Name: 初代および不死化ヒト角膜上皮細胞に対するUV放射および化学物質の毒性の決定 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 学ぶ 初代および不死化ヒト角膜上皮細胞を用いたUV放射と化学物質の毒性評価法。マルチプレックスサイトカインアッセイと代謝アッセイにより、眼用製品の安全性を動物実験を最小限に評価する手法を確立する。

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著者らはこの研究のための資金を受け取らなかった。

1. pHCECおよびiHCECの培養
<ol><li>6 mM L-グルタミン、0.002%細胞培地サプリメントO(材料表)、1.0 μMエピネフリン、0.4%細胞培地サプリメントP(材料表)、5 μg/mL rhインスリン、5 μg/mLアポトランスフェリン、および100 ng/mLヒドロコルチゾンヘミコハク酸塩をコラーゲン-1コーティング培養フラスコ(75 cm2培養フラスコに18 mL)で増殖させます。</li>
	<li>細胞が~80%のコンフルエントに成長した後に培地を除去して、2〜3日ごとにフラスコ内の培地を交換します。フェノールレッドを含まない解離溶液を加え、細胞が完全に剥離するまでフラスコを37°Cでインキュベートします。DMEM/F12で解離液を血清で中和し、細胞を500 × gで遠心分離します。上清培地を取り出し、細胞をHOEM培地に再懸濁します。</li>
</ol>2. 共焦点顕微鏡による細胞サイズの決定
<ol><li>pHCECとiHCECの両方を、1 mLのHOUEMを含む1 × 105 の濃度のガラス底カバーガラスでコラーゲンコーティングされたペトリ皿に播種します。pHCECおよびiHCECを、1セットの培養液を24時間、別の培養セットを48時間、5%CO2を含む37°Cのインキュベーターで増殖させます。</li>
	<li>インキュベーション期間の後、カルセイン(4 μM)、エチジウムホモ二量体-1(8 μM)、およびアネキシンV(500 μLバッファー-Alexa Fluor 647コンジュゲート溶液中の5 μL)を含む500 μLのアネキシン染色バッファー溶液で細胞を37°Cで20分間染色します。 細胞を染色した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を用いて、カルセイン-AMの場合は488/515 nm、エチジウムホモ二量体-1の場合は543/600 nm、アネキシンVの場合は633/665 nmの励起/発光波長をキャプチャするように顕微鏡を調整します。</li>
	<li>画像を取得し、Zスタックを取得して、3次元でセルサイズを評価します。<ol><li>2次元(2D)および3次元(3D)画像を取得するには、アポクロマート40x/1.2水対物レンズで画像化する領域を見つけます。アルゴン(488)(最初のスキャン)、HeNe1(543)(2番目のスキャン)、およびHeNe2(633)(3番目のスキャン)レーザーでは、ビームスプリッター、HFT 488/543/633、NFT 635 Vis、およびNFT 545 LP560、LP505を使用して3つの別々のチャネルでスキャンします。</li>
		<li>マルチトラックシーケンシャルスキャンを使用して、クロストークを減らします。 注:LP505は、カルセイン色素の発光をキャプチャするために、488レーザーを備えたチャネル2に使用されます。LP560は、エチジウムホモダイマー1の発光をキャプチャするために、543レーザーを備えたチャネル3で使用されます。NFT 635は、アネキシンVの発光をキャプチャするために633レーザーとともに使用されます。HFTの目的は、励起光と発光光を分離することです。NFTは、指定された波長<光を別のチャネルに反射させ、指定された波長>光を2番目のチャネルに通すことで光を分割します。LPフィルターは、指定された波長よりも短い波長を遮断し、長い波長を通過させます。</li>
		<li>3Dで画像化するには、共焦点をZスタックに設定し、少なくとも20フレームをスキャンします。</li>
	</ol></li>
</ol>3.紫外線への細胞の曝露
<ol><li>細胞を24ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに5×104/mLのHEMOMで播種し、5%CO2で37°Cで3時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、ウェル内の培地の容量を300 μLに減らします。次に、細胞をUV照射(UVAチューブとUVBチューブの両方がインキュベーター内で同時にオンになっているため、6.48 W / m 2のUVAと1.82 W / m2のUVB)に37°Cのインキュベーターで5分間と20分間別々の実験でさらします。</li>
	<li>UV照射後、200 μLの新鮮なHEMOMを各ウェルに加え、5%CO2を用いて37°Cで20時間インキュベートします。</li>
	<li>インキュベーション後、各ウェルに細胞上清を集め、滅菌済みの2 mLポリプロピレンチューブに移します。-80°Cで凍結する。 UV曝露後にpHCECおよびiHCECによって放出されるサイトカインレベルを決定するには、マルチプレックスサイトカインアッセイを使用し、キットの指示に従って、IL-6、IL-8、IL-1β、およびTNF-αの4つのサイトカインを定量します。</li>
	<li>代謝アッセイ試薬をウェル内の細胞に追加します。</li>
	<li>DMEM/F12で10%代謝アッセイ試薬を調製します。各ウェルの培養液を1 mLの10%代謝アッセイ溶液で交換し、5%CO2 と共に37°Cで4時間インキュベートします。</li>
	<li>蛍光プレートリーダーを使用して、530/590 nmの励起/発光波長で各溶液の蛍光を測定します。</li>
</ol>4.化学毒素への細胞の曝露
<ol><li>24ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに5×104/mLのHEMOMで細胞をシードし、5%CO2を用いて37°Cで3時間インキュベートします。インキュベーション期間後、培地を取り出し、細胞を1 mLの化学毒素(BAK 0.001%、H 2 O20.01%、およびリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中のSDS 0.0025%)に5〜15分間さらします。</li>
	<li>化学毒素にさらされた後、ウェルから毒素を取り除き、1 mLのPBSですすぎ、各ウェルに1 mLのHOUMを追加します。20時間のインキュベーション後、培地を1mLの10%代謝アッセイ溶液で交換し、5%CO2 と共に37°Cで4時間インキュベートすることにより、代謝アッセイを行う。蛍光マルチウェルプレートリーダーを使用して、530/590 nmの励起/発光波長で蛍光を測定します。</li>
	<li>20時間のインキュベーション後のウェルから細胞上清を別々の滅菌2 mLポリプロピレンチューブに移し、-80°Cで凍結します。 化学物質への曝露後にpHCECおよびiHCECによって放出されるサイトカインを定量化します。UV処理された細胞からのサイトカインを評価するために使用したのと同じマルチプレックスプラットフォームを使用してください。キットの指示に従ってマルチプレックスサイトカインアッセイを使用して、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-αの4つのサイトカインを定量します。</li>
</ol>5.さまざまな濃度のBAKに曝露された細胞の検査
<ol><li>24ウェルコラーゲン-1コーティング培養プレートの各ウェルに1×105/mLのHEMOMで細胞をシードし、5%CO2 を含む37°Cで24時間インキュベートします。インキュベーション期間の後、培地を除去し、細胞を1 mLの化学毒素(BAK 0.001%、BAK 0.005%、およびPBS中のBAK 0.01%)に5分間さらします。</li>
	<li>曝露後、化学毒素を除去し、1 mLのPBSでウェルをすすぎ、各ウェルに1 mLのHEMOを追加します。20時間のインキュベーション後、カルセイン(4 μM)、エチジウムホモ二量体-1(8 μM)、およびアネキシンV(500 μLバッファー-Alexa Fluor 647コンジュゲート溶液中の5 μL)を含む500 μLのアネキシン染色バッファー溶液で細胞を37°Cで20分間染色します。 顕微鏡を調整して、アネキシンV、カルセインAM、およびエチジウム-1染色の強度を、それぞれ630/675 nm、495/515 nm、および528/617 nmの励起/発光波長で測定します。蛍光顕微鏡を使用した細胞のイメージング</li>
</ol>6.データ分析
<ol><li>分散分析(ANOVA)、ウェルチ分散分析、またはクラスカル-ウォリス検定を実行する前に、正規性検定と等分散の検定を実行します。テストされた各グループを比較するために、適切な 事後 テストを使用します。p < 0.05 に設定します。</li>
</ol>

