Name: 時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: 学ぶ時間分解単一分子蛍光増強法を用いてαシヌクレインの局所構造を解析する手法。この技術は神経変性疾患研究においてタンパク質動態を解明する上で重要なツールとなる。

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A56C α-Syn変異体をコードするpT-t7プラスミドは、アサフ・フルピ博士、ダン・アミール博士、エリシャ・ハース博士からのプレゼントとして私たちに与えられました。この論文は、国立衛生研究所(NIH、サブアワードとしてE.L.にR01 GM01 GM130942を付与)、イスラエル科学財団(キルコロナ - コロナウイルス研究プログラムの抑制内で3565/20を付与)、ミルナー基金、エルサレムヘブライ大学(スタートアップ資金)によって支持されました。

すべての著者は利益相反を共有していません。

広範な生化学的および生物物理学的研究は、α-Synとその無秩序な性質33、34、35、36、37、38の構造的特徴を研究するために行われた。すでに自由に拡散するsmFRETを利用して、結合のないα-Synモノマーの分子内ダイナミクスを調べるいくつかの作品が既に存在しています。これらの作品は、α-Synの高い動的不均一性を報告し、これは共焦点を通る典型的な拡散時間内の複数の異なる構造種の平均化をもたらし、単一のFRET集団39,40の出現をもたらす。しかし、smFRET測定は、3〜10nm以内に発生する色素間距離の変化、α-Synな...

過去20年間にわたり、単一分子蛍光ベースの方法は、生体分子1、2を測定するための強力なツールとなっており、異なる生体分子パラメータがどのように分布し、これらのパラメータの異なるサブ集団間でこれらのパラメータの異なるサブ集団間でどのように動的に相互変換するかを探究する3、4、5。これらの技術のパラメータは、FRET測定におけるエネルギー伝達効率6、7、蛍光異方性8、9、蛍光量子収率および寿命10、11、異なる蛍光クエンチング12または増強13機構の関数として含まれる。タンパク質誘導蛍光増強(PIFE)14としてよく知られているこれらのメカニズムの1つは、色素14、15、16、17、18、18の近傍のタンパク質表面によって引き起こされる励起状態の蛍光性の自由異性化に対する立体閉塞の機能として、蛍光量子収量および寿命の増強を導入する.FRETとPIFEは、測定されたパラメータが測定中の標識された生体分子内の空間的尺度に直接リンクされているため、分光定規または近接センサーと見なされます。FRET効率は、3〜10 nm20の範囲内の一対の色素間の距離に関連しているが、PIFEは0〜3nm19の範囲で色素と近くのタンパク質の表面との間の距離に関連する蛍光量子収量または寿命の増加を追跡する。
単一分子FRETは、α-シヌクレイン(α-Syn)22など、本質的に障害を持つタンパク質(IDP)21を含む多くの異なるタンパク質系に構造的な洞察を提供するために広く使用されている。α-Synは、異なる生体分子に結合し、異なる条件下で23、24、25、26、27、28、29、30の順序構造を形成することができます。しかし、非結合の場合、α-Synモノマーは、急速に結合する立体31,32との高い立体異質性を特徴とする。
α-Synの立体構造は、このような高度に不均一かつ動的なタンパク質系の立体ダイナミクスを同定するのに役立つ様々な異なる技術を用いて以前に研究されてきた33,34,35,36, 37,38,39.興味深いことに、バッファー内のα-Synの単一分子FRET(smFRET)測定は、単一のFRET集団39,40を報告し、コンフォーカルスポットを介したα-Synの典型的な拡散時間よりもはるかに速く動的に変換されるコンフォメーションの時間平均化の結果である(典型的な拡散時間よりも速い時間、ミリ秒時間に比べて)。 41.しかし、3-10 nm距離感度を有するFRET分光定規を用いて、α-Synのような小さなタンパク質の全体的な構造変化についてしか報告しないこともある。距離感度の低い分光近接センサを利用した単一分子計測は、局所構造のダイナミクスを報告する可能性を秘めています。本明細書では、α-Synの単一分子PIFE測定を行い、蛍光寿命の異なるサブ集団を特定し、それらの間の遷移を100ミリ秒と遅くして異なる局所構造にマッピングする。この研究は、緩衝剤中および短距離単一分子分光近接センサとしてSDSベースの膜に結合した場合に、一度に1つずつ、自由に拡散するα-Syn分子の時間分解smPIFE測定を要約する。

