Name: マルチモーダル相変化ポルフィリン滴の合成と特性解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-10-15T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
Description: 学ぼう、マルチモーダル相変化ポルフィリン滴の合成と特性解析の手法を。冷却と撹拌のみで微細気泡を滴に凝縮し、透明性の変化で形成を確認する簡便なプロトコルを解説します。

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著者らは、ガス交換器の建設を支援してくれたブランドン・ヘルフィールド博士と、技術的な議論のためにミフィー・ホク・ヤン・チェン博士に感謝したいと思います。著者らは、オンタリオ大学奨学金、カナダ保健研究所、テリーフォックス研究所、プリンセスマーガレットがん財団の資金源に感謝したいと考えています。

<ol><li>Gramiak, R., Shah, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Echocardiography+of+the+aortic+root%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Radiology%22%5BJournal%5D)">Echocardiography of the aortic root.</a> Investigative Radiology. 3 (5), 356-366 (1968).</li>
<li>Ferrara, K., Pollard, R., Borden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound+microbubble+contrast+agents%3A+fundamentals+and+application+to+gene+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Ultrasound microbubble contrast agents: fundamentals and application to gene and drug delivery.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 9, 415-447 (2007).</li>
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<li>Helfield, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+accumulation+of+submicron+phase-change+droplets+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Investigating the accumulation of submicron phase-change droplets in tumors.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 49 (10), 2891(2020).</li>
<li>Sheeran, P. S., Luois, S. H., Mullin, L. B., Matsunaga, T. O., Dayton, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+ultrasonically-activatable+nanoparticles+using+low+boiling+point+perfluorocarbons%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Design of ultrasonically-activatable nanoparticles using low boiling point perfluorocarbons.</a> Biomaterials. 33 (11), 3262-3296 (2012).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+generating+submicrometer+phase-shift+perfluorocarbon+droplets+for+applications+in+medical+ultrasonography%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Ultrasonics%2C+Ferroelectrics%2C+and+Frequency+Control%22%5BJournal%5D)">Methods of generating submicrometer phase-shift perfluorocarbon droplets for applications in medical ultrasonography.</a> IEEE Transactions on Ultrasonics, Ferroelectrics, and Frequency Control. 64 (1), 252-263 (2016).</li>
<li>Yoo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+encapsulation+on+in+vitro+and+in+vivo+performance+of+volatile+nanoscale+phase-shift+perfluorocarbon+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of encapsulation on in vitro and in vivo performance of volatile nanoscale phase-shift perfluorocarbon droplets.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 44 (8), 1836-1852 (2018).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided+ultrasound+characterization+of+volatile+sub-micron+phase-shift+droplets+in+the+20-40+MHz+frequency+range%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Image-guided ultrasound characterization of volatile sub-micron phase-shift droplets in the 20-40 MHz frequency range.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 42 (3), 795-807 (2016).</li>