<ol><li>McCanna, D. J., Harrington, K. L., Driot, J. Y., Ward, K. W., Tchao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+human+corneal+epithelial+cell+line+for+screening+the+safety+of+contact+lens+care+solutions+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%26+Contact+Lens%22%5BJournal%5D)">Use of a human corneal epithelial cell line for screening the safety of contact lens care solutions in vitro.</a> Eye & Contact Lens. 34 (1), 6-12 (2008).</li>
<li>Xu, M., Sivak, J. G., McCanna, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+ophthalmic+solutions+on+human+corneal+epithelial+cells+using+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of ophthalmic solutions on human corneal epithelial cells using fluorescent dyes.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 29 (9), 794-802 (2013).</li>
<li>Youn, H. Y., McCanna, D. J., Sivak, J. G., Jones, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+ultraviolet-induced+damage+in+human+corneal%2C+lens%2C+and+retinal+pigment+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">In vitro ultraviolet-induced damage in human corneal, lens, and retinal pigment epithelial cells.</a> Molecular Vision. 17, 237-246 (2011).</li>
<li>Hakkarainen, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+cytotoxic+effects+of+marketed+ophthalmic+formulations+on+human+corneal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Acute cytotoxic effects of marketed ophthalmic formulations on human corneal epithelial cells.</a> International Journal of Pharmaceutics. 511 (1), 73-78 (2016).</li>
<li>Spurr, S. J., Gipson, I. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+corneal+epithelium+with+Dispase+II+or+EDTA.+Effects+on+the+basement+membrane+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Isolation of corneal epithelium with Dispase II or EDTA. Effects on the basement membrane zone.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 26 (6), 818-827 (1985).</li>
<li>Kahn, C. R., Young, E., Lee, I. H., Rhim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+corneal+epithelial+primary+cultures+and+cell+lines+with+extended+life+span%3A+in+vitro+model+for+ocular+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Human corneal epithelial primary cultures and cell lines with extended life span: in vitro model for ocular studies.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 34 (12), 3429-3441 (1993).</li>
<li>Araki-Sasaki, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+SV40-immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+its+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).</li>
<li>Griffith, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+human+corneal+equivalents+constructed+from+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional human corneal equivalents constructed from cell lines.</a> Science. 286 (5447), 2169-2172 (1999).</li>
<li>Toouli, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+mammary+epithelial+cells+immortalized+by+simian+virus+40+T-Antigen+or+by+the+telomerase+catalytic+subunit%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of human mammary epithelial cells immortalized by simian virus 40 T-Antigen or by the telomerase catalytic subunit.</a> Oncogene. 21 (1), 128-139 (2002).</li>
<li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines%3A+Valuable+tools+or+useless+artifacts%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li>
<li>Zorn-Kruppa, M., Tykhonova, S., Belge, G., Diehl, H. A., Engelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+corneal+cell+cultures+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Altex%22%5BJournal%5D)">Comparison of human corneal cell cultures in cytotoxicity testing.</a> Altex. 21 (3), 129-134 (2004).</li>
<li>Huhtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+an+immortalized+human+corneal+epithelial+cell+line+and+rabbit+corneal+epithelial+cell+culture+in+cytotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Comparison of an immortalized human corneal epithelial cell line and rabbit corneal epithelial cell culture in cytotoxicity testing.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 18 (2), 163-175 (2002).</li>
<li>Pisella, P. J., Fillacier, K., Elena, P. P., Debbasch, C., Baudouin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+preserved+and+unpreserved+formulations+of+timolol+on+the+ocular+surface+of+albino+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of preserved and unpreserved formulations of timolol on the ocular surface of albino rabbits.</a> Ophthalmic Research. 32 (1), 3-8 (2000).</li>
<li>Youn, H. Y., Moran, K. L., Oriowo, O. M., Bols, N. C., Sivak, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surfactant+and+UV-B-induced+damage+of+the+cultured+bovine+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+vitro%22%5BJournal%5D)">Surfactant and UV-B-induced damage of the cultured bovine lens.</a> Toxicology in vitro. 18 (6), 841-852 (2004).</li>
<li>Hughes, R., Kilvington, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+hydrogen+peroxide+contact+lens+disinfection+systems+and+solutions+against+Acanthamoeba+polyphaga%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Comparison of hydrogen peroxide contact lens disinfection systems and solutions against Acanthamoeba polyphaga.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (7), 2038-2043 (2001).</li>
