Name: オープングローブ損傷と治療性能を追跡するための前セグメント臓器培養プラットフォーム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶ前眼部臓器培養モデルを用いたオープングローブ損傷の評価と治療薬の有効性測定方法。動物実験を不要とし、眼内圧の回復を追跡することで新規治療法の開発に貢献します。

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この資料は、一時的な角膜修復取得プログラム(米国陸軍医療マテリエル開発庁)との機関間協定(#19-1006-IM)を通じて米国国防総省が支援する作業に基づいています。

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</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。この記事で述べられています見解は著者のものであり、アメリカ陸軍医療部、陸軍省、国防総省、または米国政府の公式の方針や立場を反映していません。

ASOC OG傷害プラットフォームには、方法論を使用する際に成功する可能性を高めるために強調すべき重要なステップがあります。まず、前部セグメントの解剖の間、骨膜メッシュワークを維持することは不可欠ですが、正しく行うことは困難です。もしTMが破壊された場合、眼は生理学的圧力を維持せず、実験的使用の適格性基準を満たさない。適切な解剖が得られるまで、追加の無菌技術の課題を導入するのではなく、まず通常の条件下で解剖プロセスを実践することをお勧めします。第二に、ASOCの皿に目を入れるとき、彼らは流体が漏れるのを防ぐのに十分にタイトですが、ASOC皿に損傷を与えないように十分に緩んでいることが不可欠です。眼がしっかりと固定されていないと、非生理学的手段を通じて眼から液体が漏れ出し、IOPがほとんどまたはまったくない。しかし、目を下に止めるクランプリングはプラスチック製で、締め付け過ぎれば簡単に折れる可能性があります。リングの下の強膜組織が最初の24時間の間に組織を圧迫し、緩めるので、2日間にわたって目を締め付ける必要があります。1日目に締め付けに対する抵抗が感じられるまでリングを締め、培養で24時間後に同様のレベルに再締め付けして、最良の結果を得...

オープングローブ(OG)傷害は、治療を受けていないか、または少なくとも傷害後に安定した視力の永久的な損失をもたらす可能性があります 1.しかし、農村部や軍事シナリオの戦場など、眼科介入へのアクセスが容易に利用できない遠隔地では、遅延が蔓延しています。治療が容易に利用できない場合、現在の治療基準は、医療介入が可能になるまで、硬質シールドで目を保護することです。軍事医療では、この遅延は現在24時間までですが、空気の避難が不可能な都市環境での戦闘活動では、今後72時間まで増加すると予想される2,3,4。これらの遅延は、眼科介入へのアクセスが制限されている農村部の遠隔地の民間アプリケーションではさらに長くなる可能性があります5,6.未治療のOG傷害は、眼の水密シールが損なわれることによる感染および眼圧(IOP)の喪失に対して非常に脆弱である7,8。IOPの喪失は組織の生存率に影響を与える可能性があり、傷害と治療の間の遅延が長すぎる場合に視力を回復させる可能性は低い医療介入を行う 9.
眼科の専門家に到達するまでのOG傷害をシールするための容易に適用可能な治療薬の開発を可能にするために、ベンチトップOG傷害モデルは、以前に開発された10、11。このモデルでは、IOPが圧力トランスデューサによって捕捉されている間、豚の目全体に高速傷害が生じた。治療は、OG傷害部位12をシールする能力を評価するために適用することができる。しかし、このモデルはブタの目全体を使用するので、患者が専門ケアに達するまで治療部位を安定させなければならない72時間の可能なウィンドウ全体で長期的なパフォーマンスを追跡する方法を持たない即時治療性能を評価することができます。その結果、前セグメント臓器培養(ASOC)OG傷害モデルが開発され、長期治療性能13を追跡するためのプラットフォームとして本プロトコルに詳述された。
ASOCは、角膜などの前部セグメントの血管組織を維持するために広く用いられている技術であり、複数週の後核化14、15、16、17である。前部セグメントは、生理学的流量で流体を浸透させ、骨膜メッシュワーク流出領域を保存することによって生理学的IOP下で維持され、IOPを調節する組織を、ASOCセットアップ18、19中に行う。ASOCプラットフォームは、組織を生理学的に維持し、空気圧駆動装置を用いてOG傷害を誘発し、治療を適用し、傷害後少なくとも72時間の損傷安定化を追跡する。
ここでは、このプロトコルは ASOC プラットフォームを使用するためのステップ バイ ステップの方法論を提供します。まず、ASOC プラットフォームのセットアップ方法と製造方法について説明します。次に、プロトコルは、前部セグメントを無菌的に解剖し、骨膜メッシュワークを維持し、続いてカスタムメイドの臓器培養皿に前部セグメント組織を設定する方法を詳述する。その後、オープングローブ傷害を作成し、傷害の直後に治療を適用する方法を詳述する。最後に、このプロトコルは、眼の機能的、機械的、生物学的特性を評価し、損傷がどの程度安定しているかを評価するこの方法で使用できる特性評価パラメータの概要を提供します。全体的に見て、このモデルは、開いた地球の損傷を安定させ、治療するための製品開発を加速し、傷害後の視力の悪い予後を改善するために非常に必要なプラットフォームを提供する。