<li>Sheeran, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+bubbles%3A+creating+phase-shift+droplets+from+commercially+available+ultrasound+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">More than bubbles: creating phase-shift droplets from commercially available ultrasound contrast agents.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (2), 531-540 (2017).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+drug+delivery+with+focused+ultrasound-induced+blood-brain+barrier+opening+using+acoustically-activated+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Targeted drug delivery with focused ultrasound-induced blood-brain barrier opening using acoustically-activated nanodroplets.</a> Journal of Controlled Release. 172 (3), 795-804 (2013).</li>
<li>Wu, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focused+ultrasound-facilitated+brain+drug+delivery+using+optimized+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Focused ultrasound-facilitated brain drug delivery using optimized nanodroplets.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (3), 035002(2018).</li>
<li>Lee, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasound-enhanced+siRNA+delivery+using+magnetic+nanoparticle-loaded+chitosan-deoxycholic+acid+nanodroplets%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Healthcare+Materials%22%5BJournal%5D)">Ultrasound-enhanced siRNA delivery using magnetic nanoparticle-loaded chitosan-deoxycholic acid nanodroplets.</a> Advanced Healthcare Materials. 6 (8), 1601246(2017).</li>
<li>Cao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+release+from+phase-changeable+nanodroplets+triggered+by+low-intensity+focused+ultrasound%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Drug release from phase-changeable nanodroplets triggered by low-intensity focused ultrasound.</a> Theranostics. 8 (5), 1327-1339 (2018).</li>
<li>Huynh, E., Jin, C. S., Wilson, B. C., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregate+enhanced+trimodal+porphyrin+shell+microbubbles+for+ultrasound%2C+photoacoustic%2C+and+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Aggregate enhanced trimodal porphyrin shell microbubbles for ultrasound, photoacoustic, and fluorescence imaging.</a> Bioconjugate Chemistry. 25 (4), 796-801 (2014).</li>
<li>Zheng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-density+lipoprotein+reconstituted+by+pyropheophorbide+cholesteryl+oleate+as+target-specific+photosensitizer%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Low-density lipoprotein reconstituted by pyropheophorbide cholesteryl oleate as target-specific photosensitizer.</a> Bioconjugate Chemistry. 13 (3), 392-396 (2002).</li>
<li>Dhaliwal, A., Zheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+accessibility+of+EPR-insensitive+tumor+phenotypes+using+EPR-adaptive+strategies%3A+Designing+a+new+perspective+in+nanomedicine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Improving accessibility of EPR-insensitive tumor phenotypes using EPR-adaptive strategies: Designing a new perspective in nanomedicine delivery.</a> Theranostics. 9 (26), 8091-8108 (2019).</li>