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra-15 遠心フィルターユニット</td><td>Merc</td><td>C7715</td><td>カットオフ: 100 kDa</td></tr><tr><td>硫酸アンモニウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4418</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>システアミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>30070</td><td></td></tr><tr><td>透析バッグ - MEGA GeBaFlex-tube</td><td>Gene Bio-Application</td><td>MEGA320</td><td></td></tr><tr><td>ジチオスレイトール (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Fast SeeBand 染色液</td><td>Gene Bio-Application</td><td>SB050</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>50046</td><td></td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap 脱塩 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GE17-1408</td><td></td></tr><tr><td>6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸 (TROLOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-d-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5502</td><td></td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>マグネシウム塩化物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td></td></tr><tr><td>MonoQ カラム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>54807</td><td></td></tr><tr><td>タンパク質 LoBind チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EP0030108094</td><td>0.5 mL</td></tr><tr><td>すすぎ &micro;-slide 18</td><td>同上</td><td>81816</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>水酸化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム 一塩基性一水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71507</td><td></td></tr><tr><td>滅菌細胞スプレッダー、Drigalski spulas</td><td>mini-plast</td><td>815-004-05-001</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトマイシン硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9137</td><td></td></tr><tr><td>sulfo-Cy3&nbsp;マレイミド</td><td>abcam</td><td>ab146493</td><td></td></tr>トリ<tr><td>ス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>75259</td><td></td></tr><tr><td>トリスアル</td>ド<td>リッチ</td><td>93363</td><td></td></tr>トリ<tr><td>プトン</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>T7293</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>Y1625</td><td></td></tr></tbody></table>

時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

分光定規を使用して単一の生体分子の複数の立体構造とそのダイナミクスを追跡することは、構造ダイナミクスの理解と生物学への貢献に革命をもたらしています。FRETベースの定規は3〜10nmの範囲の色間距離について報告するが、タンパク質誘発蛍光増強(PIFE)のような他の分光技術は、色素とタンパク質表面の間の近接性についてより短い0〜3nmの範囲で報告する。選択方法に関係なく、自由に拡散する生体分子を一度に1つずつ測定する際の使用は、実験パラメータのヒストグラムを取り出し、各サブ集団がミリ秒以内に変化しない単一の立体構造、またはミリ秒よりもはるかに速く変換する複数の立体構造を表す実験パラメータのヒストグラムを取得します。ヒストグラム中で報告されたパラメータが色素間FRET効率である単一分子FRETでは、バッファー内のα-Synucleinモノマーのような本質的に障害を持つタンパク質が、急速に相互変換する複数の立体構造の単一の平均アウトサブ集団を示していると以前に報告された。これらの過去の知見はFRETベースの定規の3〜10nmの範囲に依存するが、我々は一度に1つずつサイト特異的なsCy3標識αシヌクレインタンパク質の蛍光寿命を追跡する単一分子PIFEを使用してこのタンパク質を試験に入れようとした。興味深いことに、この短い範囲分光近接センサを使用して、sCy3ラベルα-Synucleinは、10〜100 msで相互変換する明らかに異なる平均寿命を有するいくつかの生涯サブ集団を示す。これらの結果は、α-シヌクレインが世界的に乱れるかもしれないが、それにもかかわらず安定した局所構造を達成することを示している。要約すると、この研究では、局所的またはグローバルな構造変化を一度に1つの生体分子で追跡する異なる分光近接センサーを使用することの利点を強調する。

