します。蒸発を減らすためにセットされたプローブに応じて、湿度の高いチャンバーに45〜50°Cで少なくとも3時間インキュベートします。プラスチック製のカバーリップを取り外し、両方とも摂氏50度に予熱したコプリン瓶のFISH洗浄バッファーのスライドをインキュベートします。コプリンの瓶を摂氏50度のオーブンに10~20分間戻します。FISH洗浄バッファーを取り出し、コプリン瓶のPBSと交換します。コプリン瓶をPBSで補充した直後に、PBSをデカントします。瓶からスライドを取り出し、セクション全体の上にカウンターステインをピペットし、ピペットチップで組織に触れないようにします。摂氏4度で45分間インキュベートします。新鮮なPBSで汚れを3回素早く洗います。スライドの背面をワイプまたはペーパータオルに当てはめ、ほとんどのPBSはピペットチップに接続された真空ラインに助けとなるセクションを蒸発させます。取り付けメディアを使用してセクションをマウントします。カバースリップの端に沿って明確なマニキュアで塗装し、スライドの端から離れるように注意して、スライドにカバースリップを貼り付けます。室温に設定します。ムリバキュラム腸管でマウス単一コロニー形成されたマウスの遠位コロニーと、ムリバキュラム腸管およびバクテロイデステオタオミクロンとの二次植民地化の画像をここに示す。サンプルは、ムリバキュラム分離物に特異的にタグ付けされた3つのプライムシアニン-3のFISHプローブで染色され、またローダミン結合レクチンUEA-1およびDAPIで対抗した。シアニン-3 FISH、DAPI、およびシアニン-3 FISHおよびDAPIチャネルを組み合わせたセクションの画像は、ムリバキュラム腸管の局在化を示す。すべての細菌形および細菌サイズのDAPIシグナルは、単一コロニー形成状態でシアニン-3で標識される。二コロニー形成状態では、これらシアニン-3およびDAPI二重陽性細胞に加えて、期待通りシアニン-3陰性であるDAPI染色細菌細胞がある。長い糸状細菌を除いて、より大きなDAPI陽性構造は、宿主細胞からの植物材料または核である。内腔のビューだけでなく、上皮の縦方向のビューと陰窩の断面のみを明らかにし、一定の粘液層または細菌を明らかにする深さで切除された腸セグメントは、浅い断面が腸の発光スライスを提供しないことを証明する。不均一なティッシュまたはカバースリップの適用範囲はぼやけて、不均等に照らされたタイル スキャンをもたらす。通常の背景と高い背景の例もここに示されています。微生物叢の詳細を学ぶにつれて、シーケンシングなどのバルクアッセイでは、異なる微生物種間で何が起こるか、どのように相互作用するかを実際に判断するには不十分であることは本当に明らかになりました。このためには、イメージングが必要です。この種の技術は、例えば、食事からの繊維の剥奪が粘液層の薄化を引き起こし、マーティンズ群からの研究などの病原体による感染の可能性を引き起こすだけでなく、浸透性下痢の影響と粘液層の枯渇が本当に宿主と微生物叢の両方に与える影響に関する研究を可能にした。そして、これらはソンネンバーググループと私たちのグループによって行われた研究でした。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

間の共生を研究するために、...

蛍光顕微鏡を用いて線虫の中の細菌の可視化

出典: Ng, K. M., Tropini, C. 蛍光の 現場 ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージングによる腸内細菌叢-宿主相互作用の可視化。 J. Vis. Exp.

マウス腸切片における腸内細菌の蛍光インポジションハイブリダイゼーション

Source: Zhang, L., et al. Immunofluorescent Labeling of Plant Virus and Insect Vector Proteins in Hemipteran Guts. J. Vis. Exp. (2021)The video demonstrates the preparation of gut tissue from a plant virus–infected insect vector for fluorescence imaging. Fixed guts were washed, permeabilized, and incubated with two fluorescent antibodies in a blocking solution—one targeting a viral antigen in vesicles, the other a vesicle-associated membrane protein. The tissue was counterstained for actin...

Immunostaining to Visualize Viral Antigen and Host Protein Colocalization in the Insect Gut

このビデオは、尿路感染患者の脱パラフィン化された膀胱組織中の細菌の視覚化を示しています。細菌の16sリボソームRNAとハイブリダイズした蛍光標識プローブは、組織関連細菌とその分布を明らかにし、サンプル内のそれらの密度に関する貴重な空間的洞察を提供します。...

蛍光In Situハイブリダイゼーションによる膀胱生検切片の細菌の可視化

私たちは、人間の腸オンチップmicrophysiologicalシステムを使用して長期間のためのin vitroプロトコルへの共培養腸microbiomeと腸絨毛を説明します。...

ガットオンチップマイクロ流体デバイスにおけるマイクロ加工ヒト腸絨毛と生活Microbiomeの共培養

ここでは、空間的そして一時的変更されたホール マウント in situ...

ホール マウントIn Situハイブリダイゼーションによる目盛りの腸内微生物叢の可視化

本稿では、新しい腸器官培養システムを用いて、 生体 実験を行うホストとマイクロバイオームの相互作用を分析する独自の方法を紹介する。...

宿主-微生物叢相互作用を解析するための腸腸器官培養システム

細胞外細菌やオルセーウイルスや微胞子虫(真菌)などの細胞内病原体を含む腸内微生物は、野生の カエノラブディティス 線虫と関連していることがよくあります。この記事では、 C.エレガンス...

RNA蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)による カエノラブディティスエレガンス 腸における微生物のコロニー形成と感染を可視化

ここでは、感染時の病原菌の臓器全体にわたる検出と蛍光レポーター活性の定量化を可能にする手順について説明します。...

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

ここでは、光学的光熱赤外蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)、別名中赤外光熱魚(MIP-FISH)を使用して、個々の細胞を特定し、その代謝を理解するためのプロトコルを紹介します。この方法論は、単一細胞分解能による細胞代謝のマッピングなど、さまざまなアプリケーションに幅広く適用できます。...

光学的光熱赤外蛍光In Situハイブリダイゼーション(OPTIR-FISH)

学ぶFISH法による組織内細菌の可視化手法。マウス腸管サンプルを用いて、宿主と腸内微生物叢の相互作用を蛍光イメージングで解析する方法を解説。細菌の局在や粘膜層の評価に応用可能です。

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

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