<li>Goertz, D. E., de Jong, N., vander Steen, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+and+size+distribution+measurements+of+Definity+and+manipulated+Definity+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Ultrasound+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Attenuation and size distribution measurements of Definity and manipulated Definity populations.</a> Ultrasound in Medicine and Biology. 33 (9), 1376(2007).</li>
<li>Pellow, C., Acconcia, C., Zheng, G., Goertz, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Threshold-dependent+nonlinear+scattering+from+porphyrin+nanobubbles+for+vascular+and+extravascular+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+in+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Threshold-dependent nonlinear scattering from porphyrin nanobubbles for vascular and extravascular applications.</a> Physics in Medicine and Biology. 63 (21), 215001(2018).</li>
<li>Kwan, J. J., Borden, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+monolayer+collapse+and+microbubble+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Colloid+and+Interface+Science%22%5BJournal%5D)">Lipid monolayer collapse and microbubble stability.</a> Advances in Colloid and Interface Science. 183, 82-99 (2012).</li>
<li>Overchuk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtherapeutic+Photodynamic+Treatment+Facilitates+Tumor+Nanomedicine+Delivery+and+Overcomes+Desmoplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Subtherapeutic Photodynamic Treatment Facilitates Tumor Nanomedicine Delivery and Overcomes Desmoplasia.</a> Nano Letters. 21 (1), 344-352 (2021).</li>
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<li>Periyasamy, P. C., Leijten, J. C. H., Dijkstra, P. J., Karperien, M., Post, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomaterials+for+the+local+and+targeted+delivery+of+osteoarthritis+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nanomaterials%22%5BJournal%5D)">Nanomaterials for the local and targeted delivery of osteoarthritis drugs.</a> Journal of Nanomaterials. 2021, 1-13 (2012).</li>
<li>Matsumura, Y., Maeda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+concept+for+macromolecular+therapeutics+in+cancer+chemotherapy%3A+mechanism+of+tumoritropic+accumulation+of+proteins+and+the+antitumor+agent+smancs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs.</a> Cancer Research. 46 (12), 6387-6392 (1986).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

超音波画像は、音響波を利用する医療画像の非侵襲的な非イオン化形態です。超音波スキャナはよりポータブルでリアルタイムの画像を提供できますが、超音波画像は低コントラストに苦しむ可能性があり、ソノグラファーが同様にエコー原性の病理学的特徴を確実に区別することは困難です。この制限に対抗するために、マイクロバブルを宿主に注入して血管のコントラストを改善することができる。マイクロバブルは、マイクロンサイズのガス充填造影剤であり、音響波に対して高いエコー原性を有し、血管のコントラストを強化することができる1,2である。マイクロバブルのシェルおよびガスコアは、イメージング、血栓溶解、細胞膜透過化、または過渡血管開口部2のような異なる用途に合わせて調整することができる。
マイクロバブルの欠点は、その短い循環半減期です。例えば、臨床的に入手可能な過フルトレン脂質微小球は、半減期が1.3分3.長いイメージングセッションでは、マイクロバブルの複数の注入が必要です。マイクロバブルのもう一つの欠点は、その大きな直径です。パーフルトレン脂質微小球は直径が1~3μm程度であるが、血管系で循環するのに十分小さいが、腫瘍4のような目的の組織に飛散し、受動的に蓄積するには大き過ぎである。これらの制限を克服するための1つの戦略は、気体マイクロバブルをより小さい液体コア液滴5,6に凝縮することです。液滴は液体状態ではエコー原性ではありませんが、十分に高いピーク陰圧で超音波に曝露するとマイクロバブルに気化し、コントラストを提供する能力を取り戻すことができます。これにより、液滴は、小さな液体コアのより有利な薬物動態を利用することができ、内振した場合に対照を提供する能力を保持しながら、化学組成4、7を変更しない。
デカフルオロブタンは、気体状態と液体状態5、6、7の間で相転移を行うのに理想的なパーフルオロカーボン化合物である。デカフルオロブタンは、マイクロバブルを温度低下だけで液滴に凝縮することを可能にするが、一方、より密度の低いパーフルオロカーボンは追加の加圧5を必要とする。この穏やかな方法は結露7、8、9の間に気泡の破壊を最小にする。そのコアは液体であるとして、液滴は非エコー原性であり、超音波には見えない。しかし、十分な音響エネルギーまたは熱エネルギーの適用により、液体コアは気体状態に戻って気化し、エコー原性マイクロバブル8を発生させることができる。この気化により、マイクロバブルを生成するタイミングと場所を制御できます。