IDPとして、別の生体分子に結合していない場合、α-Synは、数マイクロ秒40、さらには数百ナノ秒41での遷移を伴う複数の立体間の構造ダイナミクスを示す。α-Synが共焦点を越えるとき、それは立体構造間の何千もの遷移を受けるかもしれません。確かに、これはsmFRETが39、40を使用した場合でした。ここでは、α-Synの局所的な立体構造ダイナミクスをプローブするためにsmPIFE測定を行います。
測定記録は、スルホ-Cy3(sCy3)色素から放出される蛍光光子、α-Syn A56C変異体中のシステインのチオール基に結合した。sCy3フルオロフォアは、励起状態にあるときに異性化を受けることができます。しかし、sCy3は トランス 異性体から脱興奮すると光子を放出する。したがって、sCy3励起状態異性体化を何も立体的に妨害しなければ、平均して少ない光子を放出...

時間分解された単一分子タンパク質誘導蛍光増強は、タンパク質の局所的な構造変化に敏感な蛍光分光性近接センサとして有用である。ここでは、より長い範囲のFRET定規を使用して測定した場合、球状に非構造化および不安定として知られているα-Synucleinの安定した局所的な立体構造を発見するために使用できることを示す。

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...

単一分子、タンパク質誘発蛍光増強は、タンパク質構造亜集団および立体構造を研究する際、特に異なる構造部分集団が安定した局所構造について報告する場合に、単一分子FRET測定を補完することができる。この技術の主な利点は、色素標識部位の近傍に基づいて、タンパク質表面に対する別個の部位特異的な構造サブ集団を捕捉することです。単一分子、タンパク質誘導蛍光増強は、関心のあるあらゆる生体分子系に適用され、別個の局所的な構造サブ集団を探査することができます。まず、低タンパク質結合チューブ内の測定バッファーに25ピコモラースルホ-Cy3標識α-シヌクレインを調製します。18室の顕微鏡カバースライドに1ミリグラム1ミリグラムの1ミリリットルを加え、1分間インキュベートし、BSAを廃棄します。カバースリップスライドのチャンバーに25ピコモラルスルフォ-Cy3標識α-シヌクレインサンプルの100マイクロリットルを追加します。次に、データ取得のために、高数値開口水浸漬対物レンズの上部に超純水の滴を加え、ステージチャンバーにカバースリップスライドを固定し、次に顕微鏡ステージの上部にアセンブリを設置します。カバースリップスライドの底にある対物レンズの上の水滴が塗りつぶされるまで、対物レンズを上に持ち上げ、レーザーシャッターを開きます。対物レンズが上方に移動したら、CCDカメラの風通しの良いリングのパターンを調べます。最初のリングは水/ガラスのインターフェイスで焦点を表し、2 番目のリングはガラスとサンプル溶液の間のインターフェイスでの焦点を表します。対物レンズの高さを75マイクロメートルずつ高くし、カバースリップのガラス表面からの自家蛍光を最小限に抑えるために、レーザーフォーカスを溶液の奥深くに持ち込みます。対物レンズでレーザーパワーを約100マイクロワットで調整します。事前定義された時間に検出されたフォトンの取得を開始します。Jupyter ノートブックを開き、サンプル ノートブックを開きます。FRETBursts とフォトン HDF5 データ ファイルを読み込みます。インターフォトン時間のヒストグラムを使用して、データ取得の 30 秒ごとにバックグラウンド レートを計算します。連続するフォトンを1つのフォトンのタイムウィンドウを連続して移動し、瞬時の光子レートFがデータ取得のその期間のバックグラウンドレートよりも少なくとも11倍大きい場合は、フォトンデータを収集します。