<table><tbody><tr><td>10-32ポリカーボネートストレートプラグ、オスネジ付きパイプコネクタ</td><td>McMaster-Carr</td><td>51525K431</td><td></td></tr><tr><td>10-32ソケットキャップネジ、&frac12;"</td><td>McMaster-Carr</td><td>92196A269</td><td></td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>302995</td><td></td></tr><tr><td>20 mL シリンジ</td><td>BD</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Anti</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>ボールエンド L キー</td><td>McMaster-Carr</td><td>5020A25</td><td></td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC1696484</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp;イントラメディック&nbsp;PE 160 チューブ</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>14-170-12E</td><td></td></tr><tr><td>綿棒</td><td>ピューリタン</td><td>25-8061WC</td><td></td></tr><tr><td>DMEM メディア</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ATCC</td><td>30-2020</td><td></td></tr><tr><td>細かい鉗子</td><td>ワールド プレシジョン</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>Covidien</td><td>8044</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>高温シリコーン O リング、幅 2 mm、内径 4 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5233T47</td><td></td></tr><tr><td>大型鉗子</td><td>ワールド精密機器</td><td>500365</td><td></td></tr><tr><td>大型手術用ハサミ</td><td>ワールド精密機器</td><td>503261</td><td></td></tr><tr><td>中歯鉗子</td><td>ワールド プレシジョン器具</td><td>501217</td><td></td></tr><tr><td>ネイル(穿刺物)</td><td>McMaster-Carr</td><td>97808A503</td><td></td></tr><tr><td>ナイロンシリンジフィルター</td><td>Fisher</td><td>09-719C</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 (100 mm)</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>ポリカーボネート、三方、オス付き活栓&nbsp;ルアー&nbsp;ロック</td><td>フィッシャー</td><td>NC9593742</td><td></td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>フィ</td><td>ッシャー12-640</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼18 G&nbsp;90度&nbsp;アングルディスペンシングニードル</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A81</td><td></td></tr><tr><td>ステンレス鋼 18 G ストレート &frac12;&#039;&rsquo;分注針</td><td>McMaster-Carr</td><td>75165A675</td><td></td></tr> 蓋<tr><td>付き滅菌 100 mL ビーカー</td><td>VWR</td><td>15704-092</td><td></td></tr><tr><td>バンナス&nbsp;はさみ</td><td>ワールド精密機器</td><td>WP5070</td><td></td></tr></tbody></table>