<li>Delic, N. C., Lyons, J. G., Di Girolamo, N., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Damaging+effects+of+ultraviolet+radiation+on+the+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemistry+and+Photobiology%22%5BJournal%5D)">Damaging effects of ultraviolet radiation on the cornea.</a> Photochemistry and Photobiology. 93 (4), 920-929 (2017).</li>
<li>Ahuja, D., Saenz-Robles, M. T., Pipas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SV40+large+T+antigen+targets+multiple+cellular+pathways+to+elicit+cellular+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">SV40 large T antigen targets multiple cellular pathways to elicit cellular transformation.</a> Oncogene. 24 (52), 7729-7745 (2005).</li>
<li>Tong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pin1+inhibits+PP2A-mediated+Rb+dephosphorylation+in+regulation+of+cell+cycle+and+S-phase+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Pin1 inhibits PP2A-mediated Rb dephosphorylation in regulation of cell cycle and S-phase DNA damage.</a> Cell Death & Disease. 6, 1640(2015).</li>
<li>Muller, P. A., Vousden, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+mutations+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">p53 mutations in cancer.</a> Nature Cell Biology. 15 (1), 2-8 (2013).</li>
<li>Seshacharyulu, P., Pandey, P., Datta, K., Batra, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatase%3A+PP2A+structural+importance%2C+regulation+and+its+aberrant+expression+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Phosphatase: PP2A structural importance, regulation and its aberrant expression in cancer.</a> Cancer Letters. 335 (1), 9-18 (2013).</li>
<li>Yang, D., Okamura, H., Morimoto, H., Teramachi, J., Haneji, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+Calpha+regulates+proliferation%2C+migration%2C+and+metastasis+of+osteosarcoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+nvestigation%3B+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A Calpha regulates proliferation, migration, and metastasis of osteosarcoma cells.</a> Laboratory nvestigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 96 (10), 1050-1062 (2016).</li>
<li>Xie, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+and+inactivation+of+the+PP2A+complex+promotes+the+proliferation+and+angiogenesis+of+hemangioma+endothelial+cells+through+activating+AKT+and+ERK%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Disruption and inactivation of the PP2A complex promotes the proliferation and angiogenesis of hemangioma endothelial cells through activating AKT and ERK.</a> Oncotarget. 6 (28), 25660-25676 (2015).</li>
<li>Mallet, J. D., Rochette, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-dependent+ultraviolet+induction+of+cyclobutane+pyrimidine+dimers+in+the+human+cornea%5BTitle%5D)+AND+%22Photochemical+%26+Photobiological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Wavelength-dependent ultraviolet induction of cyclobutane pyrimidine dimers in the human cornea.</a> Photochemical & Photobiological Sciences. 12 (8), 1310-1318 (2013).</li>
<li>Cejkova, J., Cejka, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+oxidative+stress+in+corneal+diseases+and+injuries%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">The role of oxidative stress in corneal diseases and injuries.</a> Histology and Histopathology. 30 (8), 893-900 (2015).</li>
<li>Wang, S. Q., Balagula, Y., Osterwalder, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoprotection%3A+a+review+of+the+current+and+future+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatologic+Therapy%22%5BJournal%5D)">Photoprotection: a review of the current and future technologies.</a> Dermatologic Therapy. 23 (1), 31-47 (2010).</li>
<li>Svobodova, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage+after+acute+exposure+of+mice+skin+to+physiological+doses+of+UVB+and+UVA+light%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Dermatological+Research%22%5BJournal%5D)">DNA damage after acute exposure of mice skin to physiological doses of UVB and UVA light.</a> Archives of Dermatological Research. 304 (5), 407-412 (2012).</li>
<li>Kennedy, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultraviolet+irradiation+induces+the+production+of+multiple+cytokines+by+human+corneal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Ultraviolet irradiation induces the production of multiple cytokines by human corneal cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 38 (12), 2483-2491 (1997).</li>
<li>Kode, A., Yang, S. R., Rahman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+effects+of+cigarette+smoke+on+oxidative+stress+and+proinflammatory+cytokine+release+in+primary+human+airway+epithelial+cells+and+in+a+variety+of+transformed+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Differential effects of cigarette smoke on oxidative stress and proinflammatory cytokine release in primary human airway epithelial cells and in a variety of transformed alveolar epithelial cells.</a> Respiratory Research. 7, 132(2006).</li>
<li>Epstein, S. P., Chen, D., Asbell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+biomarkers+of+inflammation+in+response+to+benzalkonium+chloride+on+corneal+and+conjunctival+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Ocular+Pharmacology+and+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of biomarkers of inflammation in response to benzalkonium chloride on corneal and conjunctival epithelial cells.</a> Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 25 (5), 415-424 (2009).</li>
</ol>