バースト内のバーストサイズとフォトンの量、バースト時間、バーストの最後と最初のフォトン検出時間の時間差、バースト輝度、バーストの瞬間フォトンレートの最大値、バースト分離、連続バースト間の時間間隔を計算します。イベント軸を対数スケールで使用してバースト輝度値のヒストグラムをプロットします。バースト輝度しきい値を、ヒストグラムが減衰パターンを示す最小バースト輝度値として定義し、バースト輝度しきい値よりも大きい輝度値を持つバーストを選択します。バースト平均蛍光寿命測定では、選択したバースト内のすべての光子のフォトンナノタイムのヒストグラムを、フォトンカウント軸を対数スケールでプロットします。ナノ時間閾値を、光子ナノ時間のヒストグラムが減衰パターンを示す最小ナノタイム値として定義する。ナノタイムしきい値よりナノ倍大きい光子のみを選択します。選択した全てのフォトンナノタイムの代数平均を計算する。光子ナノ時間代数平均からナノタイム閾値を差し引く。得られた値は、バーストの平均光子ナノ時間であり、平均蛍光寿命に直接比例する。全バースト平均蛍光寿命のヒストグラムをプロットします。蛍光寿命の中央分布サブ集団が出現する可能性がある。低値平均を持つ亜集団は、体学的に妨害されなかったSulfo-Cy3を有する分子種を表し、より高い値の平均を有する亜集団は、より立体的に妨害されたS-Cy3を有する分子種を表す。低速のバースト間のダイナミクス評価では、バースト分離時間のヒストグラムを対数スケールで分離時間軸でプロットします。同一分子部分集団を定義する最大分離時間より短い範囲で分離された連続バーストのすべてのペアを保存する場合に選択します。一定の分離時間しきい値を下回るバーストのすべてのペアについて、最初と2番目のバーストの平均蛍光寿命のヒストグラムまたは散布図をプロットします。S-Cy3標識されたα-シヌクレイン-56分子の単一の平均蛍光寿命のヒストグラムは、最初の亜集団が1.6ナノ秒の特徴的な蛍光寿命を有し、56の残渣近傍にタンパク質表面が少ないα-シヌチン立体状態を表すことを示した。第2の亜集団は、3.5ナノ秒の特徴的な蛍光寿命を有し、残基56の近傍でより多くのタンパク質表面を有するα-シヌクレイン立体構造状態を表す。α-シヌクレイン分子の非アミロイドベータ成分セグメントは、SDS小胞に結合する際にヘリカルなヘアピン構造を採用することが知られており、これは、特徴的な寿命が約3ナノ秒の単一の花相寿命集団として確認され、特徴的寿命が1.6ナノ秒のサブ集団の不在である。連続した単一分子バースト間の分離時間のヒストグラムは、1番目と2番目のバーストが同じ分子から生じる100ミリ秒よりも速い分離時間の繰り返し分子を報告する。すべての単一分子バーストの平均蛍光寿命ヒストグラムは、短い特徴的寿命を有する亜集団を示しただけでなく、長い特徴的な寿命を有し、個々の分子がバースト期間よりも遅い異なる平均生涯値間の遷移を受ける可能性があることを示した。バースト分離時間はせいぜい100ミリ秒以内に、短寿命亜集団で最初のバーストとして始まり、生涯の亜集団内で第2のバーストとして繰り返される分子のほんの一部があった。長寿命の亜集団で最初のバーストとして始まり、短寿命の集団内で2番目のバーストとして繰り返された分子の割合は、10〜100ミリ秒以内の2つの亜集団間の移行を示しています。実験結果を分析する際に覚えておくべきことは、単一分子蛍光信号をバックグラウンドから適切に分離し、十分な光子ナノタイムでバーストを分析することです。smPIFEの開発は、研究者が単一分子レベルで核酸タンパク質相互作用を探求する道を開いた。この進歩は、タンパク質内の局所的な構造ダイナミクスを研究するための基礎を築きます。

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