蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

この合理化されたプロトコルは、組織の固定から、その場で蛍光を伴う微生物の染色まで、複雑な組織サンプル 中の 細菌を検出し、画像化するワークフローを詳述しています。

ホスト関連の微生物は、イメージングを本当に理解する必要があるこの非常に複雑なエコシステムを構成しています。そして、この粒子を通して、染色プロセスを経て、宿主微生物叢の可視化を達成する方法を示します。宿主関連細菌の生物学を理解するには、マイクロ環境内でのそれらの局在の理解が必要です。

そして、この技術は、ホスト環境内だけでなく、他の細菌の文脈内で個々のタックスを視覚化することを可能にします。この技術を通じて、どの細菌が宿主組織を貫通した可能性があるかを判断し、宿主粘液などの主要な特徴が枯渇するかどうかを判断することが可能になる。60%絶対メタノール、30%クロロホルム、10%氷酢酸と互換性のある容器に新鮮なメタカーンを調製します。

鋭くて清潔なツールを使用して、マウスから腸管セグメントを切断してイメージングします。可能な限りサンプルを邪魔最小限に抑え、その尾根でセクションを処理して、イメージング領域に影響を与えないようにします。分解後できるだけ早くサンプルを修正し、劣化を防ぎます。

組織の端をピンセットで繊細に保持することにより、組織学的カセットに腸のセクションを配置します。カセットを閉じて、新鮮なメタカーン溶液に完全に沈め、カセットを浸漬したときに溶液が数時間より古くないことを確認します。ヒュームフードにアクセスせずに臨床スイートで収集される臨床サンプルの場合、フラップを蓋に切り取ったポリエチレン貯蔵容器を使用して、占体カセットの通過を可能にします。

有毒な煙の脱出を防ぐためにサンプルを渡さないときに、このフラップを閉じたテープ。パラフィンを耐熱容器に入れ、一晩で摂氏60度のオーブンで溶かします。テキスト原稿に記載されているように、液体を適切な廃棄物容器に注ぎ、絶対メタノール、絶対エタノールおよびキシレンで順次インキュベートして組織を洗浄します。

カセットを少し開けて、二重手袋やピンセットを使用して組織セグメントを失うことなくパラフィンが入るようにします。溶かしたパラフィンの容器にカセットを沈め、閉じます。容器を摂氏60度のオーブンに戻し、カセットにパラフィンが充填され、大きな気泡が残らないようにします。

2時間インキュベーションした後、オーブンから容器を取り出します。鉗子を使用して、慎重にカセットを取り外します。オーブンを摂氏60度に加熱し、コプリン瓶を温めます。

ガラス瓶に十分な量のキシレンを加えて、瓶の中のガラススライドを2回覆い、パラフィルムを蓋の周りに置いてキシレンの蒸発を防ぎます。キシレンの温度を摂氏60度に達させます。テキスト原稿に記載されているとおりFISHハイブリダイゼーションソリューションを用意します。

コプリン瓶にスライドを置き、セクションが他のスライドや瓶に接触していないことを確認し、スライドを摂氏60度で10分間焼きます。ヒュームフードで、コプリン瓶にオーブンから温められたキシレンを充填し、サンプルの上に直接注ぎ込まないように注意し、潜在的に組織を取り除きます。コプリンの瓶を60度オーブンに戻します。

使用済みのキシレンを適切な廃棄物容器に注ぎ、ガラススライドの組織切片を乱さないように注意し、スライドがコプリン瓶から落ちないように鉗子のペアを使用します。コプリンの瓶に残りのキシレンを補充し、フュームフードの室温で10分間インキュベートします。99.5%エタノールで室温で5分間インキュベートします。

インキュベーション後、コプリン瓶からスライドを取り外します。実験室のワイプまたはペーパータオルでスライドの背面を拭き、エタノールの液滴がなくなるまで一時的に空気乾燥します。液体ブロッカーまたはPAPペンを使用して各組織セクションの周りに非常に近い円を作成し、ハイブリダイゼーション溶液でカバーする必要がある膨張領域を制限し、セクションとのインク接触を避けます。