著者のリンドン・W・ジョーンズは、過去3年間、COREを通じて、アルコン、アラガン、アライド・イノベーションズ、オーリニア・ファーマ、BHVI、クーパービジョン、GL Chemtec、i-Med Pharma、J&J Vision、Lubris、Menicon、Nature's Way、Novartis、Ophtecs、Ote Pharma、PS Therapy、Santen、Shire、SightGlass SightSage、Visioneeringから研究支援または講演謝礼を受けています。Lyndon Jonesは、Alcon、CooperVision、J&J Vision、Novartis、Ophtecsのコンサルタントおよび/または諮問委員会の委員でもあります。他の著者は開示するものは何もありません。

2種類のHCECの使用における潜在的な違いが評価された。細胞を同じ濃度の細胞で同じ培地(HOEM)に入れ、短期間および長期間の紫外線と3つの眼毒素に曝露しました。UV放射と化学物質の線量は、比較できる中間応答を生成するのに十分な損傷を細胞に及ぼす生理学的効果に基づいて選択されました。UV放射で5分と20分、選択した線量のBAK(0.001%)、SDS(0.0025%)、およびH2O2(0.01%)の5分と15分のばく露時間は、細胞と未処理の対照の間で有意に異なる応答を示した理想的なばく露時間と濃度でした。
HOEMは、HCECの培養に最適化された無血清培地です。HOEMは、初代細胞と不死化細胞の両方の増殖をサポートします。この調査で使用した不死化細胞株は、SV408を用いて不死化した。SV40不死化細胞は、Rb、p53、およびpp2aを妨害することによって細胞周期の進行を促進することができる癌遺伝子タンパク質を発現する17。網膜芽細胞腫(Rb)...