液滴は受動的蓄積に有用であるが、その際に気化、または細胞透過性を改善する4において、液滴(およびそれらの断片)を画像化または定量化することは不可能である。したがって、蛍光4、10、11、磁性粒子12、光学吸収剤13などの定量可能なコンパニオン診断剤が、目的の組織への液滴送を測るアナログとして利用される。例えば、Helfieldらは、蛍光を検出できなかったようにマウス臓器の画像定量のために蛍光ナノビーズの共注入を用いた4。コンパニオン診断薬の欠点は、追跡可能な成分が、個々の薬物動態プロファイルに応じて液滴から独立して作用し得る。
幸いなことに、マイクロバブルと液滴のシェルをカスタマイズすることができます。例えば、Huynhらは、ポルフィリン-脂質シェルを有する超音波造影剤を実証し、マルチモーダルマイクロバブル14を作成した。ポルフィリンは、芳香族マクロキリック体構造14,15を有する有機化合物のクラスである。それらは、光学的に吸収性、蛍光性、および放射線治療、放射性核種ベースのイメージング、または微量金属ベース定量14のための多種多様な金属にキレートすることができる。ポルフィリンの一例は、ピロフェオフォビド(パイロ)である。ピロを脂質に結合させることにより、マイクロバブルまたは液滴にパイロ脂質を組み込むことで、音響的、蛍光的、および吸光度14を介して複数のモダリティを介して画像化および追跡を行うことができます。このマルチモーダル造影剤は、蓄積を追跡し、定量化するために使用することができる。これにより、定量可能なコンポーネントがシェルに結合され、より正確な配信定量化が可能になるため、コンパニオン診断エージェントの必要性がなくなる可能性があります。
本明細書において、マルチモーダル位相変化ポルフィリン液滴を作成するためのプロトコルが概説される。超音波造影剤は、腫瘍2、4などの目的の組織への薬物送達のためのプラットフォームとして使用することができるように、超音波を超えてそれらの検出可能性を拡張することは、送達効果の定量化に有用であることが証明できる。これらの液滴の目的は、生体内で受動的蓄積が可能な追跡可能な超音波造影剤を提供すること、その機動気化および音響において、そして二次センサーに依存することなく、生体分布またはex vivo器官からの蓄積を定量化する可能性を有する。また、バイオディストリビューションセンサーとしてのポルフィリン滴の可能性を示す特性評価方法も概説されています。また、殻中のパイロ-脂質負荷の影響(モル比で0%~50%)も議論されている。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-[メトキシ(ポリエチレングリコール)-5000](アンモニウム塩)</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>880220</td><td>別名「DSPE-PEG5K」</td></tr><tr><td>1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td><td>アバンティ極性脂質</td><td>855775</td>「<td>DSPC」としても知られ</td></tr>る<tr><td>アルミホイル</td><td>任意のブランドの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アルミニウムシール、引き裂く</td><td>VWR</td><td>16171-840</td><td>標準アルミニウム、外径13 mm</td></tr><tr><td>バスソニケーター任意の</td><td>ブランド</td><td></td>は、最大<td>70°Cの超音波処理と加熱が可能です。C、</td></tr><tr><td>Bio-Storスクリューキャップバイアル国立</td><td>科学</td><td>BS20NABP</td><td>プラスチック、2 mLスカート、Oリングホ</td></tr><tr><td>ウケイ酸ガラス透明血清バイアル</td><td>VWR</td><td>16171-285</td><td>3 mL、7 mm内口径、13 mm外口</td></tr>径ホ<tr><td>ウケイ酸ガラスサンプルバイアル、フェノールスクリューキャップ付き</td><td>VWR</td><td>66011-020</td><td>1.85 mL、ショートフォームスタイル、外径12 mm、高さ35 mm、8-425キャップサイズ</td></tr><tr><td>ねじ込み式キャップ付きホウケイ酸ガラスバイアル</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>サイズは希望の容量によって異なります</td></tr><tr><td>クロロホルム&nbsp;</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コールターカウンター Elctrolyte希釈液</td> 任意の<td>ブランド</td><td></td><td>コールターカウンター</td></tr><tr><td>と互換性があります デカフルオロブタン(C4F10)</td><td>フルオロメッド</td><td>355-25-9</td><td></td></tr><tr><td>脱イオン水</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ドライアイス(二酸化炭素)</td> <td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>動的光散乱(DLS)粒子分析装置</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>温度制御</td></tr><tr><td>が可能 E-Zクリンパー、13mm</td>ウィ<td>ートンW225302</td><td></td><td>13mm標準アルミシール</td></tr><tr><td>E-Zデキャッパー、13mm</td>ウィ<td>ートン</td><td>W225352</td><td>13mm標準アルミシール</td></tr><tr><td>蛍光分光光度計</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>400〜600回の励起と300〜800nmの発光検出が可能で、レーザー光源</td></tr><tr><td>に垂直な検出器蛍光分光光度計対応キュベット</td><td>どのブランド</td><td></td>でも<td>少なくとも2mLを保持することができ、300〜800nmの能力があり、4つの側面すべてが&nbsp;光学窓&nbsp;</td></tr><tr><td>社内</td><td></td>製<td>ガス交換器</td><td>組み立て手順については、補足情報-「その他のプロトコルとデータ」を参照してください。