時間分解タンパク質誘導蛍光強化を利用して、一度に1つのαシヌクレインモノマーの安定した局所構造を同定する

単一分子、タンパク質誘発蛍光増強は、タンパク質構造亜集団および立体構造を研究する際、特に異なる構造部分集団が安定した局所構造について報告する場合に、単一分子FRET測定を補完することができる。この技術の主な利点は、色素標識部位の近傍に基づいて、タンパク質表面に対する別個の部位特異的な構造サブ集団を捕捉することです。単一分子、タンパク質誘導蛍光増強は、関心のあるあらゆる生体分子系に適用され、別個の局所的な構造サブ集団を探査することができます。

まず、低タンパク質結合チューブ内の測定バッファーに25ピコモラースルホ-Cy3標識α-シヌクレインを調製します。18室の顕微鏡カバースライドに1ミリグラム1ミリグラムの1ミリリットルを加え、1分間インキュベートし、BSAを廃棄します。カバースリップスライドのチャンバーに25ピコモラルスルフォ-Cy3標識α-シヌクレインサンプルの100マイクロリットルを追加します。

次に、データ取得のために、高数値開口水浸漬対物レンズの上部に超純水の滴を加え、ステージチャンバーにカバースリップスライドを固定し、次に顕微鏡ステージの上部にアセンブリを設置します。カバースリップスライドの底にある対物レンズの上の水滴が塗りつぶされるまで、対物レンズを上に持ち上げ、レーザーシャッターを開きます。対物レンズが上方に移動したら、CCDカメラの風通しの良いリングのパターンを調べます。

最初のリングは水/ガラスのインターフェイスで焦点を表し、2 番目のリングはガラスとサンプル溶液の間のインターフェイスでの焦点を表します。対物レンズの高さを75マイクロメートルずつ高くし、カバースリップのガラス表面からの自家蛍光を最小限に抑えるために、レーザーフォーカスを溶液の奥深くに持ち込みます。対物レンズでレーザーパワーを約100マイクロワットで調整します。

事前定義された時間に検出されたフォトンの取得を開始します。Jupyter ノートブックを開き、サンプル ノートブックを開きます。FRETBursts とフォトン HDF5 データ ファイルを読み込みます。

インターフォトン時間のヒストグラムを使用して、データ取得の 30 秒ごとにバックグラウンド レートを計算します。連続するフォトンを1つのフォトンのタイムウィンドウを連続して移動し、瞬時の光子レートFがデータ取得のその期間のバックグラウンドレートよりも少なくとも11倍大きい場合は、フォトンデータを収集します。バースト内のバーストサイズとフォトンの量、バースト時間、バーストの最後と最初のフォトン検出時間の時間差、バースト輝度、バーストの瞬間フォトンレートの最大値、バースト分離、連続バースト間の時間間隔を計算します。

イベント軸を対数スケールで使用してバースト輝度値のヒストグラムをプロットします。バースト輝度しきい値を、ヒストグラムが減衰パターンを示す最小バースト輝度値として定義し、バースト輝度しきい値よりも大きい輝度値を持つバーストを選択します。バースト平均蛍光寿命測定では、選択したバースト内のすべての光子のフォトンナノタイムのヒストグラムを、フォトンカウント軸を対数スケールでプロットします。

ナノ時間閾値を、光子ナノ時間のヒストグラムが減衰パターンを示す最小ナノタイム値として定義する。ナノタイムしきい値よりナノ倍大きい光子のみを選択します。選択した全てのフォトンナノタイムの代数平均を計算する。

光子ナノ時間代数平均からナノタイム閾値を差し引く。得られた値は、バーストの平均光子ナノ時間であり、平均蛍光寿命に直接比例する。全バースト平均蛍光寿命のヒストグラムをプロットします。

蛍光寿命の中央分布サブ集団が出現する可能性がある。低値平均を持つ亜集団は、体学的に妨害されなかったSulfo-Cy3を有する分子種を表し、より高い値の平均を有する亜集団は、より立体的に妨害されたS-Cy3を有する分子種を表す。低速のバースト間のダイナミクス評価では、バースト分離時間のヒストグラムを対数スケールで分離時間軸でプロットします。

同一分子部分集団を定義する最大分離時間より短い範囲で分離された連続バーストのすべてのペアを保存する場合に選択します。一定の分離時間しきい値を下回るバーストのすべてのペアについて、最初と2番目のバーストの平均蛍光寿命のヒストグラムまたは散布図をプロットします。S-Cy3標識されたα-シヌクレイン-56分子の単一の平均蛍光寿命のヒストグラムは、最初の亜集団が1.6ナノ秒の特徴的な蛍光寿命を有し、56の残渣近傍にタンパク質表面が少ないα-シヌチン立体状態を表すことを示した。

第2の亜集団は、3.5ナノ秒の特徴的な蛍光寿命を有し、残基56の近傍でより多くのタンパク質表面を有するα-シヌクレイン立体構造状態を表す。α-シヌクレイン分子の非アミロイドベータ成分セグメントは、SDS小胞に結合する際にヘリカルなヘアピン構造を採用することが知られており、これは、特徴的な寿命が約3ナノ秒の単一の花相寿命集団として確認され、特徴的寿命が1.6ナノ秒のサブ集団の不在である。連続した単一分子バースト間の分離時間のヒストグラムは、1番目と2番目のバーストが同じ分子から生じる100ミリ秒よりも速い分離時間の繰り返し分子を報告する。

すべての単一分子バーストの平均蛍光寿命ヒストグラムは、短い特徴的寿命を有する亜集団を示しただけでなく、長い特徴的な寿命を有し、個々の分子がバースト期間よりも遅い異なる平均生涯値間の遷移を受ける可能性があることを示した。バースト分離時間はせいぜい100ミリ秒以内に、短寿命亜集団で最初のバーストとして始まり、生涯の亜集団内で第2のバーストとして繰り返される分子のほんの一部があった。長寿命の亜集団で最初のバーストとして始まり、短寿命の集団内で2番目のバーストとして繰り返された分子の割合は、10〜100ミリ秒以内の2つの亜集団間の移行を示しています。

実験結果を分析する際に覚えておくべきことは、単一分子蛍光信号をバックグラウンドから適切に分離し、十分な光子ナノタイムでバーストを分析することです。smPIFEの開発は、研究者が単一分子レベルで核酸タンパク質相互作用を探求する道を開いた。この進歩は、タンパク質内の局所的な構造ダイナミクスを研究するための基礎を築きます。