in vitro毒物学研究は、細胞に損傷を与える可能性のある化学物質やその他の薬剤の毒性作用を予測するために行われます。角膜に対する毒性の評価において、ヒト角膜上皮細胞(HCEC)は、これらの効果を評価するためのモデルにおいて使用されている1、2、3、4。これらのモデルは通常、細胞の代謝活性の変化、細胞増殖、および炎症性サイトカインの産生および放出などの他の細胞機能などの生理学的効果を評価します。これらの毒物学研究では、HCECに対する化学物質とUV放射の有害な影響を評価するために、さまざまなソースからの細胞が選択されています2,3。pHCEC株は、成人のドナー組織からこれらの細胞を提供する企業から入手可能です。初代細胞はディスパーゼで処理し、培養のために角膜を穏やかに掻き取ることができます5。次に、細胞はウイルスと汚染についてテストされ、10%ジメチルスルホキシドで凍結保存された状態で出荷されます。
初代細胞株の利点は、細胞がドナーの細胞と遺伝的に同一であることです。in vitro モデルは in vivo 組織を可能な限り模倣する必要があるため、これは理想的です。初代細胞株の欠点は、細胞分裂または継代の数が限られていることです6。利用可能な細胞数が限られているため、1回の初代培養で実施できる実験の数が制限され、実験のコストが増加します。
不死化細胞株は、細胞培養毒性モデルでも使用されています。しかし、in vivo組織から得られた初代細胞株とは異なり、不死化細胞株は遺伝的に改変されています。不死化細胞は、初代細胞のDNAにウイルスの遺伝子を組み込むことによって作成されます6,7,8。ウイルス遺伝子の取り込みに成功した細胞が不死化細胞株に選択されます。不死化の利点は、無期限の急速な増殖を可能にし、同じ細胞株を使用して複数の実験を実行するための無制限の数の細胞を提供することです。これにより、実験間の一貫性が確保され、コストが削減されます。
細胞増殖を制限する遺伝子の変化に加えて、重要な機能の遺伝子の発現の変化も起こり得る9。したがって、不死化細胞を使用することの欠点は、それらが様々な外部刺激に対するそれらの応答に関して、もはや元の インビボ 細胞を表していない可能性があることである10。比較には、初代および不死化ヒト角膜角膜細胞11、ならびに不死化HCECおよびウサギ角膜上皮初代細胞12に対する化学物質の毒性効果の観察が含まれていました。初代ヒト角化細胞と不死化角化細胞に対する毒素の影響の比較では、有意差は示されませんでした11。この記事で詳述されている方法を使用して、これらのアッセイの有効性を評価する pHCECおよびiHCECに対する紫外線および眼毒素の毒性が決定されます。
インビトロアッセイで一般的に使用される3つの眼毒素、BAK、H2O2、およびSDSが選択されました。BAKは点眼液13、14に一般的に使用されるカチオン性防腐剤であり、H2O2はコンタクトレンズ15の消毒に一般的に使用され、SDSは洗剤およびシャンプー14に見られるアニオン性界面活性剤である。眼の毒素と同様に、紫外線もHCECに重大な損傷を引き起こす可能性があります3。さらに、UVへの過度の曝露は、涙の症状、光過敏症、およびざらざら感を特徴とする光角膜炎として知られる眼の状態を引き起こす可能性があります16。
使用できる初代細胞培養物は無制限であり、開発されたさまざまな不死化細胞株があります。したがって、これらのタイプの細胞を組み込んだモデル間の類似点と相違点を決定するために、初代HCECを不死化HCEC株と比較するための調査が行われました。
この研究では、顕微鏡を使用して、UVおよび毒素に対する細胞の生理学的応答に関するpHCECとiHCECの違いの可能性を評価しました。2つの細胞株の細胞代謝活性と炎症性サイトカイン放出に対するUV放射と化学物質の影響も評価されました。2つの細胞株の違いを決定することの重要性は、1)細胞に対するUV放射の影響、2)細胞に対する毒素の影響、および3)将来の研究のために結果として生じる代謝、細胞生存率、および細胞サイトカイン放出の変化を評価するためのこれらの細胞株の最適な使用を理解することです。