</td></tr><tr><td>ガラスシリンジ</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>サイズは希望の容量によって異なります</td></tr><tr><td>GLWRカスタムアパーチャチューブ 10 um</td><td>ベックマンコール</td><td>ターB42812</td><td>10 & マイクロ;m開口部、ベックマン・コールターマルチサイザー4e</td></tr><tr><td>と互換性あり グリセロール</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蓋付き断熱スティロファオム容器</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>凍結乾燥スタイル ラバーストッパー</td><td>VWR</td><td>71000-060</td><td>内口径7mm、外口径13mm、2本脚、クロロブチル</td></tr><tr><td>膜ダイアフラム真空ポンプ</td><td>ザルトリウス・ステディム</td><td>16694-1-60-06</td><td>調整可能な圧力</td></tr><tr><td>メタルトング</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MS250 21 MHz リニアアレイ超音波トランスデューサ</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>21 MHz、Bモードおよびノンリニアイメージングが可能です。</td></tr><tr><td>MultiSizer 4e</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>0.2&microからのサイジングが可能。mから6&マイクロ;m</td></tr><tr><td>Nalgene Rapid-Flow 滅菌単回使用真空フィルターユニット</td><td>Thermo Scientific</td><td>567-0010</td><td>ポリエーテルスルホン (PES) メンブレン、0.1&mu;m細孔サイズ、1000mL容量。アイソトンIIは非滅菌であるため、フィルターユニットを複数回使用できます</td></tr><tr><td>ニードル、従来の</td><td>BD</td><td>305176</td><td>20ゲージ、長さ1.5インチ</td></tr><tr><td>窒素ガス</td><td>どのブランド</td><td></td>でも、<td>流れを指示するためのレギュレーターバルブとチューブがあることを確認してください。セットアップは、ブランドとソースによって異なります。</td></tr><tr><td>パラフィルム</td><td>プロトコルでは「ワックスフィルム」と呼ばれる</td><td>任意のブランド</td><td></td>。</tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td> <td>任意のブランド</td><td></td><td>1X、7.4 pH</td></tr>ピ<tr><td>ペット</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>サイズ サイズは希望の容量によって異なります</td></tr><tr><td>ピペットのヒント</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>サイズは希望の容量によって異なります</td></tr><tr><td>プラスチックシリンジ</td> 任意の<td>ブランド</td><td></td><td>1 mL、3 mL、30 mL。ルアーロック接続付き</td></tr><tr><td>ポリエーテルスルホン(PES)メンブレンフィルター</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>0.2 &micro;m細孔サイズ</td></tr><tr><td>プロピレングリコール</td><td>任意のブランドの</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピロフェオホルビドが抱合した1-ステアロイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン</td><td>社内</td><td></td>製 <td>「パイロSPC」としても知られています。合成については、「補足情報 - その他のプロトコルとデータ」を参照してください。</td></tr><tr><td>温度計</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>(-20〜100°C;C)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td> 「<td>2-[4-（2,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール」としても知られ</td>る<td>任意のブランド</td><td></td></tr>、<tr><td>超純水</td>、<td>任意のブランド</td><td></td><td>、タイプ1純度</td></tr><tr><td>、紫外線&ndash;可視(UV-Vis)分光光度計</td> 任意の<td>ブランド</td><td></td><td>300〜800nmの吸光度、少なくとも0.5nmの分解能</td></tr><tr><td>紫外線&ndash;可視(UV-Vis)分光光度計 互換性のあるキュベット、1 cmの経路長</td><td>任意のブランド</td><td></td><td>少なくとも2 mLを保持することができ、300 〜 800 nmの</td></tr><tr><td>可能な真空デシケーター</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 超音波イメージングプラットフォーム</td><td>VisualSonics</td><td></td><td>前臨床超音波イメージングシステム</td></tr><tr><td>Vialmix</td><td>ブリストル・マイヤーズ・スクイブ</td><td></td><td>プロトコールでは「機械的攪拌機」と呼ばれています。45秒間攪拌します。</td></tr><tr><td>ボルテックスミキサー</td><td>任意のブランド</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マルチモーダル相変化ポルフィリン滴の合成と特性解析

Synthesis and Characterization of Multi-Modal Phase-Change Porphyrin Droplets