オープングローブ損傷と治療性能を追跡するための前セグメント臓器培養プラットフォーム

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オープングローブの怪我は視力の結果が悪く、しばしば視力が永久的に失われます。これは、農村部の環境における傷害と医療介入と、眼科ケアが容易に利用できない軍事医療アプリケーションとの間の延長遅延によるものです。未治療の傷害は、眼が水密シールを失った後に感染しやすいだけでなく、眼内低血圧による組織の生存率の喪失である。開いた地球の傷害を一時的に封止する治療薬は、適切に発達すれば、眼内圧を回復し、適切な眼科ケアが可能になるまで感染を防ぐことができるかもしれない。製品開発を容易にするために、ここで詳述される、損傷後の少なくとも72時間の治療性能を追跡するための前セグメント臓器培養オープングローブ傷害プラットフォームの使用である。豚前セグメント組織は、カスタム設計の臓器培養皿で維持され、生理学的眼圧で保持することができる。穿刺傷害は、軍関連の傷害サイズと同様に、直径4.5mmまでの損傷サイズを発生させることができる空気動力システムで作成することができます。眼内圧の喪失は、損傷後72時間で観察され、眼の水密シールの適切な傷害誘導および喪失を確認する。治療性能は、傷害誘導後の眼への適用によって追跡され、その後、複数の日の眼圧を追跡することができる。また、前部損傷モデルは、透明性の評価、眼力学、角膜上皮の健康、組織の生存率などの前部系統生理学を機能的および生物学的に追跡するために広く使用されている方法に適用可能である。全体として、ここで説明する方法は、眼科ケアが容易に利用できないときに一時的に開いた地球の傷害を密封するための生体材料治療薬の開発に向けた必要な次のステップである。

光学コヘレンス断層撮影(OCT)を介して撮影された画像は、OG傷害目のために示され、成功した傷害誘導がどのように見えるかを説明します。 図3 は、損傷直後および72時間後にAS組織を負傷させたコントロールおよびOGの画像を示す。2 つのビュー:損傷部位を通る断面画像とトップダウン最大強度投影(MIP)を表示して、画像の表面積を視覚化します。コントロール目は角膜に顕著な破壊を示さないが、OG傷害後に角膜全体を横切る明確な傷害を見つけることができる。MIPからは、怪我の形や大きさが不規則であるが、傷害サイズは72時間にわたって減少することは明らかである。以前は、この効果は、13をテストした多くの傷害サイズに対して有意であることが示されている。
このプロトコルで説明されているOG傷害モデルの主なデータ出力は、実験のセットアップの過程で眼圧です。データは、キャリブレーション(補足プロトコル4)を介してmmHgに変換することができる各圧力トランスデュー...

オープングローブの目の怪我は、農村部や軍事関連のシナリオで数日間治療を受けず、失明を引き起こします。治療は視力の損失を最小限に抑えるために必要とされる。ここでは、臓器文化のオープングローブ傷害モデルについて詳しく説明します。このモデルを用いて、これらの傷害を安定させる潜在的な治療は適切に評価することができる。

Open globe injuries have poor visual outcomes, often resulting in permanent loss of vision. This is partly due to an extended delay between injury and ...