<table><tbody><tr><td>75 cm2 ベント式フラスコ</td><td>コーニング</td><td>354485</td><td>これはBioCoatブランドで、コラーゲンコーティング</td></tr>された<tr><td>96ウェルプレート</td><td>共演者</td><td>3370</td><td></td></tr><tr><td>alamarBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>dal 1025</td><td></td></tr><tr><td>Annexin Staining buffer solution</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Annexin V</td><td>Invitrogen, Burlington, ON,カナダ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiovert 100顕微鏡、ツァイス共焦点レーザー走査型顕微鏡 510システム</td><td>カールツァイス社、ドイツ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コーニング 48ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>354505</td><td>これはBioCoatブランドで、コラーゲンコーティング</td></tr><tr><td>Cytation 5</td><td>BioTek</td><td>CYT5MPV</td><td>280〜700nmの蛍光を読み取ることができます(アッセイ540/590用)</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ヒコーン</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底カバースリップ</td><td>MatTek Corporation、マサチューセッツ州アッシュランド、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>オ</td><td>タワ大学</td><td>N / A</td><td>SV40-不死化ヒト角膜上皮細胞 M.グリフィス博士(オタワ眼科研究所、オタワ、カナダ)から、グリフィスM、オズボーンR、マンガーR、シオンX、ドイヨンCJ、レイコックNL、ハキムM、ソンY、ワツキーMAを特徴付けています。細胞株から構築された機能的なヒト角膜同等物。科学。1999;286:2169-72。</td></tr><tr><td>ヒト眼上皮培地(HOEM)と次のサプリメント:</td><td>Millipore、Billerica、MA、USA</td><td>SCMC001</td><td>Epigroベース培地に6 mM L-Glutamine、0.002% EpiFactor O(記事中の細胞培地サプリメントO)、1.0 &mu;M エピネフリン、0.4% EpiFactor P (記事中の細胞培地サプリメント P)、5 &mu;g/mL rh インスリン、5 &mu;コラーゲン-1コーティング培養フラスコ中のg / mLアポトランスフェリン、および100 ng / mLヒドロコルチゾンヘミスコハク酸(BioCoat、コーニング、テュークスベリー、マサチューセッツ州、米国)。</td></tr><tr><td>Live Dead calcien and ethidium homodimer</td><td>Invitrogen, Burlington, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesoScale Discovery (MSD) QuickPlex SQ 120 instrument</td><td>Rockville, MD, USA MSD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Human Proinflammatory Panel II (4-Plex) V-Plex assay</td><td>Rockville, MD, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td>100x concentration so add 1 mL to each 99 mL of media</td>.</tr><tr><td>Primary Corneal Epithelial Cells</td><td>Millipore, Billerica, MA, USA</td><td>SCCE016</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 蛍光マルチウェルプレートリーダー</td><td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (細胞解離溶液)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12605036</td><td></td></tr></tbody></table>

初代および不死化ヒト角膜上皮細胞に対するuv放射および化学物質の毒性の決定

Determining the Toxicity of UV Radiation and Chemicals on Primary and Immortalized Human Corneal Epithelial Cells

この記事では、初代(pHCEC)および不死化(iHCEC)ヒト角膜上皮細胞培養における紫外線(UV)放射線および眼毒素の毒性を測定する方法について説明します。細胞は、紫外線および毒性用量の塩化ベンザルコニウム(BAK)、過酸化水素(H 2 O2)、およびドデシル硫酸ナトリウム(SDS)に曝露された。代謝活性は、代謝アッセイを用いて測定した。炎症性サイトカインの放出は、マルチプレックスインターロイキン(IL)-1β、IL-6、IL-8、および腫瘍壊死因子-α(TNF-α)アッセイを用いて測定し、蛍光色素を用いて細胞の生存率を評価した。
細胞代謝活性およびサイトカイン放出に対するUVの有害な影響は、iHCECのUV曝露の5分およびpHCECの20分で発生した。iHCECおよびpHCECの代謝活性の同様のパーセント低下は、BAK、H2O2、またはSDSへの曝露後に発生し、 サイトカイン放出の最も重要な変化はIL-6およびIL-8で発生した。蛍光染色されたiHCECおよびpHCEC BAKばく露細胞の顕微鏡検査では、0.005%BAKばく露で細胞死が示されましたが、エチジウム染色の程度はpHCECよりもiHCECの方が大きかったです。顕微鏡を使用して毒性効果を評価する複数の方法、代謝活性の評価、およびサイトカイン産生を利用して、初代細胞株と不死化細胞株の両方でUV放射と化学毒素の毒性を決定できました。