位相変化液滴は、十分な音響エネルギーを適用してその 時に エコー原性マイクロバブルに変換することができる超音波造影剤のクラスである。液滴は、マイクロバブルの対応よりも小さく、より安定しています。しかし、従来の超音波造影剤は音響フィードバック測定を超えて追跡可能ではなく、造影剤の生体分布または蓄積 ex vivo の定量化が困難になる。研究者は、生体分布を推測するために蛍光または光学吸収性コンパニオン診断粒子に依存する必要があります。このプロトコルの目的は、凝縮法を用いてマルチモーダル位相変化ポルフィリン液滴を作成するためのステップを詳述することにある。ポルフィリンは、脂質に結合し、液滴に組み込んで液滴に組み込むことができる明確な吸光度バンドを持つ蛍光分子であり、音響特性を保持しながらより堅牢な生体分布を可能にします。ポルフィリン-脂質および塩基脂質含量の異なる7つの製剤を、マイクロバブルおよび液滴サイズ分布を調べるために作られた。ポルフィリン含有構造に適した特性評価は、その解析的汎用性をインソリューションで実証するプロトコルにも記載されている。サイジングは、凝縮後の平均直径が前駆体集団よりも1.72〜2.38倍小さいことを示した。吸光度特性は、無傷のアセンブリが700nmのQバンドピークを有し、破壊されたサンプルは671nmで吸光度ピークを有したことを示した。蛍光特性評価は、30%のポルフィリン-脂質集合体が蛍光的に消光(>97%)であり、中断時に蛍光回復が達成されたことを示した。音響気化により、ポルフィリン液滴は低圧で非エコー原性であり、十分な圧力でエコー原性マイクロバブルに変換できることが示された。これらの特性評価は、 インビボ またはex vivoでの送達または治療用途のための超音波造影剤の生体分布を定量化するための吸光度または蛍光ベースのコンパニオン診断戦略の必要性を排除するポルフィリン滴滴の可能性を示す。

あらかじめ凝縮されたサイズ選択されたマイクロバブルサンプル(n=3)とポスト凝縮されたドロップレットサンプル(n= 3)を、10 μmの開口部を有するコールターカウンター(CC)でサイズ設定しました。10 μmの絞りの制限は、200 nmより小さい粒子を測定できないことであり、平均サイズと濃度を偏らさせる可能性があります。図4は、パイロ-脂質含有量製剤の各々のサイジングデータを示す。表 1 は、サイズ変更データに基づく統計を示しています。前および縮合後平均直径の比率を用いて、結果は0%パイロ-脂質製剤が0.02±1.72で最小の平均直径シフトを有することを示した。50%のパイロ-脂質製剤は、0.08±2.38で最大の平均直径を持っていました。1%のパイロ-脂質液滴サンプルは、10 10 /mL×1010 /mLで最も高い観測濃度(2.71±0.13)を持ち、40%のパイロ-リドロップレットサンプルは10 9/mL×最も低い(7.36±0.81)で最も低い観察濃度を持っていました。サイジングデータは、10%のパイロ-リピッド液滴サンプルが261±13nmで最小のピークダイメーターを有し、50%のパイロリピッド液滴サンプルが390±55nmで最大であったことを示した。一般的に、パイロ-脂質含量が増加するにつれて、濃度が低下し、平均直径が増加した。凝縮後のサンプルは前駆体マイクロバブルサンプルに基づいているため、両方のタイプの超音波造影剤に対して傾向が生じた。パイロ-脂質含量が増加するにつれて、微小気泡亜集団(ピークサイズは約2000μm)が形成され始めた。この二次ピークは、0%のパイロ-脂質マイクロバブルサンプルには存在せず、40%および50%のパイロ脂質集団において最も明らかであった。
図5は、30%パイロ-脂質液滴サンプルの代表的な吸光度測定を示す。PBSの無傷のサンプルのピークは700nmであったが、トリトンでの破壊されたサンプルはピークを671nmにシフトした。これは、無傷の組立体が、個々の未組立脂質成分と比較して異なる光学特性を有することを示した。
図6A は、予縮されたマイクロバブルサンプルの代表的な蛍光測定を示し、 図6B は30%パイロ脂質を有するポスト凝縮液滴サンプルを示す。PBSの無傷のサンプルは704 nmで蛍光ピークを有し、破壊された形態は674nmでピークを有した。カーブの下の破壊領域を曲線の下の無傷の領域で差を引き、その差を曲線の下の破壊された領域で除算すると、クエンチ効率が得られ、30%のパイロ脂質マイクロバブルサンプルと液滴サンプルでそれぞれ98.61%と98.07%になります。
マイクロバブルに変換する液滴を実証するために、希釈された液滴を、超音波システムを用いた37°Cフローファントムで画像化および気化した。 図7 は、異なる圧力で画像化された30%パイロ-リドロップレットサンプルの代表的な超音波画像を示す。低圧(図7A)では、寒天合成から立ち往生した気泡からのバックグラウンド信号のみ、信号がほとんどなかった。これは、液滴はエコー原性ではなく、超音波を散乱しないためです。わずかに高い電力で、明るい斑点の出現によって示されるように、いくつかのマイクロバブル(図7B)が発生した。圧力が高くなるにつれて、より多くのマイクロバブルが発生した(図7C および 7D)。また、液滴が37°Cで自然気化しないことも実証した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig1v2.jpg"> 図1:30%パイロ-脂質溶液を形成するステップの画像。A)クロロホルムの脂質粉末とパイロ-SPC。 B)溶解ソリューションを追加しました。 C)脂質フィルムを乾燥し、バイアルの内壁にコーティングした。 D)アルミ箔で包まれた脂質バイアル(再利用のためにテーピングされた外装箔)。 E)水和脂質溶液。 F)血清バイアル中の脂質溶液。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig2v2.jpg"> 図2: 10マニホールドガス交換器 プロトコルで参照されているバルブにはラベルが付いている。ガス 交換器を組み立てる方法については、補足ファイル「その他のプロトコルとデータ」を参照してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig03.jpg"> 図3 :A)サンプルバイアル中の7製剤(0%~50%パイロ-SPC)の脂質溶液。図B〜Dは、30%のパイロ-脂質滴を作るために取られたステップの画像を示す。 B)30%のパイロ-脂質溶液をサンプルバイアルに含む。C)攪拌後。D)15分サイズ選択。E)デカフルオロブタンバイアルに転送されたボトムパーティション。D)縮合後。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig04.jpg"> 図4:異なるパイロ-脂質シェル含有量を有するサイズ選択されたマイクロバブルおよびドロップレットサンプルのコールターカウンタ(CC)のサイズデータ(n=3)。 緑色の実線はマイクロバブルを表し、点線のシアン線は液滴を表します。A)0% パイロ-SPC.B)1%パイロ-SPC。C)10% パイロ-SPC.D)20% パイロ-SPC.E)30%パイロ-SPC。F)40%パイロ-SPC。G)50%パイロ-SPC。H)シェル内のパイロ-SPC含有量に基づくCCからのマイクロバブルおよびドロップレットサンプルの総観測濃度。すべての誤差範囲は標準偏差を示します。すべての測定は200 nmから6000 nmのサイズ範囲を有する10 μmの開口を使用して行われた。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig05.jpg"> 図5:PBSおよび1%トリトンで希釈した300~800nmの光熱吸収率測定を、紫外線可視(UV-Vis)分光測定の代表的な測定方法で、1%Tritonで希釈<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig05large.jpg" target="_blank">します。