ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法
2021年5月6日
本稿では、ヒト胚性幹細胞(hESC)を、hESC分化中にアクチビンAおよびCHIR99021を確実なエンドドーム(DE)に継続的に補い、機能性肝細胞様細胞(HLC)に分化するための詳細なプロトコルを記述する。
ヒト胚性幹細胞由来肝細胞様細胞は、疾患のモデル化および薬物スクリーニングに有用である。これは、ヒト胚性幹細胞の機能的肝細胞様細胞への分化を効果的に誘導するための効率的で再現性の高い方法です。ヒト胚性幹細胞の未分化状態および適切な合流は、肝細胞様細胞への分化を成功させるために重要である。
幹細胞の維持のために、1Xヒト胚性幹細胞修飾マトリゲル1個のミリリットルを持つ無菌6ウェル組織培養処理プレートをウェルあたりコーティングし、一晩摂氏4度で保存する。プレートは室温で30分間放置してから使用してください。クライオ保存HESEsを37度の水浴で3分間揺らさずに解凍し、すぐに4ミリリットルの事前温められた摂氏37度のmTESR培地を含む15ミリリットルの遠心管にピペットして幹細胞を移管する。
HESEsを遠心分離し、上清を吸引し、mTESR培地の1ミリリットルで細胞を穏やかに再懸濁する。プレートからDMEM F-12培地を吸引する。mTESRの2ミリリットルで5番目の細胞に1 x 10の密度で6ウェルプレートに細胞を播種し、5%の二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。
培地を毎日予熱mTESR培地に置き換えて細胞を維持する。約70〜80%合流で細胞を通過させる、または細胞コロニーが接触し始めるとき。通過する細胞の場合は、培地を吸引し、37°Cで5分間酵素溶液1ウェルあたり1ミリリットルで細胞をインキュベートします。
セルを摂氏37度に予め温めたDMEM F-12の4ミリリットルを含む15ミリリットルの遠心分離管にピペット化して移管する。24ウェルプレートを250マイクロリットルの1x hESC修飾マトリゲル培地でコーティングして準備します。500マイクロリットルのmTESR培地で1〜10倍の密度で5番目の細胞を500マイクロリットルで播種する。
両方のアクチビンAを1ミリリットル当たり100ナノグラムの最終濃度に加え、CHIR99021を適切な体積の予熱ステージ1分化基本培地で3マイクロモルの最終濃度に加える。分化の3日後、分化細胞は、FOXA2、SOX17、GATA4、CXCR4、およびFOXA1のような決定的な内胚細胞のマーカーを発現すべきである。3日目の分化時に、培地を吸引し、ステージ2培地に交換し、24時間インキュベートする。
4日目から8日目に、1日おきにメディアを変更します。8日間の分化後、分化した細胞は、HNF4アルファ、AFP、TBX3、TTR、ALB、NTCP、CEBPAなどの肝前駆細胞の適切なマーカーを発現するべきである。8日目に、ステージ2培地を細胞から吸引し、ステージ3培地に置き換える。
細胞が二酸化炭素インキュベーターで摂氏37度で10日間インキュベートし、1日おきに新たに添加された分化因子で培地を交換することを可能にする。分化の18日後、分化細胞は、例えばAAT、ALB、TTR、HNF4アルファ、NTCP、ASGR1、CYP3A4などの肝細胞の特徴的なマーカーを発現すべきである。hESCからの肝細胞様細胞の概略図と各分化段階の明視野画像を示す。
ステージ1では、殺菌剤AおよびCHIR99021を3日間添加し、幹細胞を誘導して内胚葉細胞を形成した。ステージ2では、内胚葉細胞は5日間分化培地で処理された後、肝前駆細胞に分化した。ステージ3では、10日後、初期肝細胞は成熟し、肝細胞増殖因子およびオンコスタチンにおいて肝細胞様細胞に分化した。
分化の最終段階では、細胞は典型的な肝細胞表現型を示した。RT-PCR、免疫蛍光染色、およびウェスタンブロッティングを使用して、内胚葉細胞、肝前駆細胞、および成熟肝細胞のマーカーを検出した。分化した細胞は、3日目の内胚葉マーカーSOX17、8日目の肝前駆体マーカーHNF4アルファ、14日目のAFP、18日目の成熟肝細胞マーカーALBなど、各段階で分化関連遺伝子およびタンパク質の高い発現レベルを示した。
HLCは緑色染色と広範な細胞質酸シフト染色を示した。肝細胞は典型的な二核形態を示した。CYP3A4の酵素活性は、HLCsにおける肝臓における必須の代謝CYPであり、酵素アッセイで確認された。
ヒト胚性幹細胞を適切な密度で座り、次の日に分化を開始することが重要である。ステージ1では、細胞が浮かび上がりやすいので、メディアに優しく触れます。アクチビンAと他の小分子の組み合わせは、分化効率をさらに向上させ、この手順でより成熟した肝細胞様細胞を産生する可能性がある。
この技術は、肝細胞移植、肝臓組織工学、生物人工肝臓、および疾患モデリングを探求するためのプラットフォームを提供することができる。
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概要
この原稿は、アクチビンAとCHIR99021を使用して、ヒト胚性幹細胞（hESC）を機能的な肝細胞様細胞（HLC）に分化させるための詳細なプロトコルを説明しています。この方法は、分化を成功させるために、hESCの未分化状態と適切な接合を維持することの重要性を強調しています。
主要な研究要素
科学分野
- 幹細胞生物学
- 肝細胞分化
- 細胞培養技術
背景
- ヒト胚性幹細胞は様々な細胞タイプに分化できます。
- 肝細胞様細胞は疾患モデリングと薬物スクリーニングに有用です。
- hESCの未分化状態を維持することは、成功的な分化のために重要です。
- 最適な幹細胞維持には特定の培養条件が必要です。
研究目的
- hESCをHLCに分化する再現可能な方法を提供すること。
- 成功的な分化に必要な重要なステップと条件を概説すること。
- 研究応用におけるhESC由来HLCの有用性を高めること。
使用した方法
- 幹細胞維持のためにマトリゲルで組織培養プレートをコーティングすること。
- 凍結保存されたhESCを管理された方法で解凍すること。
- 分化培地にアクチビンAとCHIR99021を補充すること。
- プロセス全体を通じて細胞の接合と未分化状態をモニタリングすること。
主要な結果
- このプロトコルは、hESCを機能的なHLCに効率的に分化するのに役立ちます。
- 適切な培養条件を維持することが成功のために不可欠です。
- 生成されたHLCは様々な生物医学応用に使用できます。
- この方法は再現可能で、異なる研究ニーズに適応できます。
結論
- この研究は、hESCから肝細胞様細胞を生成するための信頼できるプロトコルを提示しています。
- 将来の応用には薬物試験と疾患モデリングが含まれる可能性があります。
- プロトコルのさらなる最適化により、分化効率を高めることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
This protocol enables reproducible generation of functional hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells, providing a scalable platform for liver disease modeling and hepatotoxicity screening in early drug discovery. By defining a stagewise differentiation process with Activin A and CHIR99021, the method supports mechanistic de-risking of hepatic targets and predictive assessment of compound metabolism. The resulting HLCs express key hepatocyte markers and demonstrate functional CYP3A4 activity, enabling translational continuity from target validation to preclinical safety evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of hepatic pathways and target engagement in a human-relevant cellular context.