セルサイズ 一次および不死化HCECは、細胞生存率の3つの異なる段階を反映する3つの蛍光色素で視覚化されました。生細胞は緑色(カルセイン-AM)、死細胞は赤色(エチジウムホモ二量体-1)、アポトーシス細胞は黄色(アネキシンV-蛍光シグナルをよりよく視覚化するためのコンピュータ調整色)です。生細胞は細胞質にエステラーゼを含み、カルセイン-AMをカルセインに変換します。死細胞は、エチジウムホモ二量体-1に対して透過性の細胞膜を有する。アポトーシス細胞は、ホスファチジルセリンが外膜に転座するため、細胞膜で染色されます。
成長の24時間と48時間後の2種類のHCECの細胞サイズの比較は、 図1に示すように、共焦点顕微鏡を使用して行われました。iHCEC(図1A)は10 μmから20 μmの範囲の小さな細胞であり、pHCEC(図1B)は24時間の増殖後に20 μmから50 μ...

この記事では、初代および不死化細胞株でのUV放射および化学毒素の毒性を評価するために使用される手順について説明します。

初代および不死化ヒト角膜上皮細胞に対するUV放射および化学物質の毒性の決定

This article describes the methods of measuring the toxicity of ultraviolet (UV) radiation and ocular toxins on primary (pHCEC) and immortalized (iHCEC) ...