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig06.jpg"> 図6:410nmで励起された600〜750nmの代表的な蛍光放出。A)PBSおよび1%トリトンでサイズ選択、予め凝縮された30%のパイロ-脂質マイクロバブルサンプル。 B)PBSおよび1%トリトンでの30%パイロ-脂質液滴サンプル後凝縮。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62665/62665fig07.jpg"> 図7:Bモードで前臨床21MHzの線形配列トランスデューサで撮影された37°C寒天流ファントムの代表的な超音波画像(材料表を参照)。左の列 (図A、C 、E、および G)は PBS コントロールを示しています。右カラム(図B、D、F、H)は、37°CPBSの50 mLに希釈した20μLの縮合後30%パイロ-リドロップレットサンプルを示しています。 各行は、フリーフィールドピーク負圧を表し、これはSheeranららによって行われた作業から推定された黄色の三角形は焦点深さを示す。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/62665fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>方式</td>
			<td>エージェント</td>
			<td>パイロシェル %</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>10</td>
			<td>20</td>
			<td>30</td>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>泡</td>
			<td>コンク[/mL]</td>
			<td>(2.76 ± 0.28) × 10^10</td>
			<td>(3.04 ± 0.15) × 10^10</td>
			<td>(2.02 ± 0.11) × 10^10</td>
			<td>(1.91 ± 0.22) × 10^10</td>
			<td>(1.47 ± 0.05) × 10^10</td>
			<td>(8.47 ± 0.95) × 10^9</td>
			<td>(9.89 ± 0.15) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>泡</td>
			<td>ピーク [nm]</td>
			<td>329 ± 6</td>
			<td>297 ± 15</td>
			<td>305 ± 21</td>
			<td>273 ± 14</td>
			<td>310 ± 40</td>
			<td>266 ± 33</td>
			<td>393 ± 89</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>泡</td>
			<td>平均 [nm]</td>
			<td>609 ± 2</td>
			<td>603 ± 15</td>
			<td>635 ± 6</td>
			<td>690 ± 8</td>
			<td>812 ± 1</td>
			<td>935 ± 22</td>
			<td>950 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>泡</td>
			<td>中央値 [nm]</td>
			<td>450 ± 6</td>
			<td>421 ± 6</td>
			<td>414 ± 6</td>
			<td>432 ± 5</td>
			<td>490 ± 2</td>
			<td>596 ± 37</td>
			<td>695 ± 41</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>飛沫</td>
			<td>コンク[/mL]</td>
			<td>(2.18 ± 0.07) × 10^10</td>
			<td>(2.71 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.75 ± 0.18) × 10^10</td>
			<td>(1.72 ± 0.13) × 10^10</td>
			<td>(1.09 ± 0.01) × 10^10</td>
			<td>(7.36 ± 0.81) × 10^9</td>
			<td>(7.38 ± 0.28) × 10^9</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>飛沫</td>
			<td>ピーク [nm]</td>
			<td>292 ± 0</td>
			<td>297 ± 17</td>
			<td>261 ± 13</td>
			<td>280 ± 9</td>
			<td>268 ± 17</td>
			<td>287 ± 38</td>
			<td>390 ± 55</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>飛沫</td>
			<td>平均 [nm]</td>
			<td>353 ± 5</td>
			<td>350 ± 5</td>
			<td>347 ± 1</td>
			<td>347 ± 4</td>
			<td>397 ± 1</td>
			<td>399 ± 6</td>
			<td>400 ± 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>CC</td>
			<td>飛沫</td>
			<td>中央値 [nm]</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>318 ± 4</td>
			<td>310 ± 1</td>
			<td>315 ± 2</td>
			<td>340 ± 0</td>
			<td>367 ± 5</td>
			<td>370 ± 9</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:コールターカウンター(CC)とは異なるパイロSPC含有量を有するマイクロバブルおよびドロップレットサンプルのサイジングデータ統計(n= 3)。すべての誤差は標準偏差を示します。
補足情報 - 脂質式シート: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Lipid%20Formula%20Sheet.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足情報 - その他のプロトコルとデータ: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62665/Supplementary%20Information%20-%20Other%20Protocols%20and%20Data.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

本プロトコルでは、マルチモーダル位相変化ポルフィリン滴を合成および特徴付けする方法を概説する。