オープングローブの怪我は、治療を受けずに放置すると、視力の永久的な損失につながる可能性があります。この前部区分の器官培養モデルは動物のテストの必要性の中でこれらの傷害の査定を可能にする。このプロトコルは、臓器培養プラットフォームで3日以上の傷害を安定させるために、開いた地球の傷害および治療を追跡することを可能にする。この手順を実証するには、ドクター・ボイス研究所の研究技術者であるトレント・ピアソンが行われます。まず、外科的なカーテンと、大解解に必要な器具を置きます。解剖顕微鏡で目を視覚化するためのバイオセーフティキャビネットを設置します。皿アセンブリのためのバイオ安全キャビネットを設定します。バイオセーフティキャビネット内にオープングローブ傷害誘導ワークスペースを設置します。穿刺プラットフォームの前のラボジャックにクロストラッキングバイスを配置します。余分な眼窩組織を除去し、抗生物質抗ミコティックPBSで目を洗浄した後、ガーゼを浸した抗生物質抗ミコティックPBSに目を見る。無菌カミソリやメスを使用して、眼の赤道付近に切開を作成します。その後、湾曲した外科用ハサミを使用して眼を半球化し、前眼を分離する。シャベルとしてマイクロハサミを使用して、前部セグメントから膜房をすくい、マイクロハサミで前部セグメントからレンズを取り除きます。徐々に、骨柱状のメッシュワークが見えるまで、虹彩根に虹彩根を徐々にカットします。カットを虹彩の周囲に360度伸ばし、すべての骨柱状メッシュワーク領域を露出させ、必要に応じて、骨柱状メッシュワークを覆う残りの残存虹彩をクリーンアップします。毛様体残骸を後部にトリミングし、組織の薄いバンドを1ミリメートルだけ残します。ペトリ皿に前セグメントを配置した後。綿棒を媒体に湿らし、角膜の中央にやさしく手を出して顔料を取り除きます。鉗子で目を保持し、拭くことによって強結体の周りに余分な顔料を取り除きます。逆立ち前部セグメントを底皿の高い領域の上に置き、角膜が高い領域の中心に残っていることを確認します。クランプリングを新しく配置した前部セグメントの上に置き、Lキーでねじを軽く締めます。Oリングを備えた両方の流体コネクタを、皿の底部のネジ付きポートに取り付けます。最初の流体コネクタには、18ゲージ90度曲がった針ハブ、チューブの長さ、18ゲージ針ハブ、ナイロンシリンジフィルター、三方弁、および媒体で満たされた20ミリメートルの注射器を取り付けます。第2の流体コネクタには、18ゲージ90度曲げ針ハブ、チューブの長さ、18ゲージの針ハブ、第1の流体コネクタのために実証された3方向バルブを取り付け、滅菌10ミリリットルシリンジのバレル部分を取り付け、液体および気泡を捕捉するための貯水池として機能します。3方向バルブをシリンジに対して適切に開いたままにして、最初の流体コネクタポートを使用して、システムを通してメディアを静かに押し込みます。前セグメントを膨らませるには、チューブをメディアで満たし、最終的に貯水池を満たします。優しく皿にメディアを押して泡を取り出し、泡を押し出すために皿を反転します。前セグメントの臓器培養皿を細胞培養器に入れます。チューブラインをインキュベータードアの底面から外に向けて、ドアの開閉に干渉しないようにします。圧力トランスデューサの器械の貯蔵所と管ラインを置く。側面の3方向バルブを、PBSがラインを流れる間に設定された圧力トランスデューサに接続して、気泡がチューブラインに入らないようにします。開いた傷害の誘導のための準備されたバイオ安全キャビネットの内部は直径4.5ミリメートルまでの物に十分な穿刺力を発生させるために1平方インチあたりの50ポンドの力に穿刺プラットホームの圧力調整装置を置く。穿刺プラットフォームの前にあるラボジャックにクロストラッキングバイスを配置します。ピストンアームを最大距離まで延長し、角膜の頂点を穿刺対象の1ミリメートル領域内に配置し、ピストンアームを引き込み、前部セグメントを穿刺対象物に1センチメートル近づけます。穿刺装置を起動するには、デバイスの電源を入れ、デバイスの2番目のスイッチでソレノイドバルブを開きます。目からデバイスを引き込むには、2番目のスイッチを押し、目視検査による適切な傷害誘導と、損傷部位から漏出した媒体を確認します。手術後、角膜上皮の完全性を光学コヒーレン断層撮影を用いたイメージングを介して評価した。負傷した前部セグメント組織は、傷害後すぐに画像化され、72時間後に傷害を受けた。制御された目は角膜に顕著な混乱を示さないが、傷害後に角膜を通して明確な傷害が見つかった。トップダウンの最大強度予測から、怪我の形や大きさが不規則であったことは明らかでしたが、怪我の大きさは72時間にわたって減少しました。手術前の最初の3日間は、受容可能範囲での圧力安定性を判定するために、眼間圧が観察された。代表的な結果では、5つの目のうち3つの眼が許容可能な眼間圧範囲内に入る。開いた地球の損傷および治療介入による眼間圧変化。オープングローブ損傷誘導後、圧力は大幅に減少し、実験が完了するまで低いままでした。ダーマボンド接着剤を用いた負傷組織の治療は、未治療組織と比較して眼間圧の増加をもたらし、これは、この方法が眼内圧を回復するための治療薬の有効性を測定するために使用できることを示している。臓器培養におけるセグメントの初期セットアップは、組織の長期安定性にとって重要である。リングを締め過ぎると、組織にストレスを与え、コンプライアンスを低下させる可能性があります。

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

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オープングローブ損傷と治療性能を追跡するための前セグメント臓器培養プラットフォーム

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