この方法は、新しい眼科用製品製剤の毒性をin vitroで評価するために使用できます。in vitroで眼細胞を使用して化学物質や製品製剤の濃度を精製することにより、新製品の安全性を評価するための動物の使用を最小限に抑えることができます。インビトロアッセイは、ミトコンドリア機能、細胞膜の完全性、酵素活性に対する化学物質の影響を決定するなど、in vivoでは評価できない毒性エンドポイントを評価します。in vitroで細胞毒性を評価することは、毒性の潜在的なメカニズムを理解するための鍵です。これは、眼内の治療用化学物質の最大耐量を確立するために不可欠です。.手順を実演するのは、ジョーンズ研究所の研究者であるニジャニ・ナガルドクマランです。まず、pHCECとiHCECの両方を、1ミリリットルのヒト眼上皮培地(HOEM)を使用して、1 x 10から5番目の濃度のガラス底カバースリップを備えたコラーゲンコーティングされたペトリ皿に装着します。pHCECとiHCECを1セットの培養物を24時間、別のセットを5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターで48時間培養します。インキュベート後、4マイクロモルのカルセイン、8マイクロモルのエチジウムホモダイマー1、およびアネキシン5を含む500マイクロリットルのアネキシン染色緩衝液で細胞を摂氏37度で20分間染色します。細胞を染色した後、共焦点レーザー走査型顕微鏡を調整して、テキスト原稿に記載されているように、励起波長と発光波長をキャプチャします。原稿の指示に従って、2次元および3次元の画像を取得します。24ウェルコラーゲン1コーティング培養プレートの各ウェルにHEMOM1ミリリットルあたり5 x 10から4番目の細胞を播種し、摂氏37度で5%二酸化炭素で3時間インキュベートします。インキュベーション後、ウェル内の培地の容量を300マイクロリットルに減らします。次に、細胞を6.48ワット/平方メートルのUVA放射と、摂氏1.82度で1平方メートルあたり37ワットのUVB放射に5分間と20分間さらします。UV照射後、200マイクロリットルの新鮮なHEMOを各ウェルに加え、5%二酸化炭素で摂氏37度で20時間インキュベートします。翌日、各ウェルに細胞上清を集め、それを滅菌2ミリリットルのポリプロピレンチューブに移します。上清をマイナス80°Cで凍結します。UV曝露後にpHCECおよびiHCECによって放出されるサイトカインレベルを決定するには、マルチプレックスサイトカインアッセイを使用し、キットの指示に従ってインターロイキン6、インターロイキン8、インターロイキン-1ベータ、およびTNF-αを定量します。DMEMおよびF12で10%代謝アッセイ試薬を調製します。各ウェルの培養液を1ミリリットルの10%代謝アッセイ溶液と交換し、摂氏37度で5%二酸化炭素で4時間インキュベートします。蛍光板リーダーを使用して、530ナノメートルの励起波長と590ナノメートルの発光波長で各溶液の蛍光を測定します。細胞を24ウェルコラーゲン1コーティング培養プレートの各ウェル中のHEMOMの5x10〜4ミリリットルで播種する。摂氏37度で5%の二酸化炭素で3時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を除去し、細胞をPBS中の0.001%塩化ベンザルコニウム、またはBAK、0.01%過酸化水素、および0.0025%ドデシル硫酸ナトリウムを含む1ミリリットルの化学毒素に5および15分間さらします。化学毒素にさらされた後、ウェルから毒素を取り除き、1ミリリットルのPBSですすぎ、各ウェルに1ミリリットルのHOUMを加えます。20時間のインキュベーション後、培地を1ミリリットルの10%メタボリックアッセイ溶液に交換し、摂氏37度で5%二酸化炭素で4時間インキュベートすることにより、メタボリックアッセイを実行します。蛍光板リーダーを用いて、530ナノメートルの励起、および590ナノメートルの発光波長で各溶液の蛍光を測定します。20時間のインキュベーション後のウェルから細胞上清を別々の滅菌2ミリリットルポリプロピレンチューブに移し、摂氏マイナス80度で凍結します。キットの指示に従って、UV処理細胞からのサイトカインを評価するために使用されるのと同じマルチプレックスプラットフォームを使用して、インターロイキン6、インターロイキン8、インターロイキン-1ベータ、およびTNF-アルファを定量します。24ウェルコラーゲン1コーティング培養プレートの各ウェルにHOEM1ミリリットルあたり1 x 10から5番目の細胞を播種し、摂氏37度で5%二酸化炭素で24時間インキュベートします。インキュベーション後、培地を取り出し、細胞をPBS中の0.001%BAK、0.005%BAK、および0.01%BAKを含む1ミリリットルの化学毒素に5分間さらします。暴露後、化学毒素を取り除き、1ミリリットルのPBSでウェルをすすぎ、各ウェルに1ミリリットルのHOEMを加えます。20時間のインキュベーション後、カルセイン、エチジウムホモ二量体、およびアネキシン5を含む500マイクロリットルのアネキシン染色バッファー溶液で細胞を摂氏37度で20分間染色します。顕微鏡を調整して、アネキシン5の場合は630および675ナノメートル、カルセインAMの場合は495および515ナノメートル、エチジウム1染色の場合は528および617ナノメートルの励起波長および発光波長での強度を測定します。次に、蛍光顕微鏡を使用して細胞の画像を取得します。iHCECは10〜20マイクロメートルの範囲の小さな細胞であり、pHCECは24時間の増殖後に20〜50マイクロメートルの範囲にあることがわかりました。サイズ範囲の同様の違いは、48時間の増殖後にiHCECとpHCECで観察されました。非UV曝露細胞と比較して、照射されたpHCECの代謝活性は、曝露の20分で有意に低下した。iHCECの場合、5分と20分の両方で照射された細胞の代謝活性が低下しました。したがって、iHCECよりもpHCECの代謝活性を低下させるのに長い曝露時間を要した。iHCECによるサイトカインの最大放出は、UV曝露の5分時でした。pHCECの最大サイトカイン放出は、UV曝露の20分で発生しました。放出された炎症性サイトカインの総量に関しては、pHCECはiHCECよりも実質的に多くのインターロイキン-1ベータ、インターロイキン8、およびTNF-αを放出しましたが、iHCECはより多くのインターロイキン6を放出しました。pHCECとiHCECの両方が、3つの化学物質すべてに曝露した後のインターロイキン6の放出に変化を示しました。BAKは、一次および不死化HCECの両方の対照と比較して、インターロイキン6の放出の減少を引き起こした。過酸化水素は、iHCECからのインターロイキン6の放出の増加、およびpHCECからの放出の減少を引き起こした。pHCECとiHCECの両方がBAKの0.005%と0.1%で有意な損傷を受けました。眼細胞毒性のin vitro評価を行った後、眼毒性のさらなる動物モデルを実施して、角膜神経または眼免疫系に対する眼産物の効果を決定することができます。これらの技術は、眼に対する化学物質および製品製剤の毒性のメカニズムを決定するために不可欠であり、製品開発試験のための動物の使用を最小限に抑えるのに役立ちます。

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生物学

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