Phase-change droplets are a class of ultrasound contrast agents that can convert into echogenic microbubbles in situ with the application of sufficient ...

このプロトコルは、脂質膜からマイクロバブルへの脂質溶液への液滴を作成し、次に液滴に液滴を作成するための完全な手順を提供するので、重要です。この技術の主な利点は、マイクロバブルを液滴に凝縮するためのシンプルさです。冷却と旋回だけで、加圧を必要とせずに液滴を作ることができます。マイクロバブルが正常に凝縮されているかどうかを確認する簡単なテストは、半透明の変化を視覚的にチェックすることであるため、視覚的なデモンストレーションが重要です。この手順のデモンストレーションは、ギャング・ジェン研究所の修士課程の学生、キムン・ユーです。デキャッパーを使用して、血清バイアルのアルミニウムシールを取り外し、脂質溶液の1ミリリットルをフェノールスクリューキャップ付きの1.85ミリリットルのホウケイ酸ガラスサンプルバイアルに移し、脂質溶液を気泡を作らずに内壁に流し込みます。1.85ミリリットルのサンプルバイアルを使用すると、ガス交換器を使用してサンプルバイアルヘッドスペースにデカフルオロブタンガスで流れる準備をします。ガス交換器のすべてのバルブが適切に閉じられており、ポンプの電源が切れていることを確認します。マニホールドバルブを開き、マニホールドから対応する針を慎重に外します。圧力バルブAと圧力バルブBを開き、ガスボンベバルブを約1/16~1/8反時計回りに回して部分的に開きます。Tハンドルバルブを開き、脂質溶液でサンプルバイアルをキャップしません。マニホールド針をバイアルの液体エアインターフェースの上に置き、空気調整器ゲージの針が静止位置からわずかに動くまで空気調整バルブを時計回りにゆっくりと回し、パーフルオロカーボンガスを30秒間介機用ヘッドスペースに静かに流し込み、気泡を作らないよう注意します。必要に応じて、エアレギュレータバルブを調整します。30秒後、慎重かつ迅速にバイアルをあまり動かさずにサンプルバイアルを保管しました。ガスボンベバルブ、Tハンドルバルブ、エアレギュレータバルブ、圧力バルブA、圧力バルブB、マニホールドバルブの両方。慎重に針をシースし、サンプルバイアルにラベルを付け、時計回りに行くワックスフィルムで首を密封します。サンプルバイアルは暗闇の中、摂氏4度で少なくとも10分または24時間保存します。別の断熱容器の所定の場所に、約100グラムのドライアイスを断熱容器に入れます。1.5インチ20ゲージ針、1ミリリットルのプラスチック注射器、200ミリリットルの容器、金属トング、および温度計に以前に準備されたデカフルオロブタン血清バイアルを取り出します。サンプルバイアルを脂質溶液と一緒に機械的攪拌機に入れ、攪拌します。色や半透明に変化があるはずです。機械的な攪拌の後、光からシールドされたサンプルバイアル右側を立ち上げ、15分間のカウントダウンを開始してバイアルを冷却し、サイズはマイクロバブルを選択します。カウントダウンが10分に達したら、約200ミリリットルのイソプロパノールで容器を満たし、金属トングを使用してドライアイスでマイナス20度まで冷却します。マイクロバブルのサイズを 15 分間選択した後、サンプルバイアル内で選択したパーティションのサイズを探します。サンプルバイアルの右側を上に保ち、サンプルバイアルを慎重にキャップを外し、1ミリリットルのプラスチックシリンジに取り付けられた1.5インチ20ゲージ針で底の仕切りの約0.7ミリリットルを引き出します。トップパーティションのどれも引き抜かないことを確認し、エアポケットを取り外すために注射器をフリックしないでください。ゴム栓の中央円を目指して、別の20ゲージ針をデカフルオロブタン血清バイアルに挿入し、血清バイアルの上部付近に針を置いてベントし、選択したマイクロバブルのサイズで針を挿入します。選択したマイクロバブルのサイズをゆっくりと転送します。デカフルオロブタン血清バイアルの内壁を静かに滑り落とします。すべてのサイズが選択されたマイクロバブル溶液が移された後、注射器で針を取り除くが、負圧を緩和するために通気針を保つ。イソプロパノール浴に少量のドライアイスまたは室温イソプロパノールを加えて、浴温がマイナス15〜マイナス17°Cの間であることを確認します。20ゲージの通気針をセラムバイアルの上部付近に挿入し、血清バイアルとイソプロパノール浴を置き、マイクロバブルレベルをイソプロパノールのレベル以下に保ちますが、バイアルネックを上にして2分間断続的に旋回してマイクロバブルを凝縮します。イソプロパノールで血清バイアルを連続的に旋回させず、溶液を凍結させないでください。約5秒間旋回し、イソプロパノールから血清バイアルを持ち上げます。氷の核形成を確認し、イソプロパノールで旋回を再開します。氷の形成がある場合は、空気中の血清バイアルを放散するまで旋回する。2分間の結露の後、イソプロパノール浴から血清バイアルを取り除き、通気針を取り除きます。マイクロバブルは、半透明の変化によって示されるように液滴に凝縮しているはずです。血清バイアルを拭き、ラベルを付け、使用できるまで暗い断熱容器の中の通常の氷の上に置きます。無傷のアルミニウムシールを持つ未開封の液滴は、溶けた氷が必要に応じて交換される限り、最大6時間安定する必要があります。使用する準備ができたら、デキャッパーでアルミニウムシールを取り外します。このプロトコルを使用した後、あらかじめ凝縮されたサイズは、選択されたマイクロバブルおよびポスト凝縮された液滴を、10ミクロンの開口を有するコールターカウンター上でサイズ設定した。30%のパイロ-脂質製剤のサイジングデータが示されている。サイジングデータに基づく統計を以下に示します。前と後凝縮平均直径の比率を使用して、結果は、火光脂質含量が増加するにつれて、濃度が低下し、平均直径が増加することを示した。代表吸収剤は、30%のパイロ-脂質液滴試料の測定が示されている。これは、無傷のアセンブリが個々の未組み立て脂質成分と比較して異なるピークによって反射される異なる光学特性を有することを示した。前凝縮されたマイクロバブルの代表的な蛍光測定は、30%のパイロ脂質を有する縮合後液滴サンプルをここに示し、破壊された形態の無傷のサンプルに対して異なる蛍光ピークを示す。異なる圧力で画像化された30%の熱量脂質液滴サンプルの代表的な超音波画像が示されている。低圧では、寒天合成から貼り付けた気泡からの背景信号のみが観察された。わずかに高い電力で、いくつかのマイクロバブルが生成され、これは明るい斑点の出現によって示される。圧力が高まるにつれて、より多くのマイクロバブルが発生した。ここでの凝縮温度は、この特定の液滴シェル製剤に最適化されていることを覚えておくことが重要です。異なるシェル製剤は、異なる温度を必要としてもよい。

synthesis-characterization-multi-modal-phase-change-porphyrin

Research

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学ぼう、マルチモーダル相変化ポルフィリン滴の合成と特性解析の手法を。冷却と撹拌のみで微細気泡を滴に凝縮し、透明性の変化で形成を確認する簡便なプロトコルを解説します。

マルチモーダル相変化ポルフィリン滴の合成と特性解析

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