- Operational Value: Provides a renewable source of HLCs for consistent target validation assays across projects.
- Predictive Value: Supports early assessment of compound-induced hepatotoxicity and metabolic liability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers HLCs with stable expression of albumin, HNF4α, and NTCP for reliable biomarker-based assay development.
- Operational Value: Enables standardized, reproducible plating and differentiation for high-throughput screening compatibility.
- Predictive Value: Facilitates quantitative readouts such as CYP3A4 activity and ICG staining for mechanism-based screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models human liver physiology for disease-relevant systems in vitro, supporting mechanistic de-risking.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical workflows through stage-specific marker expression (e.g., AFP, HNF4α, ALB).
- Predictive Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating in vitro HLC responses with clinical hepatotoxicity outcomes.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical safety assessment, offering a defined system for hepatic liability profiling.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of hepatic targets via stage-specific differentiation and marker expression analysis.
- Screening: Delivers assay-ready HLCs with reproducible morphology and function for compound library screening.
- Analytics: Enables quantitative measurement of dependent variables such as albumin secretion, glycogen storage, and CYP3A4 activity.
- Translational Research: Provides continuity from hepatic progenitor cells to mature HLCs, aligning with preclinical biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Defined reagent system allows scalable, cross-project reuse in hepatocyte-based assay platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in hepatotoxicity prediction through functional HLC models.
- Operational Value: Ensures reproducibility via completely defined, stagewise differentiation protocol.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early detection of liver-related safety signals.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on hepatic metabolism and toxicity profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell culture and differentiation techniques.
- Dependent on consistent supply of Activin A, CHIR99021, and defined differentiation media.
- Necessitates standardization of seeding density and confluence monitoring across teams.
- Requires adaptation considerations when extending to disease-model-specific genetic backgrounds.
- Practical limitation: differentiation timeline spans 18 days, requiring long-term culture commitment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:45
Stem Cell Maintenance
2:28
Stem Cell Passage and Differentiation and Definitive Endoderm Formation
3:46
Differentiation of Hepatic Progenitor Cells and Hepatocyte Differentiation
5:12
Results: Directed Hepatocyte-like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells
7:14
Conclusion