ハイブリダイゼーション溶液を調製し、使用する溶液の50マイクロリットルごとに0.5マイクログラムのプローブを追加します。スライド上のセクションに溶液をピペット。柔軟なプラスチック製のカバーリップでセクションをオーバーレイし、使用される液体の体積がセクション全体をカバーすることを確認します。

余分なハイブリダイゼーション溶液またはPBSで浸したワイプまたはペーパータオルを入れたピペットチップボックスを備えた湿気の多いチャンバーを作成して、湿度を提供します。蒸発を減らすためにセットされたプローブに応じて、湿度の高いチャンバーに45〜50°Cで少なくとも3時間インキュベートします。プラスチック製のカバーリップを取り外し、両方とも摂氏50度に予熱したコプリン瓶のFISH洗浄バッファーのスライドをインキュベートします。

コプリンの瓶を摂氏50度のオーブンに10~20分間戻します。FISH洗浄バッファーを取り出し、コプリン瓶のPBSと交換します。コプリン瓶をPBSで補充した直後に、PBSをデカントします。

瓶からスライドを取り出し、セクション全体の上にカウンターステインをピペットし、ピペットチップで組織に触れないようにします。摂氏4度で45分間インキュベートします。新鮮なPBSで汚れを3回素早く洗います。

スライドの背面をワイプまたはペーパータオルに当てはめ、ほとんどのPBSはピペットチップに接続された真空ラインに助けとなるセクションを蒸発させます。取り付けメディアを使用してセクションをマウントします。カバースリップの端に沿って明確なマニキュアで塗装し、スライドの端から離れるように注意して、スライドにカバースリップを貼り付けます。

室温に設定します。ムリバキュラム腸管でマウス単一コロニー形成されたマウスの遠位コロニーと、ムリバキュラム腸管およびバクテロイデステオタオミクロンとの二次植民地化の画像をここに示す。サンプルは、ムリバキュラム分離物に特異的にタグ付けされた3つのプライムシアニン-3のFISHプローブで染色され、またローダミン結合レクチンUEA-1およびDAPIで対抗した。

シアニン-3 FISH、DAPI、およびシアニン-3 FISHおよびDAPIチャネルを組み合わせたセクションの画像は、ムリバキュラム腸管の局在化を示す。すべての細菌形および細菌サイズのDAPIシグナルは、単一コロニー形成状態でシアニン-3で標識される。二コロニー形成状態では、これらシアニン-3およびDAPI二重陽性細胞に加えて、期待通りシアニン-3陰性であるDAPI染色細菌細胞がある。

長い糸状細菌を除いて、より大きなDAPI陽性構造は、宿主細胞からの植物材料または核である。内腔のビューだけでなく、上皮の縦方向のビューと陰窩の断面のみを明らかにし、一定の粘液層または細菌を明らかにする深さで切除された腸セグメントは、浅い断面が腸の発光スライスを提供しないことを証明する。不均一なティッシュまたはカバースリップの適用範囲はぼやけて、不均等に照らされたタイル スキャンをもたらす。

通常の背景と高い背景の例もここに示されています。微生物叢の詳細を学ぶにつれて、シーケンシングなどのバルクアッセイでは、異なる微生物種間で何が起こるか、どのように相互作用するかを実際に判断するには不十分であることは本当に明らかになりました。このためには、イメージングが必要です。

この種の技術は、例えば、食事からの繊維の剥奪が粘液層の薄化を引き起こし、マーティンズ群からの研究などの病原体による感染の可能性を引き起こすだけでなく、浸透性下痢の影響と粘液層の枯渇が本当に宿主と微生物叢の両方に与える影響に関する研究を可能にした。そして、これらはソンネンバーググループと私たちのグループによって行われた研究でした。